JP2015534820A - サーモリシンプロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 - Google Patents

サーモリシンプロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、セリンプロテアーゼ（サーモスリシン（thermoslysine））から産生されるセリンプロテアーゼ（サーモスリシン）変異体を提供する。具体的には、本発明は、基準セリンプロテアーゼと比較したときに１つ以上の置換を有する、セリンプロテアーゼ変異体を提供する。更に、本発明は、これらのセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、これらのセリンプロテアーゼ変異体のうちの少なくとも１種を含む、クリーニング組成物を提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年１１月５日出願の米国仮特許出願番号第６１／７２２、６６０号に基づく優先権にかかる利益を主張するものであって、前記公報はそのすべてが参照として本明細書に組み込まれる。
バチルス属は、産業上有用な酵素を数多く分泌するグラム陽性菌であって、これらの酵素は発酵により大量に安価に製造することができる。分泌されたバチルス属の酵素の例は、サブチリシンセリンプロテアーゼ、亜鉛含有中性プロテアーゼ、αアミラーゼ、及びセルラーゼである。バチルス属プロテアーゼは、繊維工業、洗濯業及び家内工業において広く用いられている（Ｇａｌａｎｔｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：１３９９〜１４２２頁、２００３年、及びＳｈｏｗｅｌｌ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｐａｒｔ Ｄ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｈｕｂｂａｒｄ（ｅｄ．），ＮＹ：Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ，２００６年）。微生物において見出されるプロテアーゼは、その触媒メカニズムに基づいて分類されて次の４グループに分けられる。すなわち、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ及びアスパルギン酸プロテアーゼ。セリンプロテアーゼはアルカリ性領域に至適ｐＨを有し、メタロプロテアーゼは中性付近で至適活性を有し、そしてシステインプロテアーゼは酸性領域に至適ｐＨを有する（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｖｏｌ．２，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈａｒｗｏｏｄ、１９８９年Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。セリンプロテアーゼは産業用酵素の技術分野において古くから既知であるが、特定の条件及び用途に適した工学操作されたプロテアーゼが今なお必要とされている。
本開示は、特に、サーモリシン酵素、サーモリシン酵素をコードする核酸、並びにその製造及び使用に関する組成物及び方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、親酵素サーモリシン酵素に対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、生産的位置で試験された改変のうち少なくとも７５％は、次の評価基準［すなわち、ａ）親酵素サーモリシン酵素に対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本（microswatch）の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、ｂ）親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、ｃ）親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに生産的位置が、２位、２６位、４７位、４９位、５３位、６５位、８７位、９１位、９６位、１０８位、１１８位、１２８位、１５４位、１７９位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２０９位、２１１位、２１７位、２１９位、２２５位、２３２位、２５６位、２５７位、２５９位、２６１位、２６５位、２６７位、２７２位、２７６位、２７７位、２８６位、２８９位、２９０位、２９３位、２９５位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０３位、３０５位、３０８位、３１１位、及び３１６位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、改変が、２位（Ｔ，Ｆ，Ｌ，Ｐ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ｑ，Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｋ，Ｍ）、２６位（Ｔ，Ｋ，Ｌ，Ｒ，Ｖ，Ｙ，Ｗ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｃ，Ｄ）、４７位（Ｒ，Ａ，Ｃ，Ｈ，Ｋ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｔ）、４９位（Ｔ，Ａ，Ｄ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｓ，Ｗ，Ｌ，Ｎ，Ｑ，Ｖ，Ｅ，Ｍ，Ｙ）、５３位（Ｓ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｑ，Ｔ，Ｗ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｎ，Ｖ，Ｃ，Ｌ）、６５位（Ｓ，Ｉ，Ｍ，Ｑ，Ｖ，Ｌ，Ｔ，Ｗ，Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｐ，Ｙ）、８７位（Ｖ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｉ，Ｓ，Ｐ，Ｒ，Ｔ，Ｃ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ，Ｙ）、９１位（Ｌ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｋ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ａ，Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ｙ）、９６位（Ｎ，Ｃ，Ｄ，Ｉ，Ｖ，Ｆ，Ｔ，Ｇ，Ｈ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｗ，Ｋ，Ｌ，Ｙ）、１０８位（Ｑ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ａ，Ｄ，Ｉ，Ｋ，Ｎ，Ｌ，Ｍ）、１１８位（Ｓ，Ｃ，Ｇ，Ｅ，Ａ，Ｄ，Ｍ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｖ）、１２８位（Ｑ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｓ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ａ，Ｌ，Ｙ）、１５４位（Ｇ，Ｌ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｄ，Ｉ，Ｗ，Ｃ，Ｎ，Ａ，Ｈ，Ｋ，Ｍ，Ｙ）、１７９位（Ｙ，Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｆ）、１９６位（Ｇ，Ｄ，Ｅ，Ｔ，Ｋ，Ｒ，Ｖ，Ｈ，Ｌ，Ｙ，Ａ，Ｗ）、１９７位（Ｉ，Ｄ，Ｋ，Ｌ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ａ，Ｈ，Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｒ，Ｆ，Ｃ）、１９８位（Ｓ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｋ）、１９９位（Ｇ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｌ，Ａ，Ｙ）、２０９位（Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｇ，Ｉ，Ｋ，Ｐ，Ｒ，Ｙ，Ｃ，Ｍ）、２１１位（Ｙ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｅ，Ｒ）、２１７位（Ｙ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｇ，Ａ，Ｆ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｌ）、２１９位（Ｋ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ａ，Ｅ，Ｒ，Ｓ）、２２５位（Ｑ，Ｄ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｍ，Ｒ，Ｃ，Ｅ，Ｋ，Ｌ，Ｓ）、２３２位（Ｉ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ，Ｇ，Ｌ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）、２５６位（Ｖ，Ｌ，Ｔ，Ｋ，Ａ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｒ，Ｓ，Ｎ）、２５７位（Ｇ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｙ，Ｋ，Ｒ）、２５９位（Ｇ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，Ｗ，Ｋ，Ｒ，Ｎ，Ｓ，Ｔ）、２６１位（Ｄ，Ａ，Ｎ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｓ）、２６５位（Ｋ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｒ，Ｎ）、２６７位（Ｆ，Ｅ，Ｇ，Ｎ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｃ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｔ，Ｙ）、２７２位（Ｔ，Ｅ，Ｌ，Ｖ，Ｗ，Ｐ，Ｙ，Ｃ，Ｆ，Ｎ，Ｑ，Ａ，Ｋ）、２７６位（Ｔ，Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｐ，Ｑ，Ｗ，Ｈ，Ａ，Ｌ，Ｖ，Ｙ）、２７７位（Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｎ，Ｒ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｄ，Ｙ）、２８６位（Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｓ，Ｐ，Ｃ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｙ）、２８９位（Ｖ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｎ，Ｓ，Ｗ，Ｒ，Ｔ，Ｌ，Ｍ，Ｙ，Ａ）、２９０位（Ｑ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｌ，Ｗ，Ｙ，Ｒ，Ｔ，Ｖ，Ａ，Ｈ，Ｎ）、２９３位（Ｔ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｑ，Ｓ，Ｎ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｙ）、２９５位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｎ，Ｔ，Ｖ，Ｆ，Ｇ，Ａ，Ｋ，Ｍ，Ｗ）、２９８位（Ｓ，Ｃ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｅ，Ｎ，Ｐ，Ａ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｒ）、２９９位（Ｔ，Ｃ，Ｆ，Ｌ，Ｍ，Ｒ，Ｗ，Ｐ，Ｄ，Ｑ，Ｎ，Ａ，Ｋ）、３００位（Ｓ，Ｃ，Ｋ，Ｍ，Ｒ，Ｙ，Ｉ，Ｌ，Ｈ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｄ，Ｎ）、３０１位（Ｑ，Ｅ，Ｈ，Ｐ，Ｒ，Ｌ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｗ，Ｍ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｋ）、３０３位（Ｖ，Ｃ，Ｈ，Ｇ，Ｋ，Ｌ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｐ，Ｙ）、３０５位（Ｓ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｗ，Ｙ，Ｑ，Ｈ，Ｔ，Ｖ，Ａ，Ｋ，Ｍ）、３０８位（Ｑ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｍ，Ｒ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ａ，Ｌ）、３１１位（Ｄ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ａ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｖ，Ｗ，Ｙ）、及び３１６位（Ｋ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｌ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ａ，Ｍ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、本発明は、親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、生産的位置で試験された改変のうち少なくとも４０％でかつ７５％未満はａ、ｂ及びｃ（上記参照）に挙げた評価基準のうち少なくとも一つを満たしており、並びに生産的位置が、１位、４位、１７位、２５位、４０位、４５位、５６位、５８位、６１位、７４位、８６位、９７位、１０１位、１０９位、１４９位、１５０位、１５８位、１５９位、１７２位、１８１位、２１４位、２１６位、２１８位、２２１位、２２２位、２２４位、２５０位、２５３位、２５４位、２５８位、２６３位、２６４位、２６６位、２６８位、２７１位、２７３位、２７５位、２７８位、２７９位、２８０位、２８２位、２８３位、２８７位、２８８位、２９１位、２９７位、３０２位、３０４位、３０７位、及び３１２位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、改変が、１位（Ｉ，Ｋ，Ｍ，Ｖ，Ａ，Ｈ，Ｗ，Ｙ，Ｃ，Ｌ）、４位（Ｔ，Ｅ，Ａ，Ｎ，Ｒ，Ｖ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｙ）、１７位（Ｑ，Ｉ，Ｗ，Ｙ，Ｃ，Ｒ，Ｖ，Ｔ，Ｌ）、２５位（Ｓ，Ｄ，Ｆ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｍ，Ｒ）、４０位（Ｆ，Ｅ，Ｇ，Ｍ，Ｑ，Ｓ，Ｙ，Ｗ，Ａ，Ｋ，Ｌ）、４５位（Ｋ，Ｅ，Ｌ，Ｓ，Ｆ，Ｈ，Ｑ，Ｙ，Ａ，Ｇ，Ｍ）、５６位（Ａ，Ｋ，Ｑ，Ｖ，Ｗ，Ｈ，Ｉ，Ｙ，Ｅ，Ｍ）、５８位（Ａ，Ｎ，Ｙ，Ｃ，Ｖ，Ｅ，Ｌ）、６１位（Ｑ，Ｍ，Ｒ，Ｗ，Ｆ，Ｖ，Ｃ，Ｉ，Ｌ）、７４位（Ｈ，Ｅ，Ｌ，Ｖ，Ｃ，Ｆ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ）、８６位（Ｎ，Ｌ，Ｓ，Ｙ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｋ，Ｄ）、９７位（Ｎ，Ｋ，Ｃ，Ｒ，Ｓ，Ｙ，Ｅ，Ｍ）、１０１位（Ｒ，Ｔ，Ｃ，Ｌ，Ｓ，Ｈ）、１０９位（Ｇ，Ａ，Ｌ，Ｓ，Ｅ，Ｍ，Ｒ，Ｗ）、１４９位（Ｔ，Ｍ，Ｖ，Ａ，Ｌ，Ｄ，Ｓ，Ｎ）、１５０位（Ｄ，Ａ，Ｆ，Ｋ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｓ）、１５８位（Ｑ，Ａ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｌ，Ｒ，Ｙ，Ｓ）、１５９位（Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｍ，Ｔ，Ｓ，Ｙ）、１７２位（Ｆ，Ｇ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ｄ，Ｈ）、１８１位（Ｎ，Ｌ，Ａ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｔ，Ｓ）、２１４位（Ｐ，Ｃ，Ｇ，Ｋ，Ｓ，Ｎ，Ａ，Ｒ）、２１６位（Ｈ，Ｃ，Ｅ，Ｓ，Ｔ，Ｒ，Ａ）、２１８位（Ｓ，Ｋ，Ｌ，Ｙ，Ｆ，Ｇ，Ｔ，Ｖ）、２２１位（Ｙ，Ｋ，Ｎ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ａ，Ｆ，Ｇ，Ｍ）、２２２位（Ｔ，Ｃ，Ｄ，Ｌ，Ｙ，Ｉ，Ｖ，Ａ，Ｍ，Ｋ）、２２４位（Ｔ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｌ，Ｐ，Ｑ，Ｖ，Ｙ，Ｅ，Ｈ）、２５０位（Ｈ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｖ，Ｙ）、２５３位（Ｖ，Ｎ，Ｔ，Ｉ，Ｒ，Ｙ，Ｍ，Ｑ）、２５４位（Ｓ，Ａ，Ｍ，Ｒ，Ｙ，Ｋ，Ｌ，Ｎ，Ｖ，Ｗ）、２５８位（Ｉ，Ｅ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｑ，Ｖ）、２６３位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｑ，Ｔ，Ｈ，Ｋ，Ｎ，Ｖ，Ａ，Ｍ）、２６４位（Ｇ，Ｃ，Ｒ，Ａ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ）、２６６位（Ｉ，Ａ，Ｆ，Ｌ，Ｓ，Ｃ，Ｍ，Ｔ，Ｖ）、２６８位（Ｙ，Ｍ，Ｑ，Ｖ，Ａ，Ｓ，Ｋ）、２７１位（Ｌ，Ａ，Ｄ，Ｆ，Ｉ，Ｎ，Ｙ，Ｈ）、２７３位（Ｑ，Ａ，Ｈ，Ｙ，Ｃ，Ｓ，Ｗ，Ｅ，Ｇ，Ｎ）、２７５位（Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｖ，Ｃ，Ｑ，Ｓ，Ｔ）、２７８位（Ｔ，Ｇ，Ｋ，Ｒ，Ｙ，Ｃ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｓ）、２７９位（Ｓ，Ａ，Ｄ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ｇ）、２８０位（Ｎ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｑ，Ｈ，Ｔ）、２８２位（Ｓ，Ｋ，Ｎ，Ｒ，Ａ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，Ｔ）、２８３（Ｑ，Ｋ，Ｌ，Ｐ，Ｒ，Ｗ，Ｙ，Ｓ）、２８７位（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｖ，Ｙ，Ｋ，Ｒ，Ｔ，Ｄ，Ｃ）、２８８位（Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｍ）、２９１位（Ｓ，Ｅ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｖ，Ａ，Ｔ）、２９７位（Ｇ，Ａ，Ｍ，Ｒ，Ｙ，Ｃ，Ｆ，Ｋ，Ｔ，Ｄ，Ｎ）、３０２位（Ｅ，Ｋ，Ｌ，Ｇ，Ｔ，Ｖ，Ｄ，Ｑ，Ａ）、３０４位（Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｅ，Ｋ，Ｙ）、３０７位（Ｋ，Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｉ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｒ，Ｗ，Ｙ，Ｈ）、及び３１２位（Ａ，Ｇ，Ｍ，Ｖ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｔ，Ｃ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン酵素変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、本発明は、親酵素サーモリシン酵素に対