JPH09255A - 変異型サーモリシンｙｔ７３及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】サーモリシンに比し温度活性、至適ｐＨ、基質
特異性等に優れ、工業的利用面で、反応効率、合成速
度、蛋白質の分解限度の向上等を計り得る、変異型サー
モリシン及びこれをコードする遺伝子を提供する。 【解決手段】配列番号：１で表わされ、サーモリシンの
アミノ酸配列の７３番目のアラニン残基が、バリン残基
に置換されている変異型サーモリシンＹＴ７３、配列番
号：１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む変異
型サーモリシンＹＴ７３遺伝子、特に配列番号：２の塩
基配列を有する上記遺伝子、並びに上記変異型サーモリ
シンＹＴ７３を用いてアスパルテームを製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規な変異型サーモ
リシンＹＴ７３、その遺伝子及び該酵素を利用した有用
なジペプチドの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】バチルス・サーモプロテォリティカス・
ロッコ〔Bacillus thermoproteolyticus Rokko, Endo,
S., J.Fermentation Tech.,40, 346-353 (1962)〕由来
の中性プロテアーゼであるサーモリシンは、３１６アミ
ノ酸残基からなるポリペプチドの三次元構造を有するこ
とが知られており〔B.W. Matthews, et al., Nature, 2
38, 37-41 (1972)〕、該酵素を構成する蛋白質の完全な
アミノ酸配列も知られており〔Titani et al., Nature,
238, 35-37 (1972)〕、また該ポリペプチドをコードす
る遺伝子及びそのプレ・プロ配列も明らかにされている
〔例えば特開平３−２３２４９４号公報等参照〕。

【０００３】上記酵素は、例えば人工甘味料アスパルテ
ーム（α−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニン）
の合成等の食品分野を始めとして、洗剤、化粧品分野等
において有用なものであるが、その有用性を向上させ、
利用分野を更に拡大させるためには、該酵素の基質特異
性、至適ｐＨ、物理的安定性等の諸性質の改善が必要と
なり、この改善は、該酵素蛋白質のアミノ酸配列の改変
によってなされることが好ましい。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記観
点より鋭意研究を重ねてきたが、その過程で先に、上記
酵素の生産菌を変異処理して得られる各種の変異株の内
に、親株と対比して基質特異性が大きく変化しており、
温度安定性や、大豆蛋白等の分解産物の性質、特に苦み
等の点でより優れた酵素を生産し得る変異株が存在する
ことを見出すと共に、該変異株の産生する酵素をコード
する遺伝子を単離し、その塩基配列及びこれによりコー
ドされるアミノ酸配列を解析するに成功し、この知見に
基づく発明を完成した（特願平６−４２１９５号）。

【０００５】本発明者らは、上記に引き続く研究の結
果、同様の変異株の内に、親株と対比して特定の合成ペ
プチド、例えばα−ＡＰＭ（α-L-aspartyl-L-phenylal
aninemethyl ester）の前駆体であるＺ−ＡＰＭ（carbo
benzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester）
やＦＡＧＬＡ（Fur-Gly-Leu-NH₂ ，Furylacryloyl-glyc
yl-L-leucine amide）の分解活性が著しく向上してお
り、且つ至適ｐＨや温度活性等の点でも優れた性質に改
変された酵素を生産し得る変異株の存在を見出し、該変
異株の産生する酵素をコードする遺伝子（塩基配列）及
びこれによりコードされるアミノ酸配列の解析、同定に
成功した。また、本発明者らは上記変異株の産生する改
変された酵素の利用によれば、アスパルテームの合成を
より有利に実施できることを見いだした。本発明は、か
かる知見により完成されたものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
配列番号：１で表わされ、サーモリシンのアミノ酸配列
の７３番目のアラニン残基がバリン残基に置換されてい
ることを特徴とする変異型サーモリシンＹＴ７３、配列
番号：１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む変
異型サーモリシンＹＴ７３の遺伝子（以下「本発明遺伝
子」という）、殊に配列番号：２の塩基配列を有する上
記遺伝子、並びにベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−
アスパラギン酸及びＬ−フェニルアラニンメチルエステ
ルを含有する基質溶液と上記変異型サーモリシンＹＴ７
３とを接触させることを特徴とするベンジルオキシカル
ボニル−α−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステルの製造方法が提供される。

