JP2002218989A

JP2002218989A - アルカリプロテアーゼ

Info

Publication number: JP2002218989A
Application number: JP2001354807A
Authority: JP
Inventors: Yuji Hatada; 勇二秦田; Akinori Ogawa; 晃範小川; Takeshi Sato; 剛佐藤; Hiroyuki Araki; 裕行荒木; Katsuhisa Saeki; 勝久佐伯; Shuji Kawai; 修次川合; Susumu Ito; 進伊藤; Yasushi Kageyama; 泰影山; Mitsuyoshi Okuda; 光美奥田
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2000-11-22
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2002-08-06

Abstract

(57)【要約】【解決手段】配列番号１の（ａ）６６若しくは２６４
位、（ｂ）５７、１０１〜１０６、１３６、１９３若し
くは３４２位、（ｃ）４６若しくは２０５位、（ｄ）５
４、１１９、１３８、１４８若しくは１９５位、（ｅ）
２４７位、（ｆ）１２４位、（ｇ）１０７位、（ｈ）２
５６位、（ｉ）２５７位又はこれに相当する位置のアミ
ノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；（ａ）位置：グルタミン、アスパラギン酸残基等、
（ｂ）位置：リジン、セリン残基等、（ｃ）位置：チロ
シン、トリプトファン残基等、（ｄ）位置：トリプトフ
ァン、フェニルアラニン残基等、（ｅ）位置：トリプト
ファン、フェニルアラニン残基等、（ｆ）位置：アラニ
ン又はリジン残基、（ｇ）位置：リジン、アルギニン残
基等、（ｈ）位置：グルタミン残基、（ｉ）位置：バリ
ン又はイソロイシン残基、から選ばれたものであるアル
カリプロテアーゼ。【効果】本発明によれば、高濃度の脂肪酸存在下でも
活性を有し、かつ比活性が高く、洗浄剤配合用酵素とし
て有用なアルカリプロテアーゼが提供できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は高い比活性を有し、
洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼ及び
それをコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】プロテ
アーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧
料、浴用剤、食品改質剤、消化助剤あるいは消炎剤とい
った医薬品等の多分野で利用されてきた。その中でも最
も大量に工業生産され市場規模が大きいのは洗剤用プロ
テアーゼであり、多くのプロテアーゼが市販されてい
る。ところが、衣料等の汚れは蛋白質だけでなく、脂
質、固体粒子など複数の成分が含まれていることがほと
んどであり、かかる実際の複合汚れに対して洗浄力の高
い洗浄剤が望まれている。かかる観点から、本発明者
は、高濃度の脂肪酸存在下でもカゼイン分解活性を保持
し、蛋白だけでなく皮脂等の汚れのある複合汚れ条件下
でも優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアル
カリプロテアーゼを見出し、先に特許出願した（ＷＯ９
９／１８２１８）。

【０００３】しかし、さらに優れた特性を有するアルカ
リプロテアーゼが求められていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記アルカ
リプロテアーゼの変異による新たな酵素の探索を行って
きたが、従来行なわれているズブチリシンに代表される
セリンプロテアーゼと前記アルカリプロテアーゼとは、
酵素学的性質が全く異なり、ズブチリシン等の変異箇所
は全く参考にならなかった。そしてさらに検討したとこ
ろ、前記アルカリプロテアーゼの特性を保持し、比活性
を向上させるには、ある種のアルカリプロテアーゼにお
いて、当該アミノ酸配列の特定位置に特定のアミノ酸残
基が必要であることを見出した。

【０００５】すなわち、本発明は、配列番号１の（ａ）
６６若しくは２６４位、（ｂ）５７、１０１〜１０６、
１３６、１９３若しくは３４２位、（ｃ）４６若しくは
２０５位、（ｄ）５４、１１９、１３８、１４８若しく
は１９５位、（ｅ）２４７位、（ｆ）１２４位、（ｇ）
１０７位、（ｈ）２５６位、（ｉ）２５７位又はこれに
相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残
基；（ａ）位置：グルタミン、アスパラギン酸、セリン、グ
ルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオ
ニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン
残基、（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルア
ラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イ
ソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、ト
リプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチ
ジン、プロリン又はアラニン残基、（ｃ）位置：チロシン、トリプトファン、アラニン、ア
スパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイ
シン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グ
ルタミン、メチオニン又はシステイン残基、（ｄ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラ
ニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリ
ン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオ
ニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニ
ン又はシステイン残基、（ｅ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラ
ニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリ
ン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、グ
ルタミン、メチオニン又はシステイン残基、（ｆ）位置：アラニン又はリジン残基、（ｇ）位置：リジン、アルギニン、アラニン又はセリン
残基、（ｈ）位置：グルタミン残基、（ｉ）位置：バリン又はイソロイシン残基、から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ、及びそ
れをコードする遺伝子を提供するものである。

【０００６】また本発明は該アルカリプロテアーゼをコ
ードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、
及び該ベクターを含有する形質転換体を提供するもので
ある。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明のアルカリプロテアーゼ
は、上記のように、配列番号１の（ａ）６６若しくは２
６４位、（ｂ）５７、１０１〜１０６、１３６、１９３
若しくは３４２位、（ｃ）４６若しくは２０５位、
（ｄ）５４、１１９、１３８、１４８若しくは１９５
位、（ｅ）２４７位、（ｆ）１２４位、（ｇ）１０７
位、（ｈ）２５６位、（ｉ）２５７位又はこれに相当す
る位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：グルタミン、アスパラギン酸、セリン、グ
ルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオ
ニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン
残基、（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェ
ニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシ
ン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイ
ン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、
ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、（ｃ）位置：
チロシン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、
グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロ
イシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メ
チオニン又はシステイン残基、（ｄ）位置：トリプトフ
ァン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グ
ルタミン酸、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリ
ン、リジン、グルタミン、メチオニン、グリシン、アス
パラギン酸、プロリン、アルギニン又はシステイン残
基、（ｅ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、
アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリ
ン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基、
（ｆ）位置：アラニン又はリジン残基、（ｇ）位置：リ
ジン、アルギニン、アラニン又はセリン残基、（ｈ）位
置：グルタミン残基、（ｉ）位置：バリン又はイソロイ
シン残基から選ばれたものである。

【０００８】すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼ
は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカ
リプロテアーゼにおける前記（ａ）〜（ｉ）から選ばれ
る位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼの
アミノ酸配列の当該位置に相当する位置のアミノ酸残基
が欠失又は特定のアミノ酸残基であるプロテアーゼを意
味し、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に
変異を施した変異体であってもよい。

【０００９】ここで、「他種アルカリプロテアーゼ」と
しては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸
化剤耐性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４
３，０００±２，０００であることが好ましく、配列番
号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつア
ミノ酸配列を有するものがより好ましい。特に配列番号
１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつアミ
ノ酸配列を有するものであって、酸化剤耐性を有し、ア
ルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定であり、５
０℃においてもｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％
以上の残存性を示し、ジイソプロピルフルオルリン酸
（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド
（ＰＭＳＦ）で阻害され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量が４３，０００±２，０００のものが好ましい。ここ
で、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアー
ゼを５０mM過酸化水素（５mM塩化カルシウムを含有）溶
液中（２０mMグリットンロビンソン緩衝液、ｐＨ１０）
で、２０℃２０分間放置後の残存活性（合成基質法）が
少なくとも５０％以上を保持していることをいう。

【００１０】ここで、「配列番号１で示されるアミノ酸
配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、ＫＰ４
３〔バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕が挙げ
られ、「配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の
相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアー
ゼ」としては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配
列を有するプロテアーゼＫＰ９８６０〔バチルスエス
ピーＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭＢＰ−６５３
４）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕、配列番号３で示さ
れるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＥ−１〔バチル
ス No.Ｄ−６（ＦＥＲＭＰ−１５９２）由来、ＪＰ
７４０７１０〕、配列番号４で示されるアミノ酸配列を
有するプロテアーゼＹａ〔バチルスエスピーＹ（ＦＥ
ＲＭＢＰ−１０２９）由来、ＪＰ８６１２１０〕、配
列番号５で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ
ＳＤ５２１〔バチルスＳＤ５２１株（ＦＥＲＭＰ−
１１１６２）由来、ＪＰ９１０８２１〕、配列番号６で
示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−１（Ｎ
ＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８０１２９３）、配列番
号７で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−
２（ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ８８０１２９３）等
が挙げられる。このうち、配列番号２〜７から選ばれる
アミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するア
ルカリプロテアーゼが好ましく、さらにこれと９０％以
上の相同性を有するアルカリプロテアーゼがより好まし
く、特に９５％以上の相同性を有するアルカリプロテア
ーゼが好ましい。

【００１１】なお、アミノ酸配列の相同性は、リップマ
ン−パーソン（Lipman-Pearson）法（Science, 227,143
5,1985）によって計算される。また、「相当する位置の
アミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップ
マン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミ
ノ酸配列を比較することにより行うことができる。プロ
テアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させる
ことにより、相当する位置のアミノ酸残基の各プロテア
ーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。
相当する位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考
えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似
した効果を有することが推定できる。

【００１２】すなわち、（ａ）配列番号１の６６もしく
は２６４位のアミノ酸残基はアスパラギン残基である
が、当該アミノ酸残基は、グルタミン、アスパラギン
酸、セリン、グルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロ
イシン、メチオニン、システイン、バリン、グリシン又
はイソロイシン残基であるのが好ましく、特にアスパラ
ギン酸、セリン又はグルタミン酸であるのが好ましい。
更には６６位のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基、２
６４位のアミノ酸残基がセリン残基である場合が好まし
い。

【００１３】（ｂ）配列番号１の５７、１０１〜１０
６、１３６、１９３もしくは３４２位のアミノ酸残基は
グリシン残基であるが、当該アミノ酸残基は、リジン、
セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アル
ギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニ
ン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はア
ラニン残基であるのが好ましく、特に、５７位、１３６
位、１９３位、３４２位のアミノ酸残基がアラニン残
基、又は１０３位のアミノ酸残基がアルギニン残基であ
るのが好ましい。

【００１４】（ｃ）配列番号１の４６もしくは２０５位
のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基であるが、当該
アミノ酸残基は、チロシン、トリプトファン、アラニ
ン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリ
ン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リ
ジン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基であ
るのが好ましく、特に４６位のアミノ酸残基がロイシン
残基であるのが好ましい。

【００１５】（ｄ）配列番号１の５４、１１９、１３
８、１４８もしくは１９５位のアミノ酸残基はチロシン
残基であるが、当該アミノ酸残基は、トリプトファン、
フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミ
ン酸、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、グル
タミン、メチオニン、グリシン、アスパラギン酸、プロ
リン、リジン、アルギニン又はシステイン残基であるの
が好ましく、特に１９５位のアミノ酸残基がアラニン、
アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、バリン、
トリプトファン、グリシン、リジン、スレオニン、メチ
オニン、システイン、フェニルアラニン、プロリン、セ
リン、アルギニン、アスパラギン又はヒスチジン残基で
あるのが好ましい。

【００１６】（ｅ）配列番号１の２４７位のアミノ酸残
基はリジン残基であるが、当該アミノ酸残基は、トリプ
トファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギ
ン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イ
ソロイシン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、メチオ
ニン又はシステインであるのが好ましく、特に２４７位
のアミノ酸残基がアルギニン又はスレオニンであるのが
好ましい。

【００１７】（ｆ）配列番号１の１２４位のアミノ酸残
基はアルギニン残基であるが、当該１２４位のアミノ酸
残基は、アラニン又はリジン残基であるのが好ましい。

【００１８】（ｇ）配列番号１の１０７位のアミノ酸残
基はロイシン残基であるが、当該アミノ酸残基は、リジ
ン、アルギニン、アラニン又はセリン残基であるのが好
ましく、特に１０７位のアミノ酸残基がリジン残基であ
るのが好ましい。

【００１９】（ｈ）配列番号１の２５６位のアミノ酸残
基はメチオニン残基であるが、当該アミノ酸残基は特に
グルタミン残基であるのが好ましい。

【００２０】（ｉ）配列番号１の２５７位のアミノ酸残
基はアラニン残基であるが、当該アミノ酸残基は、バリ
ン又はイソロイシン残基である好ましく、特に２５７位
のアミノ酸残基がバリン残基であるのが好ましい。

【００２１】プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配
列番号１）の（ａ）〜（ｉ）位に相当する位置及びアミ
ノ酸残基の具体例を、上記「他種アルカリプロテアー
ゼ」のうちの好適に用いられるもので示す（表１）。

【００２２】

【表１】

【００２３】また、本発明アルカリプロテアーゼにおけ
るアミノ酸残基の欠失、（ａ）〜（ｉ）の選択は、２個
所以上が同時になされていていもよい。本発明のアルカ
リプロテアーゼが変異体である場合、変異を施す前のア
ルカリプロテアーゼ（親アルカリプロテアーゼというこ
とがある）としては、「配列番号１で示されるアミノ酸
配列を有するプロテアーゼ」又は上述した「他種アルカ
リプロテアーゼ」として示したものが該当し、これに目
的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテ
アーゼが得られる。例えばプロテアーゼＫＰ４３の配列
番号１で示されるアミノ酸配列の前記（ａ）〜（ｉ）か
ら選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテ
アーゼのアミノ酸配列、具体的には配列番号２〜７で示
されるアミノ酸配列の前記位置に相当する位置のアミノ
酸残基を欠失又は他のアミノ酸残基に置換することによ
り得られる。

【００２４】本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以
下の方法により得ることができる。すなわち、クローニ
ングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子
に対して変異を与え、得られた変異遺伝子を用いて適当
な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養することに
より得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺
伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用
いればよく、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＪＰ９０１
１２８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行え
ばよい。

【００２５】親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝
子の変異手段としては、一般的に行われているランダム
変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。よ
り具体的には、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutage
nesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用い
て行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（po
lymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academ
ic press, New York, 1990）を用いることによって、遺
伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当す
る配列と置換することが可能である。

【００２６】得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテ
アーゼの生産方法は、例えば当該変異遺伝子を安定に増
幅できるＤＮＡベクターに連結させる、或いは当該変異
遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させる
などの方法で本発明の変異プロテアーゼをコードするＤ
ＮＡを安定に増幅し、さらに該遺伝子を安定にかつ効率
よく発現させることが可能である宿主に導入させ、変異
プロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条件
を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、
カビ、酵母、放線菌などが挙げられる。

【００２７】かくして得られる本発明のアルカリプロテ
アーゼは、アルカリ性領域において優れた比活性を有
し、高級脂肪酸によってカゼイン分解活性の阻害を受け
ず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は４３，０００±
２，０００である。例えば、配列番号１のアミノ酸配列
を有するプロテアーゼを親株とする変異プロテアーゼ
は、下記の理化学的性質を有する。（ｉ）作用ｐＨ範囲：ｐＨ４〜１３の広い範囲で作用
し、ｐＨ６〜１２で最適ｐＨ活性値の８０％以上を示
す。（ii）安定ｐＨ範囲：４０℃、３０分の処理条件でｐＨ
６〜１１の範囲で安定である。（iii）脂肪酸の影響：オレイン酸によってカゼイン分
解活性の阻害を受けない。

【００２８】

【実施例】（プロテアーゼ活性測定法）（１）合成基質法基質であるGlt-Ala-Ala-Pro-Leu(A-A-P-L)からなる合成
ペプチドを用いて分解速度を測定した。すなわち、各被
評価酵素と３mMのGlt-A-A-P-L-pNA（ペプチド研究所社
製）を含む５０mMホウ酸／ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ１０．
５）を、１０〜３０℃で１０〜３０分間恒温し、４２０
nmの吸光度を定時的に測定した。ペプチド分解活性は単
位時間あたりの４２０nm吸光度の増加率から求めた。蛋
白質の定量はバイオラッド社製のプロテインアッセイキ
ットを用いて行った。（２）天然基質法カゼイン１％（ｗ／ｖ）を含む５０mMホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ１０）１．０mLを３０℃で５分間保温した後、０．１
mLの酵素溶液を加え、１５分間反応を行う。反応停止液
（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウ
ム−０．３３Ｍ酢酸）を２．０mL加え、室温で３０分間
放置したのち、濾過を行い、濾液中の酸可溶蛋白質をLo
wryらの方法の変法によって定量した。すなわち、濾液
にアルカリ性銅溶液［１％酒石酸ナトリウム・カリウ
ム：１％硫酸銅：１％炭酸ナトリウム＝１：１：１０
０］を２．５mL添加して室温で１０分間放置後、希釈フ
ェノール液（フェノール試薬（関東化学）をイオン交換
水で２倍希釈）０．２５mLを添加して３０分間３０℃で
保温したのち、６６０nmにおける吸光度を測定した。酵
素１単位は、上記反応にて１分間に１mmolのチロシンに
相当する酸可溶性蛋白分解物を遊離させるのに必要な酵
素量とした。

【００２９】実施例１プロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約２．
０kbの範囲に対しランダムに変異を与えることとした。
先ず、本２．０kbを増幅できるプライマーを用いＰＣＲ
を行った。ＰＣＲ反応液は鋳型ＤＮＡを５ng、リン酸化
プライマーを２０pmol、各ｄＮＴＰを２０nmol、１μmo
lのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５μmolのＫＣ
ｌ、０．１５μmolのＭｇＣｌ₂、そして２．５ＵＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼを含有し、最終液量を１００μＬ
とした。ＰＣＲ温度条件は、９４℃において５分間放置
し鋳型を変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分
間、７２℃で１．５分間を１サイクルとしてこれを３０
サイクル行った。ＰＣＲ product purificaton Kit（ベ
ーリンガー社）によってＰＣＲ産物を精製し１００μＬ
の滅菌水で溶出させた。引き続き、１μＬの溶出液を使
用して２回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は鋳型Ｄ
ＮＡ以外は全て１回目のＰＣＲ条件と同じである。２回
目のＰＣＲ後に１回目と同様にＰＣＲ産物を精製し１０
０μＬの滅菌水で溶出させた。

【００３０】増幅ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みは
TaKaRa社製のＬＡＴａｑを用いたポリメラーゼ反応によ
る方法によって行った。詳細に説明すると、２回目の精
製溶出液３５μＬにＬＡＴａｑ用のバッファー（１０倍
濃縮液）を５μＬ、ｄＮＴＰ溶液を８μＬ、ＬＡＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを０．５μＬ、さらに鋳型としてプ
ラスミドｐＨＡ６４ＴＳ（発現ベクターｐＨＡ６４にプ
ロテアーゼ構造遺伝子を連結）を２０ng添加後、最終液
量を５０μＬにし、９４℃１分間、５５℃１分間、７２
℃４分間を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。
その後エタノール沈澱によってＰＣＲ産物を回収した。
このＰＣＲ産物はプライマー位置の５′側にニックを有
するプラスミドの形状を成しており、このニック部分を
連結させるために、さらにＴ４リガーゼ（TaKaRa社）に
よるリガーゼ反応処理を行った。

【００３１】次に、同リガーゼ反応液１０μＬを用いて
Bacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行っ
たところ約４×１０⁵個の形質転換体が取得された。そ
こでＩＳＷ１２１４株の形質転換体をスキムミルク含有
培地（スキムミルク１％、バクトトリプトン１％、塩化
ナトリウム１％、酵母エキス０．５％、寒天１．５％、
テトラサイクリン７．５μｇ／mL）上に生育させ、プロ
テアーゼ分泌量を反映していると考えられるハローの形
成状態を観察した。その結果、野生型プラスミドによる
形質転換体よりも明らかに大きなハローを形成する形質
転換体を検出した。

【００３２】実施例２実施例１で得られた変異プロテアーゼの合成基質法また
は天然基質法によるプロテアーゼ活性の測定結果（１９
５位及び２５６位アミノ酸残基変異プロテアーゼは天然
基質法、他は合成基質法で測定）を図１に示す。本発明
の変異アルカリプロテアーゼは高比活性であった。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、高濃度の脂肪酸存在下
でも活性を有し、かつ比活性が高く、洗浄剤配合用酵素
として有用なアルカリプロテアーゼが提供できる。

【００３４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Alkaline protease <130> P05021311 <150> JP P2000-355166 <151> 2000-11-22 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 434 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly 65 70 75 80 Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser 85 90 95 Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln 100 105 110 Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn 115 120 125 Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn 130 135 140 Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala 145 150 155 160 Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala 165 170 175 Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe 180 185 190 Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg 195 200 205 Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly 210 215 220 Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe 225 230 235 240 Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met 245 250 255 Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe 260 265 270 Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala 275 280 285 Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn 290 295 300 Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr 305 310 315 320 Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser 325 330 335 Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser 340 345 350 Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu 355 360 365 Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp 370 375 380 Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu 385 390 395 400 Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val 405 410 415 Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile 420 425 430 Val Asn <210> 2 <211> 434 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly 65 70 75 80 Ala Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser 85 90 95 Ile Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln 100 105 110 Thr Leu Phe Ser Gln Ala Phe Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn 115 120 125 Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn 130 135 140 Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala 145 150 155 160 Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala 165 170 175 Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe 180 185 190 Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg 195 200 205 Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly 210 215 220 Thr Tyr Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe 225 230 235 240 Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met 245 250 255 Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe 260 265 270 Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala 275 280 285 Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn 290 295 300 Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr 305 310 315 320 Val Asn Glu Ser Ser Ala Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Thr 325 330 335 Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser 340 345 350 Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu 355 360 365 Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Arg Tyr Val Gly Asn Asp 370 375 380 Phe Ser Ala Pro Phe Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu 385 390 395 400 Asn Val Phe Ile Asn Ser Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val 405 410 415 Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Asn Phe Ser Leu Ala Ile 420 425 430 Val Asn <210> 3 <211> 433 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 3 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Val Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala 65 70 75 80 Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile 85 90 95 Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr 100 105 110 Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser 115 120 125 Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val 130 135 140 Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys 165 170 175 Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly 195 200 205 Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr 210 215 220 Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp 225 230 235 240 Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala 245 250 255 Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile 260 265 270 Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu 275 280 285 Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln 290 295 300 Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val 305 310 315 320 Asn Glu Ala Thr Ala Leu Thr Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe 325 330 335 Gln Thr Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp 340 345 350 Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp 355 360 365 Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe 370 375 380 Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn 385 390 395 400 Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln 405 410 415 Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val 420 425 430 His <210> 4 <211> 433 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 4 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Val Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Ser Asp 50 55 60 Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala 65 70 75 80 Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile 85 90 95 Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr 100 105 110 Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser 115 120 125 Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val 130 135 140 Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys 165 170 175 Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly 195 200 205 Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr 210 215 220 Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp 225 230 235 240 Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala 245 250 255 Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile 260 265 270 Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu 275 280 285 Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asp Gln 290 295 300 Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asn Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val 305 310 315 320 Asn Glu Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe 325 330 335 Gln Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp 340 345 350 Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp 355 360 365 Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe 370 375 380 Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn 385 390 395 400 Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Ile Ile Glu Val Gln 405 410 415 Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val 420 425 430 His <210> 5 <211> 433 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 5 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Val Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala 65 70 75 80 Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile 85 90 95 Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr 100 105 110 Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser 115 120 125 Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val 130 135 140 Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys 165 170 175 Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Leu Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly 195 200 205 Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr 210 215 220 Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp 225 230 235 240 Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala 245 250 255 Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile 260 265 270 Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu 275 280 285 Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln 290 295 300 Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val 305 310 315 320 Asn Glu Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe 325 330 335 Gln Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp 340 345 350 Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp 355 360 365 Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe 370 375 380 Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn 385 390 395 400 Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln 405 410 415 Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val 420 425 430 His <210> 6 <211> 434 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 6 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Val Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly 65 70 75 80 Thr Ser Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser 85 90 95 Val Met Asp Ser Asn Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Val Ser 100 105 110 Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn 115 120 125 Ser Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn 130 135 140 Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Ala Val Leu Phe Ala Ala 145 150 155 160 Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala 165 170 175 Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe 180 185 190 Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg 195 200 205 Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly 210 215 220 Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe 225 230 235 240 Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met 245 250 255 Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe 260 265 270 Ile Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala 275 280 285 Leu Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asn 290 295 300 Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Phe 305 310 315 320 Val Asn Glu Thr Ser Ser Leu Ser Thr Asn Gln Lys Ala Thr Tyr Ser 325 330 335 Phe Thr Ala Gln Ser Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser 340 345 350 Asp Ala Pro Ala Ser Thr Ser Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu 355 360 365 Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Lys Tyr Val Gly Asn Asp 370 375 380 Phe Thr Ala Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu 385 390 395 400 Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Val Glu Val 405 410 415 Gln Ala Tyr Asn Val Pro Gln Gly Pro Gln Ala Phe Ser Leu Ala Ile 420 425 430 Val Asn <210> 7 <211> 433 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 7 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn 1 5 10 15 Phe Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala 65 70 75 80 Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile 85 90 95 Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ala Asn Leu Gln Thr 100 105 110 Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser 115 120 125 Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val 130 135 140 Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Glu Gly Pro Gly Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys 165 170 175 Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly 195 200 205 Pro Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr 210 215 220 Tyr Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp 225 230 235 240 Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala 245 250 255 Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val 260 265 270 Lys Asn Arg Gly Val Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu 275 280 285 Ile Ala Gly Ala Ala Asp Val Gly Leu Gly Phe Pro Asn Gly Asn Gln 290 295 300 Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Phe Val 305 310 315 320 Asn Glu Thr Ser Pro Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe 325 330 335 Thr Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp 340 345 350 Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp 355 360 365 Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe 370 375 380 Thr Ala Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn 385 390 395 400 Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Val Glu Val Gln 405 410 415 Ala Tyr Asn Val Pro Val Ser Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile Val 420 425 430 His

【図面の簡単な説明】

【図１】各変異アルカリプロテアーゼの相対比活性を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/54 5/00 Ａ (72)発明者佐藤剛栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者荒木裕行栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者佐伯勝久栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者川合修次栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者伊藤進栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者影山泰栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者奥田光美栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA14 CA04 CA06 DA07 EA04 GA11 HA01 4B050 CC01 CC03 DD02 LL01 LL04 4B065 AA15Y AA19X AB01 AC14 BA02 CA33 CA44 CA57 4H003 DA01 EC02 FA04 FA47

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１の（ａ）６６若しくは２６４
位、（ｂ）５７、１０１〜１０６、１３６、１９３若し
くは３４２位、（ｃ）４６若しくは２０５位、（ｄ）５
４、１１９、１３８、１４８若しくは１９５位、（ｅ）
２４７位、（ｆ）１２４位、（ｇ）１０７位、（ｈ）２
５６位、（ｉ）２５７位又はこれに相当する位置のアミ
ノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；（ａ）位置：グルタミン、アスパラギン酸、セリン、グ
ルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオ
ニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン
残基、（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルア
ラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イ
ソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、ト
リプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチ
ジン、プロリン又はアラニン残基、（ｃ）位置：チロシン、トリプトファン、アラニン、ア
スパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイ
シン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グ
ルタミン、メチオニン又はシステイン残基、（ｄ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラ
ニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリ
ン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオ
ニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニ
ン又はシステイン残基、（ｅ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラ
ニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリ
ン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、グ
ルタミン、メチオニン又はシステイン残基、（ｆ）位置：アラニン又はリジン残基、（ｇ）位置：リジン、アルギニン、アラニン又はセリン
残基、（ｈ）位置：グルタミン残基、（ｉ）位置：バリン又はイソロイシン残基、から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ。
【請求項２】配列番号１に示すアミノ酸配列又はこれ
と６０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアル
カリプロテアーゼにおいて、配列番号１の（ａ）６６若
しくは２６４位、（ｂ）５７、１０１〜１０６、１３
６、１９３若しくは３４２位、（ｃ）４６若しくは２０
５位、（ｄ）５４、１１９、１３８、１４８若しくは１
９５位、（ｅ）２４７位、（ｆ）１２４位、（ｇ）１０
７位、（ｈ）２５６位、（ｉ）２５７位又はこれに相当
する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；（ａ）位置：グルタミン、アスパラギン酸、セリン、グ
ルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオ
ニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン
残基、（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルア
ラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イ
ソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、ト
リプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチ
ジン、プロリン又はアラニン残基、（ｃ）位置：チロシン、トリプトファン、アラニン、ア
スパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイ
シン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グ
ルタミン、メチオニン又はシステイン残基、（ｄ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラ
ニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリ
ン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオ
ニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニ
ン又はシステイン残基、（ｅ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラ
ニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリ
ン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、グ
ルタミン、メチオニン又はシステイン残基、（ｆ）位置：アラニン又はリジン残基、（ｇ）位置：リジン、アルギニン、アラニン又はセリン
残基、（ｈ）位置：グルタミン残基、（ｉ）位置：バリン又はイソロイシン残基、から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ。
【請求項３】配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％
以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロ
テアーゼが、配列番号２〜７から選ばれるアミノ酸配列
を有する請求項２記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項４】請求項１〜３記載のアルカリプロテアー
ゼをコードする遺伝子。
【請求項５】請求項４記載の遺伝子を含有する組換え
ベクター。
【請求項６】請求項５記載の組換えベクターを含有す
る形質転換体。
【請求項７】宿主が微生物である請求項６記載の形質
転換体。