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、生産的位置で試験された改変のうち少なくとも１５％でかつ４０％未満はａ、ｂ及びｃ（上記参照）に挙げた評価基準のうち少なくとも一つを満たしており、そして生産的位置が、５位、９位、１１位、１９位、２７位、３１位、３３位、３７位、４６位、６４位、７３位、７６位、７９位、８０位、８５位、８９位、９５位、９８位、９９位、１０７位、１２７位、１２９位、１３１位、１３７位、１４１位、１４５位、１４８位、１５１位、１５２位、１５５位、１５６位、１６０位、１６１位、１６４位、１６８位、１７１位、１７６位、１８０位、１８２位、１８７位、１８８位、２０５位、２０６位、２０７位、２１０位、２１２位、２１３位、２２０位、２２７位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２４２位、２４４位、２４６位、２４８位、２４９位、２５２位、２５５位、２７０位、２７４位、２８４位、２９４位、２９６位、３０６位、３０９位、３１０位、３１３位、３１４位、及び３１５位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、改変が、５位（Ｓ，Ｄ，Ｎ，Ｐ，Ｈ，Ｌ）、９位（Ｖ，Ｌ，Ｔ，Ｉ）、１１位（Ｒ，Ｉ，Ｙ，Ｋ）、１９位（Ｎ，Ｌ，Ｙ，Ｋ，Ｓ）、２７位（Ｙ，Ｗ，Ａ，Ｍ，Ｖ，Ｃ，Ｌ）、３１位（Ｑ，Ａ，Ｋ，Ｖ，Ｉ，Ｃ，Ｙ）、３３位（Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｋ，Ａ，Ｃ，Ｌ，Ｍ）、３７位（Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｒ，Ｌ，Ｋ）、４６位（Ｙ，Ｌ，Ｈ，Ｎ，Ｃ）、６４位（Ａ，Ｈ，Ｑ，Ｔ，Ｄ，Ｅ）、７３位（Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｌ，Ｍ，Ｗ）、７６位（Ｙ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｔ）、７９位（Ｖ，Ｌ，Ｑ，Ｔ，Ａ，Ｎ，Ｓ）、８０位（Ｔ，Ｉ，Ｄ，Ａ，Ｌ，Ｎ）、８５位（Ｋ，Ｅ，Ａ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｓ）、８９位（Ｎ，Ｌ，Ｍ，Ｈ）、９５（Ｇ，Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｓ）、９８位（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｈ，Ｒ，Ｙ，Ｋ，Ｖ）、９９位（Ａ，Ｅ，Ｋ，Ｐ，Ｒ，Ｓ）、１０７位（Ｓ，Ｄ，Ｋ，Ｙ，Ａ，Ｇ）、１２７位（Ｇ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）、１２９位（Ｔ，Ｉ，Ｒ，Ｅ，Ｙ，Ｌ，Ｍ）、１３１位（Ｉ，Ｙ，Ｗ，Ｌ）、１３７位（Ｉ，Ｐ，Ａ，Ｅ，Ｔ，Ｖ，Ｌ）、１４１位（Ａ，Ｓ，Ｃ，Ｇ）、１４５位（Ｔ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｍ，Ｎ，Ｑ）、１４８位（Ｖ，Ｌ，Ｎ，Ｙ，Ｍ，Ａ，Ｑ）、１５１位（Ｙ，Ｋ，Ｇ，Ｈ，Ｓ，Ｗ）、１５２位（Ｔ，Ｓ，Ｌ，Ｍ，Ｇ）、１５５位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｍ）、１５６位（Ｉ，Ｍ，Ｔ，Ｌ，Ｑ）、１６０位（Ｅ，Ｌ，Ｙ，Ｑ）、１６１位（Ｓ，Ａ，Ｎ，Ｐ，Ｔ）、１６４位（Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｃ，Ａ）、１６８位（Ｉ，Ａ，Ｍ，Ｔ，Ｌ）、１７１位（Ｉ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｌ，Ｓ，Ｇ）、１７６位（Ｖ，Ｌ，Ｎ，Ｃ）、１８０位（Ａ，Ｅ，Ｇ，Ｋ，Ｔ，Ｓ）、１８２位（Ｋ，Ｌ，Ａ，Ｗ）、１８７位（Ｅ，Ｌ，Ｄ）、１８８位（Ｉ，Ｌ，Ｖ）、２０５位（Ｍ，Ｌ，Ａ，Ｖ，Ｑ）、２０６位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｒ）、２０７位（Ｄ，Ａ，Ｈ，Ｎ）、２１０位（Ｋ，Ｉ，Ｌ，Ｖ）、２１２位（Ｇ，Ｙ，Ａ，Ｄ，Ｑ）、２１３位（Ｄ，Ｎ，Ｓ，Ｌ，Ａ，Ｇ，Ｗ）、２２０位（Ｒ，Ｋ，Ｖ，Ａ）、２２７位（Ｎ，Ｄ，Ｌ，Ｙ，Ａ）、２３４位（Ｓ，Ｄ，Ｎ，Ａ，Ｃ）、２３５位（Ｇ，Ｍ，Ｃ，Ｑ，Ｓ，Ａ）、２３６位（Ｉ，Ｍ，Ａ，Ｃ）、２３７位（Ｉ，Ｎ，Ｆ，Ｍ）、２４２位（Ｙ，Ｃ，Ｆ，Ｎ，Ｖ）、２４４位（Ｉ，Ｔ，Ｖ，Ｆ，Ａ，Ｍ，Ｌ）、２４６位（Ｑ，Ｅ，Ｎ，Ｔ，Ｌ，Ｃ，Ｄ）、２４８位（Ｇ，Ａ，Ｅ，Ｓ）、２４９位（Ｔ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｌ，Ｙ，Ｐ）、２５２位（Ｇ，Ｋ，Ｙ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｗ）、２５５位（Ｖ，Ｌ，Ｐ，Ａ，Ｙ，Ｍ，Ｎ）、２７０位（Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｓ，Ｇ）、２７４位（Ｙ，Ｆ，Ｈ，Ａ，Ｃ，Ｑ，Ｔ，Ｍ）、２８４位（Ｌ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｍ，