JP4496192B2 - アルカリプロテアーゼ - Google Patents

Description

本発明は高い比活性を有し、洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。

プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化助剤あるいは消炎剤といった医薬品等の多分野で利用されてきた。その中でも最も大量に工業生産され市場規模が大きいのは洗剤用プロテアーゼであり、多くのプロテアーゼが市販されている。
ところが、衣料等の汚れは蛋白質だけでなく、脂質、固体粒子など複数の成分が含まれていることがほとんどであり、かかる実際の複合汚れに対して洗浄力の高い洗浄剤が望まれている。かかる観点から、本発明者は、高濃度の脂肪酸存在下でもカゼイン分解活性を保持し、蛋白だけでなく皮脂等の汚れのある複合汚れ条件下でも優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを見出し、先に特許出願した（特許文献１）。

しかし、さらに優れた特性を有するアルカリプロテアーゼが求められていた。
国際公開第９９／１８２１８号パンフレット

本発明は高い比活性を有し、洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子を提供することに関する。

本発明者らは前記アルカリプロテアーゼの変異による新たな酵素の探索を行ってきたが、従来行なわれているズブチリシンに代表されるセリンプロテアーゼと前記アルカリプロテアーゼとは、酵素学的性質が全く異なり、ズブチリシン等の変異箇所は全く参考にならなかった。そしてさらに検討したところ、前記アルカリプロテアーゼの特性を保持し、比活性を向上させるには、ある種のアルカリプロテアーゼにおいて、当該アミノ酸配列の特定位置に特定のアミノ酸残基が必要であることを見出した。

すなわち、本発明は、配列番号１の（ａ）６６若しくは２６４位、（ｂ）５７、１０１〜１０６、１３６、１９３若しくは３４２位、（ｃ）４６若しくは２０５位、（ｄ）５４、１１９、１３８、１４８若しくは１９５位、（ｅ）２４７位、（ｆ）１２４位、（ｇ）１０７位、（ｈ）２５６位、（ｉ）２５７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：グルタミン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン残基、
（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、
（ｃ）位置：チロシン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基、
（ｄ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニン又はシステイン残基、
（ｅ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基、
（ｆ）位置：アラニン又はリジン残基、
（ｇ）位置：リジン、アルギニン、アラニン又はセリン残基、
（ｈ）位置：グルタミン残基、
（ｉ）位置：バリン又はイソロイシン残基、
から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。

また本発明は該アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、及び該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。

本発明によれば、高濃度の脂肪酸存在下でも活性を有し、かつ比活性が高く、洗浄剤配合用酵素として有用なアルカリプロテアーゼが提供できる。

本発明のアルカリプロテアーゼは、上記のように、配列番号１の（ａ）６６若しくは２６４位、（ｂ）５７、１０１〜１０６、１３６、１９３若しくは３４２位、（ｃ）４６若しくは２０５位、（ｄ）５４、１１９、１３８、１４８若しくは１９５位、（ｅ）２４７位、（ｆ）１２４位、（ｇ）１０７位、（ｈ）２５６位、（ｉ）２５７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；（ａ）位置：グルタミン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン残基、（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、（ｃ）位置：チロシン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基、（ｄ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニン又はシステイン残基、（ｅ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基、（ｆ）位置：アラニン又はリジン残基、（ｇ）位置：リジン、アルギニン、アラニン又はセリン残基、（ｈ）位置：グルタミン残基、（ｉ）位置：バリン又はイソロイシン残基から選ばれたものである。

すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおける前記（ａ）〜（ｉ）から選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の当該位置に相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は特定のアミノ酸残基であるプロテアーゼを意味し、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。

ここで、「他種アルカリプロテアーゼ」としては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸化剤耐性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００であることが好ましく、配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するものがより好ましい。特に配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するものであって、酸化剤耐性を有し、アルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定であり、５０℃においてもｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存性を示し、ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００のものが好ましい。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを５０mM過酸化水素（５mM塩化カルシウムを含有）溶液中（２０mMグリットンロビンソン緩衝液、ｐＨ１０）で、２０℃２０分間放置後の残存活性（合成基質法）が少なくとも５０％以上を保持していることをいう。

ここで、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、ＫＰ４３〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕が挙げられ、「配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＫＰ９８６０〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＥ−１〔バチルス No.Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２）由来、ＪＰ７４０７１０〕、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＹａ〔バチルス エスピーＹ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２９）由来、ＪＰ８６１２１０〕、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＳＤ５２１〔バチルス ＳＤ５２１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１６２）由来、ＪＰ９１０８２１〕、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−１（ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８０１２９３）、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−２（ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ８８０１２９３）等が挙げられる。このうち、配列番号２〜７から選ばれるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが好ましく、さらにこれと９０％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼがより好ましく、特に９５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが好ましい。

