JP4225721B2 - アルカリプロテアーゼ - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は高い比活性及び酸化剤耐性を有し、洗浄剤配合酵素として有用な変異アルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤等のトイレタリー分野、食品改質剤をはじめとする食品分野、消化助剤や消炎剤といった医薬品等の多分野で利用されている。その中でも最も大量に工業生産され市場規模が大きいのは洗剤用アルカリプロテアーゼである。
【0003】
衣料等の汚れはタンパク質だけでなく、脂質、固体粒子など複数の成分が含まれていることがほとんどであり、実質的な複合汚れに対して洗浄力の高い洗浄剤が望まれている。かかる観点から、本発明者らは、高濃度の脂肪酸存在下でもプロテアーゼ活性を保持し、タンパク質だけでなく皮脂等の汚れを含む複合汚れに対しても優れた洗浄力を示すバチルス属細菌の生産する分子量約43,000のアルカリプロテアーゼを見出し、先に特許出願した(WO99/18218)。
【0004】
また、分子量約43,000のアルカリプロテアーゼは他のバチルス属細菌からもいくつか見出されているが、これらは従来からのズブチリシンタイプのセリンプロテアーゼよりも非常に高い酸化剤耐性を有しており、酸化耐性アルカリプロテアーゼとして新しいズブチリシンサブファミリーを形成するものと提唱されている(Biochem.Biophys.Res.Commun. 279、313−319、2000)。
【0005】
しかし、反応効率を向上させる為に比活性が高く、高濃度の酸化剤に対しても安定なより強い酸化剤耐性を示すアルカリプロテアーゼが求められていた。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記アルカリプロテアーゼの変異による新たな酵素の探索を行ってきたが、ズブチリシンに代表されるセリンプロテアーゼと前記アルカリプロテアーゼとは、酵素学的性質に差異が認められ、さらに検討を加えた結果、前記アルカリプロテアーゼの特性を保持し、比活性を向上させる或いは更に高い酸化剤耐性を付加するには、ある種のアルカリプロテアーゼにおいて、当該アミノ酸配列の特定位置に特定のアミノ酸残基が必要であることを見出した。
【0007】
すなわち、本発明は、配列番号1の(a)251位、(b)256位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基;
(a)位置:アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン残基、
(b)位置:リジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、
から選ばれたアルカリプロテアーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。
【0008】
また本発明は該アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、及び該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明のアルカリプロテアーゼは、上記のように、配列番号1の(a)251位、(b)256位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基;
(a)位置:アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン残基、(b)位置:リジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、から選ばれたものである。
【0010】
すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおける前記(a)及び(b)から選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の当該位置に相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は特定のアミノ酸残基であるプロテアーゼを意味し、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【0011】
ここで、「他種アルカリプロテアーゼ」としては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸化剤耐性を有し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE)法による分子量が43,000±2,000であることが好ましく、配列番号1に示すアミノ酸配列と60%以上、好ましくは80%以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するものが挙げられる。特に好ましくは配列番号1に示すアミノ酸配列と80%以上の相同性をもつアミノ酸配列を有し、pH8以上のアルカリ性領域で作用する、酸化剤耐性を有する、50℃、pH10で10分間処理したとき80%以上の残存活性を示す、SDS−PAGEによる分子量が43,000±2,000である酵素が挙げられる。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを50mM過酸化水素、5mM塩化カルシウムを含む20mMブリットンロビンソン緩衝液(pH10)中で、20℃20分間の放置後の残存活性が少なくとも50%以上を保持していることをいう。
【0012】