【０００７】本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩
基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵ
Ｂの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等
の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分
野における慣用記号に従うものとする。

【０００８】本発明遺伝子は、上記変異型サーモリシン
ＹＴ７３構成蛋白質のアミノ酸をコードしており、該蛋
白質の遺伝子工学的手法による製造に利用でき、また該
酵素の研究や更なる改変等に有用である。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明遺伝子の単離は、一般的遺
伝子工学手法により、代表的には例えば本発明遺伝子を
含む目的酵素生産菌よりゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲ
法〔ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法、Saiki,
R.K. et al., Science, 239, 487-491(1988) 〕を利用
して、直接クローニングする方法により実施することが
できる。該ＰＣＲ法における各操作はいずれも公知の方
法に従うことができる。

【００１０】例えば、プライマーの調製は、ホスホアミ
ダイト法等に従うことができ、ＤＮＡの単離精製は、ア
ガロースゲル電気泳動法に従うことができ、本発明遺伝
子のＤＮＡ配列の決定は、ジデオキシ法〔Sanger,F. e
t. al., Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A., 74, 5463-5467
(1977)〕等や市販のシークエンスキットを用いる方法
等に従うことができる。

【００１１】また、目的遺伝子の選出方法としては、サ
ザンハイブリダイゼーション法やドットハイブリダイゼ
ーション法〔何れもSouthern,E.M., J.Mol.Biol., 98,
503-517 (1975)〕等を採用できる。その他ＤＮＡを取扱
う各種の遺伝子工学的手法は、いずれもモレキュラーク
ローニング〔Maniatis,T., Fritsch,E.F. and Sambroo
k,J., Molecular Cloning A Laboratory Manual/second
edition, Cold SpringHarbor Laboratory N.Y. (198
8)〕に従い実施できる。

【００１２】また本発明遺伝子は、その遺伝情報に基い
て、これを例えばホスファイト・トリエステル法（Natu
re, 310, 105 (1984) ）等の常法に従って化学合成する
こともでき、更に公知の確立されたサーモリシン遺伝子
やその前駆体をコードする遺伝子を利用して、上記遺伝
情報に従ってこれらをサイトスペシフィック・ミュータ
ジェネシス等に従い改変する方法等によっても製造する
ことができる。

【００１３】かくして得られる本発明遺伝子は、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列を有すること、殊に該アミノ酸配列において、成熟サ
ーモリシン蛋白のＮ末端アミノ酸Ile を第１番目として
数えて７３番目のAla がValに置換されたアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ配列（即ち、ＧＣＴがＧＴＴに変異
されたＤＮＡ）を有していることにより特徴付けられ
る。

【００１４】より詳しくは、これは配列番号：２で表わ
されるＤＮＡ配列を有している。即ち、本発明遺伝子は
２００９ベースの長さを持ち、サーモリシン遺伝子と同
じ１６４４ベース（５４８アミノ酸残基に相当）からな
る一つの大きなオープンリーディングフレーム（２８８
位〜１９３１位）を有している。該リーディングフレー
ム中、成熟サーモリシンＹＴ７３遺伝子は、９８４位〜
１９３１位に存在し、その上流の配列は、プレ配列及び
プロ配列（全２３２アミノ酸残基に相当）である。ま
た、上記配列番号：２に示すＤＮＡ配列中、１９４５位
〜１９７５位は目的遺伝子のターミネーター構造である
と考えられる。

【００１５】本発明遺伝子は、これを利用して遺伝子組
換え技術により、変異型サーモリシンＹＴ７３を製造で
きる。より詳しくは、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現
できるような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に
導入して形質転換し、該形質転換株を培養することによ
り、所望酵素を収得でき、該酵素は常法に従って、例え
ば塩析法、遠心分離法、浸透圧ショック法、超音波破砕
法、限外濾過法、ゲル濾過法、吸着クロマトグラフィー
法、イオン交換クロマトグラフィー法、高速液体クロマ
トグラフィー法等により分離、精製できる。

【００１６】かくして得られる本発明酵素、即ち変異型
サーモリシンＹＴ７３は、前記したように、そのアミノ
酸配列中７３番目のアミノ酸残基がVal であることに基
いて、該アミノ酸残基がAla であるサーモリシンとは異
なり且つ該サーモリシンからは予期できない立体構造を
とり、これに基いてサーモリシンとは顕著に異なる特有
の基質特異性、即ちＺ−ＡＰＭやＦＡＧＬＡの分解活性
が高く、これに基づいてこれらの合成能も顕著に向上し
ており、また至適ｐＨや温度活性の優れた特徴を有し、
これらの点で工業的利用により適しており、例えばアス
パルテームの合成を例にとっても、その反応効率の上
昇、反応時間の短縮などを可能とするものであり、ま
た、蛋白質の分解限度の向上等をも計り得る利点があ
る。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため本発
明に係わる変異型サーモリシンＹＴ７３及びその遺伝子
の製造例を実施例として挙げる。

【００１８】

【実施例１】本例においては、サーモリシン生産菌であ
るバチルス・サーモプロテォリティカス・ロッコ、その
変異株である変異型サーモリシンＹＴ７３生産菌、シー
クエンス用宿主菌であるエッシェリヒア・コリー（E.co
li JM109）及びシークエンスようファージベクターであ
るＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９をそれぞれ使用し
た。

【００１９】既にクローニングされ塩基配列の決定され
ているサーモリシン遺伝子（ドイツ特許DE3929531A1 参
照）の塩基配列を参考にして、ＰＣＲ用プライマーとし
て、下記表１に示す塩基配列のＰＮ及びＰＣを、ファル
マシア社製ＤＮＡ合成機ジーンアセンブラープラスを用
いてホスホアミダイト法により合成した。

【００２０】

【表１】

【００２１】尚、ＰＮは制限酵素Eco RI切断点を、また
ＰＣはXba I切断点をそれぞれ有するように設計した。

【００２２】上記２種のプライマーを用い、変異型サー
モリシンＹＴ７３生産菌に由来する染色体ＤＮＡを鋳型
として、ＰＣＲ法を実施した。該ＰＣＲ法は、ＰＣＲ用
反応液としてジーンＡＭＰ ＰＣＲリエージェントキッ
ト（Gene AMP PCR Reagent kit, 宝酒造社製）を、温度
コントローラーとしてアステック社製ＰＣ−７００をそ
れぞれ使用して、９２℃１分、５５℃２分及び７２℃３
分を１サイクルとして、３０サイクルにて実施した。

【００２３】上記ＰＣＲ反応により生じた産物をアガロ
ースゲル電気泳動により観察して、所望の２ｋｂ前後の
大きさをもつＤＮＡバンドを確認した。尚この時、他に
マイナーなバンドは観察されなかった。

【００２４】上記ＰＣＲ断片をアガロースゲルから、抽
出、精製し、直接シークエンスの試料とした。

【００２５】上記試料につき、ジデオキシシークエンス
法〔Sanger,F., et al., Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.
A., 74, 5463-5467 (1977)〕により、シークエンス反応
を行なって塩基配列を決定した。この反応は、オートリ
ードシークエンスキット（ファルマシア社製）を用い
て、蛍光標識されたＭ１３ユニバーサルプライマー及び
サーモリシン遺伝子の塩基配列を参考にして作成した合
成プライマーからＴ７ＤＮＡポリメラーゼにより反応を
開始し、次いで該反応により合成されたＤＮＡ断片をフ
ァルマシア社製ＤＮＡシークエンサー（A.L.F. DNA Seq
uencer）を用いて解読した。

【００２６】上記シークエンス法において、最初にＰＣ
Ｒ断片を各種制限酵素により切断して得られた簡単な制
限酵素地図を図１に示す。また図１には、上記シークエ
ンス法に採用したシークエンス ストラテジィーを併記
する。

【００２７】上記ストラテジィーに従い決定されたサー
モリシンＹＴ７３遺伝子の塩基配列は、配列表に配列番
号：２として示す通りである。

【００２８】該配列表より、本発明遺伝子は、その５′
端側及び３′端側にそれぞれ開始コドンＡＴＧ及び終止
コドンＴＡＡを有し、且つ１６４４ベース（５４８アミ
ノ酸残基に相当）の長いオープンリーディングフレーム
を有することが確認された。また、該遺伝子の有するプ
ロモーター領域、シグナル配列及びプレ・プロ領域は、
既に報告されているサーモリシン遺伝子と同一の塩基配
列を有することも確認された。

【００２９】成熟サーモリシン蛋白をコードする遺伝子
領域においては、サーモリシンＹＴ７３遺伝子が該サー
モリシン遺伝子と異なる箇所は唯一つであり、これはＣ
がＴに置換されたもので、その結果、サーモリシンの７
３番目（成熟サーモリシン蛋白のＮ末端アミノ酸Ile を
第１番目として）のAla がVal に置換する変異が認めら
れた。

【００３０】上記７３番目のAla は、サーモリシンの活
性中心付近に存在するアミノ酸残基であり、その位置
（７３）は、サーモリシンがプロテアーゼとして作用す
るための機能に関与する共通領域内にあり、該Ala 73は
該酵素の重要なアミノ酸残基と考えられたのに対して、
該Ala 73をVal に置換した本発明酵素は、実に驚くべき
ことに、サーモリシンの活性を維持保有し、しかも、上
記位置のアミノ酸残基の置換（変異）に基いて、予期で
きない立体構造上の変化を受け、これに基いてサーモリ
シンとは顕著に異なる基質特異性、即ち、例えばＺ−Ａ
ＰＭやＦＡＧＬＡ等の特定合成ペプチドの分解活性が著
しく高い特性、及びこれらペプチドの合成活性も同様に
高い特徴を有し、また至適ｐＨや温度活性においても優
れた性質を付与された（改変）のである。

【００３１】以下、本発明の変異型サーモリシンＹＴ７
３の有する特有の基質特異性等につき、これをサーモリ
シンと比較検討した試験例を挙げる。

【００３２】尚、各例において用いた変異型サーモリシ
ンＹＴ７３及びサーモリシンは、之等の生産菌を用い
て、遠藤の方法〔Endo,S., J.Fermentation Tech., 40,
346-353 (1962) 〕によって調製した。

【００３３】

【試験例１】 温度−活性試験 （１）試験方法 口径１８ｍｍ試験管に０．５６％カゼイン溶液（０．０
６７Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．２）３．６ｍｌを秤取
り、恒温槽（３５〜８０℃）で１０分間予熱した。これ
にサーモリシン及びサーモリシンＹＴ７３の１〜７ｐＵ
／ｍｌ溶液（２ｍＭ硫酸カルシウム、８ｍＭ酢酸カルシ
ウム、１０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０）０．４ｍｌ
を吹き込んで直ちに振り混ぜた。正確に１０分後、反応
停止液６ｍｌ（トリクロル酢酸１．８ｇ、無水酢酸ナト
リウム１．８ｇに６Ｎ酢酸５．５ｍｌ及び水を加えて溶
かし１００ｍｌとする）を加えて振り混ぜ、更に２０分
間放置した。この液をＮｏ．６の濾紙を用いて濾過後、
濾液の吸光度（２７５ｎｍ）を測定した。

【００３４】ブランクとしては、口径１８ｍｍ試験管に
供試酵素液０．４ｍｌ、反応停止液６ｍｌをはかり取り
よく振り混ぜた後、０．５６％カゼイン溶液３．６ｍｌ
を加えて振り混ぜ、恒温槽にて２０分間放置し、以下同
様に操作して２７５ｎｍにおける吸光度を測定した。

【００３５】酵素単位（ＰＵ）は、乳製カゼインに３５
℃で作用させた時の反応初期の１分間に１μｇのチロジ
ンを遊離する酵素量を１ＰＵと定義する。

【００３６】（２）結果 得られた結果を図２に示す。

【００３７】図において横軸は反応温度（℃）を、縦軸
は各酵素の３５℃での活性を１００とした場合の相対活
性（％）を示し、図中、（１）は本発明変異型サーモラ
イシンＹＴ７３を、（２）はサーモライシンを示す。

【００３８】該図より、変異型サーモリシンＹＴ７３
は、サーモリシンに比べてより温度−活性の点で優れた
ものであることが明らかである。

【００３９】

【試験例２】 ｐＨ活性試験 （１）試験方法 口径１５ｍｍ試験管に供試酵素液１ｍｌを秤取り、３５
℃の恒温水槽中に５分間放置した後、予め３５℃に保温
してある１％ゼイン溶液１ｍｌ（１００ｍＭBritton-Ro
binson広域緩衝液にて所定ｐＨに調節）を量って加え、
直ちに振り混ぜた。この液を３５℃で正確に１０分間放
置し、トリクロル酢酸溶液３ｍｌ（トリクロル酢酸１．
８ｇ及び無水酢酸ナトリウム１．８ｇに６Ｎ酢酸５．５
ｍｌ及び水を加えて溶かし１００ｍｌとしたもの）を加
えて振り混ぜ、更に３５℃で３０分間放置した後、濾紙
を用いて濾過した濾液の吸光度（２７５ｎｍ）を測定し
た。

【００４０】ブランクとしては、供試酵素液１ｍｌを試
験管に量り取り、トリクロル酢酸溶液３ｍｌを加えて振
り混ぜ、次に１％カゼイン溶液１ｍｌを加えて振り混ぜ
た後、３５℃で３０分間放置し、以下同様に操作して２
７５ｎｍにおける吸光度を測定した。

【００４１】（２）結果 得られた結果を図３に示す。

【００４２】図３において横軸はｐＨを、縦軸は各酵素
の相対活性（％）を示し、図中、（１）は本発明変異型
サーモライシンＹＴ７３を、（２）はサーモライシンを
示す。

【００４３】該図より、変異型サーモリシンＹＴ７３
は、サーモリシンに比べ、反応の至適ｐＨがアルカリ側
に約１変化していることが判る。

【００４４】

【試験例３】 ペプチド分解試験 口径１５ｍｍ試験管に基質溶液（１０ｍＭトリスマレイ
ン酸緩衝液、ｐＨ８．０に各ペプチドを２ｍＭとなるよ
うに溶解した液）０．５ｍｌを秤取り、３５℃で５分間
放置した後、供試酵素液０．５ｍｌを量って加え、直ち
に振り混ぜた。この液を３５℃で正確に２０分間放置
し、１Ｍ酢酸０．５ｍｌを加え、続いて２Ｎ ＮａＯＨ
０．２ｍｌを加えた後、ニンヒドリン溶液を加えた。１
００℃、１５分間処理後、５０％エタノール２ｍｌを加
えて、５７０ｎｍの吸光度を測定した。

【００４５】ブランクとしては、供試酵素液と１Ｍ酢酸
の添加順序を逆にする以外は上記と同様にして、５７０
ｎｍにおける吸光度を測定した。

【００４６】（２）結果 下記４種のペプチドを基質として利用して得られた結果
を表２に示す。 基質１…Ｚ−ＡＰＭ（Carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phen
ylalanine methyl ester） 基質２…Ｚ−ＦＹＬ（Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-
tyrosyl-L-leucine ） 基質３…Ｚ−ＧＰＬＧＰ（Carbobenzoxy-glycyl-L-prol
yl-L-leucyl-glycyl-L-proline） 基質４…ＦＡＧＬＡ（Furylacryloyl-glycyl-L-leucine
amide）

【００４７】

【表２】

【００４８】該表より、変異型サーモリシンＹＴ７３
は、サーモリシンに比べ、試験した４種のペプチドにお
いて、４〜１５倍の分解速度を示すことが明らかであ
る。

【００４９】

【試験例４】 アスパルテームの合成 （１）アスパルテーム合成試験方法 ０．５ｍｌの基質溶液（ベンジルオキシカルボニル−α
−Ｌ−アスパラギン酸の終濃度３６．４ｍＭ及びＬ−フ
ェニルアラニンメチルエステル・塩酸塩の等量（３６．
４ｍＭ）を１０規定ＮａＯＨにてｐＨ６．５に調整した
もの）に、サーモライシン又は本発明変異型サーモライ
シンＹＴ７３精製酵素溶液の０．５ｍｌを加えて混合
し、４０℃の水浴上で酵素反応を行なわせた。

【００５０】上記反応開始より、１、２、３、４、５、
７、１０及び１８時間後に、それぞれの反応液よりその
一部（０．５ｍｌ）を取り出し、１．０ｍｌの２０ｍＭ
ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、それぞれのサンプ
ルを、０．５Ｍの酢酸（ＮａＯＨでｐＨ６．０に調整し
たもの）で５倍に希釈し、高速液体クロマトグラフィー
にて分析を行ない、Ｚ−ＡＰＭの標準物質を用いて、酵
素反応によって合成された各時間におけるＺ−ＡＰＭ量
を定量した。

【００５１】（２）結果 得られた結果を図４に示す。

【００５２】図において、横軸は反応時間（時間）を、
縦軸はＺ−ＡＰＭ合成量をその相対値（３６．４ｍＭに
相当するＺ−ＡＰＭ合成量を１．０としたときの相対
値）にて示したものである。また、図中、（１）は本発
明変異型サーモリシンＹＴ７３を、（２）はサーモリシ
ンを示す。

【００５３】該図より、本発明変異型サーモリシンＹＴ
７３及びサーモリシンは、共に１８時間の合成反応時間
で平衡に達すると考えられるが、その時のＺ−ＡＰＭ合
成量（相対値：０．４７）の半量、即ち０．２３５のＺ
−ＡＰＭ合成量に達する反応時間（１／２Ｔ）を該図か
ら求めると、サーモリシンでは約３．９時間であるのに
対して、本発明変異型サーモリシンでは約１．３時間で
あり、このことから、本発明変異型サーモリシンの利用
によれば、サーモリシンに比べて、Ｚ−ＡＰＭの合成時
間を約１／３に短縮できることが明らかとなった。

【配列表】

【００５４】配列番号：１ 配列の長さ：３１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp 1 5 10 15 Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp 20 25 30 Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr 35 40 45 Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala 50 55 60 Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Val His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr 65 70 75 80 Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn 85 90 95 Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn 100 105 110 Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln 115 120 125 Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu 130 135 140 Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu 145 150 155 160 Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val 165 170 175 Glu Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val 180 185 190 Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro 195 200 205 Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr 210 215 220 Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 225 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val 245 250 255 Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr 260 265 270 Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala 275 280 285 Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala 290 295 300 Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys 305 310 315

【００５５】配列番号：２ 配列の長さ：２００９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Genomin DNA 起源：バチルス属変異型サーモリシンＹＴ７３ 配列の特徴 特徴を表す記号：sg peptide 存在位置：288..983 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：984..1931 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TACGAATTCT CATTGGTAGT 20 GACCAAGAAC CAAAATATGT GGCAAAAGAC GAACATCCGC CTCCAACCAT CATCATTGCA 80 GCGAAAGATG AACATCCACC AGCAACGATT ATTTGAAGAG GAATAAGCAA AAAGACAGCT 140 AGTTTTCTAG CTGTCTTTTT TCATGCATAG GAAAATGTGA AAAAAACGTA GGGAATTATC 200 AACTATATCA GACTCTATTT TTCCCAATAC AAATACTGTA AATATTGTGT TAATATTCTA 260 AATACAAAGA ATAAAGGAGG ATGAAAA ATG AAA ATG AAA ATG AAA TTA GCA 311 Met Lys Met Lys Met Lys Leu Ala -232 -230 -225 TCG TTT GGT CTT GCA GCA GGA CTA GCG GCC CAA GTA TTT TTA CCT TAC 359 Ser Phe Gly Leu Ala Ala Gly Leu Ala Ala Gln Val Phe Leu Pro Tyr -220 -215 -210 AAT GCG CTG GCT TCA ACG GAA CAC GTT ACA TGG AAC CAA CAA TTT CAA 407 Asn Ala Leu Ala Ser Thr Glu His Val Thr Trp Asn Gln Gln Phe Gln -205 -200 -195 ACC CCT CAA TTC ATC TCC GGT GAT CTG CTG AAA GTG AAT GGC ACA TCC 455 Thr Pro Gln Phe Ile Ser Gly Asp Leu Leu Lys Val Asn Gly Thr Ser -190 -185 -180 CCA GAA GAA CTC GTC TAT CAA TAT GTT GAA AAA AAC GAA AAC AAG TTT 503 Pro Glu Glu Leu Val Tyr Gln Tyr Val Glu Lys Asn Glu Asn Lys Phe -175 -170 -165 AAA TTT CAT GAA AAC GCT AAG GAT ACT CTA CAA TTG AAA GAA AAG AAA 551 Lys Phe His Glu Asn Ala Lys Asp Thr Leu Gln Leu Lys Glu Lys Lys -160 -155 -150 -145 AAT GAT AAC CTT GGT TTT ACG TTT ATG CGC TTC CAA CAA ACG TAT AAA 599 Asn Asp Asn Leu Gly Phe Thr Phe Met Arg Phe Gln Gln Thr Tyr Lys -140 -135 -130 GGG ATT CCT GTG TTT GGA GCA GTA GTA ACT GCG CAC GTG AAA GAT GGC 647 Gly Ile Pro Val Phe Gly Ala Val Val Thr Ala His Val Lys Asp Gly -125 -120 -115 ACG CTG ACG GCG CTA TCA GGG ACA CTG ATT CCG AAT TTG GAC ACG AAA 695 Thr Leu Thr Ala Leu Ser Gly Thr Leu Ile Pro Asn Leu Asp Thr Lys -110 -105 -100 GGA TCC TTA AAA AGC GGG AAG AAA TTG AGT GAG AAA CAA GCG CGT GAC 743 Gly Ser Leu Lys Ser Gly Lys Lys Leu Ser Glu Lys Gln Ala Arg Asp -95 -90 -85 ATT GCT GAA AAA GAT TTA GTG GCA AAT GTA ACA AAG GAA GTA CCG GAA 791 Ile Ala Glu Lys Asp Leu Val Ala Asn Val Thr Lys Glu Val Pro Glu -80 -75 -70 -65 TAT GAA CAG GGA AAA GAC ACC GAG TTT GTT GTT TAT GTC AAT GGG GAC 839 Tyr Glu Gln Gly Lys Asp Thr Glu Phe Val Val Tyr Val Asn Gly Asp -60 -55 -50 GAG GCT TCT TTA GCG TAC GTT GTC AAT TTA AAC TTT TTA ACT CCT GAA 887 Glu Ala Ser Leu Ala Tyr Val Val Asn Leu Asn Phe Leu Thr Pro Glu -45 -40 -35 CCA GGA AAC TGG CTG TAT ATC ATT GAT GCC GTA GAC GGA AAA ATT TTA 935 Pro Gly Asn Trp Leu Tyr Ile Ile Asp Ala Val Asp Gly Lys Ile Leu -30 -25 -20 AAT AAA TTT AAC CAA CTT GAC GCC GCA AAA CCA GGT GAT GTG AAG TCG 983 Asn Lys Phe Asn Gln Leu Asp Ala Ala Lys Pro Gly Asp Val Lys Ser -15 -10 -5 ATA ACA GGA ACA TCA ACT GTC GGA GTG GGA AGA GGA GTA CTT GGT GAT 1031 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp 1 5 10 15 CAA AAA AAT ATT AAT ACA ACC TAC TCT ACG TAC TAC TAT TTA CAA GAT 1079 Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp 20 25 30 AAT ACG CGT GGA AAT GGG ATT TTC ACG TAT GAT GCG AAA TAC CGT ACG 1127 Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr 35 40 45 ACA TTG CCG GGA AGC TTA TGG GCA GAT GCA GAT AAC CAA TTT TTT GCG 1275 Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala 50 55 60 AGC TAT GAT GCT CCA GCG GTT GAT GTT CAT TAT TAC GCT GGT GTG ACA 1223 Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Val His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr 65 70 75 80 TAT GAC TAC TAT AAA AAT GTT CAT AAC CGT CTC AGT TAC GAC GGA AAT 1271 Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn 85 90 95 AAT GCA GCT ATT AGA TCA TCC GTT CAT TAT AGC CAA GGC TAT AAT AAC 1319 Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn 100 105 110 GCA TTT TGG AAC GGT TCG CAA ATG GTG TAT GGC GAT GGT GAT GGT CAA 1367 Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln 115 120 125 ACA TTT ATT CCA CTT TCT GGT GGT ATT GAT GTG GTC GCA CAT GAG TTA 1415 Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu 130 135 140 ACG CAT GCG GTA ACC GAT TAT ACA GCC GGA CTC ATT TAT CAA AAC GAA 1463 Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu 145 150 155 160 TCT GGT GCA ATT AAT GAG GCA ATA TCT GAT ATT TTT GGA ACG TTA GTC 1511 Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val 165 170 175 GAA TTT TAC GCT AAC AAA AAT CCA GAT TGG GAA ATT GGA GAG GAT GTG 1559 Glu Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val 180 185 190 TAT ACA CCT GGT ATT TCA GGG GAT TCG CTC CGT TCG ATG TCC GAT CCG 1607 Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro 195 200 205 GCA AAG TAT GGT GAT CCA GAT CAC TAT TCA AAG CGC TAT ACA GGC ACG 1655 Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr 210 215 220 CAA GAT AAT GGC GGG GTT CAT ATC AAT AGC GGA ATT ATC AAC AAA GCC 1703 Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 225 230 235 240 GCT TAT TTG ATT AGC CAA GGC GGT ACG CAT TAC GGT GTG AGT GTT GTC 1751 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val 245 250 255 GGA ATC GGA CGC GAT AAA TTG GGG AAA ATT TTC TAT CGT GCA TTA ACG 1799 Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr 260 265 270 CAA TAT TTA ACA CCA ACG TCC AAC TTT AGC CAA CTT CGT GCT GCC GCT 1847 Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala 275 280 285 GTT CAA TCA GCC ACT GAC TTG TAC GGT TCG ACA AGC CAG GAA GTC GCT 1895 Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala 290 295 300 TCT GTG AAG CAG GCC TTT GAT GCG GTA GGG GTG AAA TAAAGTGGTA 1941 Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys 305 310 315 TCTCATCAGT GGGGGATTTT TTCCTCCACT GATGTTTTGT TTGTGATCAA TGATGTCAGT 2001 CTAGATAG 2009

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１に従い得られる本発明遺伝子断片の制
限酵素地図及びシークエンス法に採用したシークエンス
ストラテジィーである。

【図２】本発明変異型サーモリシンＹＴ７３の温度−活
性試験の結果を示すグラフである。

【図３】本発明変異型サーモリシンＹＴ７３のｐＨ−活
性試験の結果を示すグラフである。

【図４】本発明変異型サーモリシンＹＴ７３を利用した
アスパルテーム（Ｚ−ＡＰＭ）合成時の合成量と時間と
の関係を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で表わされ、サーモリシンの
   アミノ酸配列の７３番目のアラニン残基がバリン残基に
   置換されていることを特徴とする変異型サーモリシンＹ
   Ｔ７３。
2. 【請求項２】配列番号：１のアミノ酸配列をコードする
   塩基配列を含む変異型サーモリシンＹＴ７３の遺伝子。
3. 【請求項３】配列番号：２の塩基配列を有する請求項２
   に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アス
   パラギン酸及びＬ−フェニルアラニンメチルエステルを
   含有する基質溶液と請求項１に記載の変異型サーモリシ
   ンＹＴ７３とを接触させることを特徴とするベンジルオ
   キシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニル
   アラニンメチルエステルの製造方法。