なお、アミノ酸配列の相同性は、リップマン−パーソン（Lipman-Pearson）法（Science, 227,1435,1985）によって計算される。
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、相当する位置のアミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相当する位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。

すなわち、（ａ）配列番号１の６６もしくは２６４位のアミノ酸残基はアスパラギン残基であるが、当該アミノ酸残基は、グルタミン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン残基であるのが好ましく、特にアスパラギン酸、セリン又はグルタミン酸であるのが好ましい。更には６６位のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基、２６４位のアミノ酸残基がセリン残基である場合が好ましい。

（ｂ）配列番号１の５７、１０１〜１０６、１３６、１９３もしくは３４２位のアミノ酸残基はグリシン残基であるが、当該アミノ酸残基は、リジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基であるのが好ましく、特に、５７位、１３６位、１９３位、３４２位のアミノ酸残基がアラニン残基、又は１０３位のアミノ酸残基がアルギニン残基であるのが好ましい。

（ｃ）配列番号１の４６もしくは２０５位のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基であるが、当該アミノ酸残基は、チロシン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基であるのが好ましく、特に４６位のアミノ酸残基がロイシン残基であるのが好ましい。

（ｄ）配列番号１の５４、１１９、１３８、１４８もしくは１９５位のアミノ酸残基はチロシン残基であるが、当該アミノ酸残基は、トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、メチオニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、リジン、アルギニン又はシステイン残基であるのが好ましく、特に１９５位のアミノ酸残基がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、バリン、トリプトファン、グリシン、リジン、スレオニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、アルギニン、アスパラギン又はヒスチジン残基であるのが好ましい。

（ｅ）配列番号１の２４７位のアミノ酸残基はリジン残基であるが、当該アミノ酸残基は、トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、メチオニン又はシステインであるのが好ましく、特に２４７位のアミノ酸残基がアルギニン又はスレオニンであるのが好ましい。

（ｆ）配列番号１の１２４位のアミノ酸残基はアルギニン残基であるが、当該１２４位のアミノ酸残基は、アラニン又はリジン残基であるのが好ましい。

（ｇ）配列番号１の１０７位のアミノ酸残基はロイシン残基であるが、当該アミノ酸残基は、リジン、アルギニン、アラニン又はセリン残基であるのが好ましく、特に１０７位のアミノ酸残基がリジン残基であるのが好ましい。

（ｈ）配列番号１の２５６位のアミノ酸残基はメチオニン残基であるが、当該アミノ酸残基は特にグルタミン残基であるのが好ましい。

（ｉ）配列番号１の２５７位のアミノ酸残基はアラニン残基であるが、当該アミノ酸残基は、バリン又はイソロイシン残基である好ましく、特に２５７位のアミノ酸残基がバリン残基であるのが好ましい。

プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配列番号１）の（ａ）〜（ｉ）位に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記「他種アルカリプロテアーゼ」のうちの好適に用いられるもので示す（表１）。

また、本発明アルカリプロテアーゼにおけるアミノ酸残基の欠失、（ａ）〜（ｉ）の選択は、２個所以上が同時になされていていもよい。
本発明のアルカリプロテアーゼが変異体である場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ（親アルカリプロテアーゼということがある）としては、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ」又は上述した「他種アルカリプロテアーゼ」として示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例えばプロテアーゼＫＰ４３の配列番号１で示されるアミノ酸配列の前記（ａ）〜（ｉ）から選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列、具体的には配列番号２〜７で示されるアミノ酸配列の前記位置に相当する位置のアミノ酸残基を欠失又は他のアミノ酸残基に置換することにより得られる。

本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。すなわち、クローニングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子に対して変異を与え、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養することにより得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＪＰ９０１１２８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行えばよい。

親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。

得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法は、例えば当該変異遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させる、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させるなどの方法で本発明の変異プロテアーゼをコードするＤＮＡを安定に増幅し、さらに該遺伝子を安定にかつ効率よく発現させることが可能である宿主に導入させ、変異プロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられる。

かくして得られる本発明のアルカリプロテアーゼは、アルカリ性領域において優れた比活性を有し、高級脂肪酸によってカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は４３，０００±２，０００である。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテアーゼを親株とする変異プロテアーゼは、下記の理化学的性質を有する。
（ｉ）作用ｐＨ範囲：
ｐＨ４〜１３の広い範囲で作用し、ｐＨ６〜１２で最適ｐＨ活性値の８０％以上を示す。
（ii）安定ｐＨ範囲：
４０℃、３０分の処理条件でｐＨ６〜１１の範囲で安定である。
（iii）脂肪酸の影響：
オレイン酸によってカゼイン分解活性の阻害を受けない。

（プロテアーゼ活性測定法）
（１）合成基質法
基質であるGlt-Ala-Ala-Pro-Leu(A-A-P-L)からなる合成ペプチドを用いて分解速度を測定した。すなわち、各被評価酵素と３mMのGlt-A-A-P-L-pNA（ペプチド研究所社製）を含む５０mMホウ酸／ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ１０．５）を、１０〜３０℃で１０〜３０分間恒温し、４２０nmの吸光度を定時的に測定した。ペプチド分解活性は単位時間あたりの４２０nm吸光度の増加率から求めた。蛋白質の定量はバイオラッド社製のプロテインアッセイキットを用いて行った。
（２）天然基質法
カゼイン１％（ｗ／ｖ）を含む５０mMホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）１．０mLを３０℃で５分間保温した後、０．１mLの酵素溶液を加え、１５分間反応を行う。反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）を２．０mL加え、室温で３０分間放置したのち、濾過を行い、濾液中の酸可溶蛋白質をLowryらの方法の変法によって定量した。すなわち、濾液にアルカリ性銅溶液［１％酒石酸ナトリウム・カリウム：１％硫酸銅：１％炭酸ナトリウム＝１：１：１００］を２．５mL添加して室温で１０分間放置後、希釈フェノール液（フェノール試薬（関東化学）をイオン交換水で２倍希釈）０．２５mLを添加して３０分間３０℃で保温したのち、６６０nmにおける吸光度を測定した。酵素１単位は、上記反応にて１分間に１mmolのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。

実施例１
プロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約２．０kbの範囲に対しランダムに変異を与えることとした。先ず、本２．０kbを増幅できるプライマーを用いＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液は鋳型ＤＮＡを５ng、リン酸化プライマーを２０pmol、各ｄＮＴＰを２０nmol、１μmolのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５μmolのＫＣｌ、０．１５μmolのＭｇＣｌ₂、そして２．５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有し、最終液量を１００μＬとした。ＰＣＲ温度条件は、９４℃において５分間放置し鋳型を変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１．５分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。ＰＣＲ product purificaton Kit（ベーリンガー社）によってＰＣＲ産物を精製し１００μＬの滅菌水で溶出させた。引き続き、１μＬの溶出液を使用して２回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は鋳型ＤＮＡ以外は全て１回目のＰＣＲ条件と同じである。２回目のＰＣＲ後に１回目と同様にＰＣＲ産物を精製し１００μＬの滅菌水で溶出させた。

増幅ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みはTaKaRa社製のＬＡＴａｑを用いたポリメラーゼ反応による方法によって行った。詳細に説明すると、２回目の精製溶出液３５μＬにＬＡＴａｑ用のバッファー（１０倍濃縮液）を５μＬ、ｄＮＴＰ溶液を８μＬ、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．５μＬ、さらに鋳型としてプラスミドｐＨＡ６４ＴＳ（発現ベクターｐＨＡ６４にプロテアーゼ構造遺伝子を連結）を２０ng添加後、最終液量を５０μＬにし、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。その後エタノール沈澱によってＰＣＲ産物を回収した。このＰＣＲ産物はプライマー位置の５′側にニックを有するプラスミドの形状を成しており、このニック部分を連結させるために、さらにＴ４リガーゼ（TaKaRa社）によるリガーゼ反応処理を行った。

次に、同リガーゼ反応液１０μＬを用いてBacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行ったところ約４×１０⁵個の形質転換体が取得された。そこでＩＳＷ１２１４株の形質転換体をスキムミルク含有培地（スキムミルク１％、バクトトリプトン１％、塩化ナトリウム１％、酵母エキス０．５％、寒天１．５％、テトラサイクリン７．５μｇ／mL）上に生育させ、プロテアーゼ分泌量を反映していると考えられるハローの形成状態を観察した。その結果、野生型プラスミドによる形質転換体よりも明らかに大きなハローを形成する形質転換体を検出した。

実施例２
実施例１で得られた変異プロテアーゼの合成基質法または天然基質法によるプロテアーゼ活性の測定結果（１９５位及び２５６位アミノ酸残基変異プロテアーゼは天然基質法、他は合成基質法で測定）を図１に示す。本発明の変異アルカリプロテアーゼは高比活性であった。

各変異アルカリプロテアーゼの相対比活性を示す図である。

Claims (5)

1. 配列番号１に示すアミノ酸配列又はこれと９５％以上の同一性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおいて、
   配列番号１の（ａ）６６位のアミノ酸残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基且つ（ｄ）２４６位のアミノ酸残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がセリン残基である；
   配列番号１の（ｂ）１０３位のアミノ酸残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がアルギニン残基である；又は、
   配列番号１の（ｃ）１９５位のアミノ酸残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、バリン、グリシン、リジン、スレオニン、システイン、プロリン、セリン、アルギニン、アスパラギン若しくはヒスチジン残基である、
   親アルカリプロテアーゼに比べて比活性の高い変異アルカリプロテアーゼ。
2. 請求項１記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
3. 請求項２記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
4. 請求項３記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
5. 宿主が微生物である請求項４記載の形質転換体。

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