ここで、「配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、KP43〔バチルス エスピーKSM−KP43(FERM BP−6532)由来、WO99/18218〕が挙げられ、「配列番号1に示すアミノ酸配列と60%以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、例えば配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼKP9860〔バチルス エスピーKSM−KP9860(FERM BP−6534)由来、WO99/18218〕、配列番号3で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼE−1〔バチルス No.D−6(FERM P−1592)由来、JP740710〕、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼYa〔バチルス エスピーY(FERM BP−1029)由来、JP861210〕、配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼSD521〔バチルス SD521株(FERM P−11162)由来、JP910821〕、配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼA−1(NCIB12289由来、WO8801293)、配列番号7で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼA−2(NCIB12513由来、WO8801293)、又は配列番号1〜7と80%以上、好ましくは87%以上、より好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが挙げられる。
なお、アミノ酸配列の相同性は、リップマン−パーソン(Lipman-Pearson)法(Science, 227,1435,1985)によって計算される。
【0013】
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、相同アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【0014】
すなわち、(a)配列番号1の251位のアミノ酸残基はメチオニン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えば配列番号3においてはそれぞれ250位のメチオニン酸基というように特定することができる。当該アミノ酸残基は、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン残基であるのが好ましく、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミンであるのが特に好ましい。
【0015】
(b)配列番号1の256位のアミノ酸残基はメチオニン残基であるが、ここで、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えば配列番号3においてはそれぞれ255位のメチオニン残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基は、グルタミン、アラニン、バリン、セリン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸残基であるのが好ましく、グルタミン、アラニン、バリン、セリン、アスパラギン残基であるのが特に好ましい。
【0016】
プロテアーゼKP43のアミノ酸配列(配列番号1)の251位(a)、256位(b)に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記「他種アルカリプロテアーゼ」のうちの好適に用いられるもので示す(表1)。
【0017】
【表1】
【0018】
また、本発明アルカリプロテアーゼにおけるアミノ酸残基の欠失、(a)又は(b)の選択は、2個所以上が同時になされていていもよい。
【0019】
本発明のアルカリプロテアーゼが変異体である場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ(親アルカリプロテアーゼということがある)としては、「配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ」又は上述した「他種アルカリプロテアーゼ」として示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例えばプロテアーゼKP43の配列番号1で示されるアミノ酸配列の前記(a)及び(b)から選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列、具体的には配列番号2〜7で示されるアミノ酸配列の前記位置に相当する位置のアミノ酸残基を欠失又は他のアミノ酸残基に置換することにより得られる。
【0020】
本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。すなわち、クローニングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子に対して変異を与え、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養することにより得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばWO99/18218、JP901128、WO98/56927記載の方法に従って行えばよい。
【0021】
親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用いて行うことができる。また、リコンビナントPCR(polymerase chain reaction)法(PCR protocols, Academic press, New York, 1990)を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【0022】
得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法は、例えば当該変異遺伝子を安定に増幅できるDNAベクターに連結させる、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる染色体DNA上に導入させるなどの方法で本発明の変異プロテアーゼをコードするDNAを安定に増幅し、さらに該遺伝子を安定にかつ効率よく発現させることが可能である宿主に導入し、変異プロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられる。
【0023】
かくして得られる本発明のアルカリプロテアーゼは、アルカリ性領域において優れた比活性を有し、強い酸化剤耐性を有し、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有するプロテアーゼを親株とする変異プロテアーゼは、下記の理化学的性質を有する。
(i)作用pH範囲:
pH4〜13の広い範囲で作用し、pH6〜12で最適pH活性値の80%以上を示す。
(ii)安定pH範囲:
40℃、30分の処理条件でpH6〜11の範囲で安定である。
(iii)脂肪酸の影響:
オレイン酸によってカゼイン分解活性の阻害を受けない。
【0024】
【実施例】
[プロテアーゼ活性測定法−カゼイン法]
カゼイン1%(w/v)を含む50mMホウ酸緩衝液(pH10)1.0mLを30℃で5分間保温した後、0.1mLの酵素溶液を加え、15分間反応を行う。反応停止液(0.11Mトリクロロ酢酸−0.22M酢酸ナトリウム−0.33M酢酸)を2.0mL加え、室温で30分間放置したのち、濾過を行い、濾液中の酸可溶タンパク質をLowryらの方法(J.Biol. Chem.、193、265−275、1981)によって定量した。すなわち、濾液にアルカリ性銅溶液[1%酒石酸ナトリウムカリウム:1%硫酸銅:1%炭酸ナトリウム=1:1:100]を2.5mL添加して室温で10分間放置後、希釈フェノール液(フェノール試薬(関東化学)を脱イオン水で2倍希釈)0.25mLを添加して30分間30℃で保温したのち、660nmにおける吸光度を測定した。酵素1単位は、上記反応にて1分間に1mmolのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。
【0025】
[プロテアーゼ活性測定法−合成基質法]
合成基質(Leu-Ser-Thr-Arg-p-nitroanilide、ペプチド研究所)6μMを含む100mMホウ酸緩衝液(pH10.5)50μLに50μLの酵素溶液を加え、30℃中で15分間反応を行う。反応液の吸光度414nmを経過時間ごとに測定し、単位時間あたりの吸光度414nmの変化値からプロテアーゼ活性を求めた。
【0026】
実施例1
プロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約1.5kbの範囲に対しランダムに変異を与えることとした。先ず、本1.5kbを増幅できるプライマー(5'−GCGATGTTAAGTCAGCAACAAGC-3'(配列番号8), 5'-CTATTAATTCACAATTGCCAACGAG(配列番号9))を用いPCRを行った。PCR反応液(100μL)中には鋳型DNAを5ng、リン酸化プライマーを20pmol、各dNTPを20nmol、1μmolのトリス塩酸緩衝液(pH8.3)、5μmolの塩化カリウム、0.15μmolの塩化マグネシウム、2.5unitsのTaqDNAポリメラーゼを含んでいた。PCRの反応条件は、94℃において5分間放置し鋳型を変性させた後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で1.5分間を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。PCR product purificaton Kit(ベーリンガーマンハイム社)によってPCR産物を精製し100μLの滅菌水で溶出させた。引き続き、1μLの溶出液を使用して2回目のPCRを行った。PCRの条件は鋳型DNA以外は全て1回目のPCR条件と同じとした。2回目のPCR後に1回目と同様にPCR産物を精製し100μLの滅菌水で溶出させた。
【0027】
増幅DNA断片のベクターへの組み込みはTakara社のLATaqを用いたポリメラーゼ反応による方法によって行った。即ち、2回目の精製溶出液35μLにLATaq用の緩衝液(10倍濃縮液)を5μL、dNTP溶液を8μL、LATaqDNAポリメラーゼを0.5μL、さらに鋳型としてプラスミドpHA64TS(発現ベクターにプロテアーゼ構造遺伝子を連結したもの)を20ng添加後、最終液量を50μLにし、94℃1分間、55℃1分間、72℃4分間を30サイクルの条件でPCR反応を行った。その後エタノール沈澱によってPCR産物を回収した。このPCR産物はプライマー位置の5'末端側にニックを有するプラスミドの形状を成しており、このニック部分を連結させるために、さらにT4リガーゼ(Takara社)による結合反応処理を行った。
【0028】
次に、上記のリガーゼ反応液10μLを用いてBacillus subtilis ISW1214株の形質転換を行ったところ約4×105個の形質転換体が取得された。そこでISW1214株の形質転換体をスキムミルク含有培地(スキムミルク1%、バクトトリプトン1%、塩化ナトリウム1%、酵母エキス0.5%、寒天1.5%、テトラサイクリン7.5μg/mL)上に生育させ、プロテアーゼ分泌量を反映しているスキムミルク溶解斑の形成状態を観察した。その結果、野生型プラスミドによる形質転換体よりも明らかに大きな溶解斑を形成する形質転換体を検出した。
【0029】
これらの形質転換体を培養し、培養上清よりプロテアーゼを精製したところ、比活性が向上していることことが判った。そこで、これらの変異酵素をコードする遺伝子の塩基配列を決定したところ、配列番号1に示すプロテアーゼの251位或いは256位のメチオニンがグルタミン或いはロイシンに置換している変異酵素であることが明らかになった。これらの変異はランダム変異の導入によって行われたので、次に251位或いは256位を上記のアミノ酸以外のアミノ酸に置換することを目的に部位特異的変異導入法による変異酵素の造成を試みた。
【0030】
部位特異的変異の導入の方法はODA法(Hashimoto-Gotoh et al.、Gene、 152、271-276、1995)を基にしてTakara社のSite-directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km Kitのプロトコールに準じて行った。251位を代えるために5'-AAATATGCATACXXXGGTGGAACGTC-3'(配列番号10)からなるプライマーを256位を代えるために5'-GGAACGTCCXXXGCTACACCGATC-3'(配列番号11)からなるプライマーを使用した(XはATGCの混合)。
【0031】
実施例2
プロテアーゼ活性画分の調製は、実施例1で得られた形質転換体をA培地( 3% ポリペプトンS(日本製薬)、0.5% 酵母エキス、1%魚肉エキス(和光純薬)、0.15% リン酸二カリウム、0.02% 硫酸マグネシウム7水和物、マルトース 4%、テトラサイクリン 7.5μg/mL)にて30℃、60時間培養し、得られた培養上清に90%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を塩析した。塩析で得られたサンプルを2mMの塩化カルシウムを含有する10mMのトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解した後、同緩衝液にて一晩透析を行なった。透析膜中の画分を2mMの塩化カルシウムを含有する10mMのトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したDEAE Bio−GelA(Bio−Rad)に添着させ、非吸着のプロテアーゼ活性画分を回収した。さらに活性画分を同緩衝液で平衡化したSP−Toyopearl 550W(Tosoh)に添着させ、0−50mMの塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いて吸着したタンパク質を溶出し、プロテアーゼ活性画分を得た。この画分をSDS−PAGE電気泳動し、ほぼ均一なタンパク質としてプロテアーゼが得られていることを確認した。タンパク質濃度の測定は牛血清アルブミン(バイオラッド社製)を標準タンパク質として用いてLowryらの方法に準じて行った。
【0032】
実施例3
実施例2で得られた精製した各変異プロテアーゼの活性をカゼイン法によって測定した。各変異プロテアーゼの単位タンパク質量あたりの活性(比活性)の測定結果を図1に示した。本発明の変異アルカリプロテアーゼは親アルカリプロテアーゼに比べ高い比活性を有していた。
【0033】
実施例4
実施例2で得られた精製した各変異プロテアーゼを3%の過酸化水素水を含有する100mMホウ酸緩衝液(pH10.5)2mL中に50μLずつ添加し、30℃で30分間放置した。余剰の過酸化水素を除くため充分量のカタラーゼ(ベーリンガーマンハイム社)を加えた後、残存プロテアーゼ活性を合成基質法にて測定した。各変異プロテアーゼの過酸化水素水処理後の残存活性を処理前の活性を100%として相対値で図2に示した。本発明の変異アルカリプロテアーゼは親アルカリプロテアーゼに比較しより高い酸化剤耐性を有していた。
【0034】
【発明の効果】
本発明によれば、反応効率が高く(高比活性)、強い酸化剤耐性を有する洗剤用アルカリプロテアーゼを提供できる。
【0035】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】各変異アルカリプロテアーゼの相対比活性を示す図である。
【図2】各変異アルカリプロテアーゼの酸化剤処理後の相対残存活性を示す図である。
Claims (7)
- 配列番号1の(a)251位、(b)256位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基;
(a)位置:スレオニン、イソロイシン、バリン、グルタミン残基、
(b)位置:グルタミン残基、
から選ばれたアルカリプロテアーゼ。 - 配列番号1に示すアミノ酸配列又はこれと90%以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号1の(a)251位、(b)256位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基;
(a)位置:スレオニン、イソロイシン、バリン、グルタミン残基、
(b)位置:グルタミン残基、
から選ばれたアルカリプロテアーゼ。 - 配列番号2〜7から選ばれるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ又は配列番号2〜7から選ばれるアミノ酸配列と90%以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号1の(a)251位、(b)256位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基;
(a)位置:スレオニン、イソロイシン、バリン、グルタミン残基、
(b)位置:グルタミン残基、
から選ばれたアルカリプロテアーゼ。 - 請求項1〜3記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
- 請求項4記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項5記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
- 宿主が微生物である請求項6記載の形質転換体。
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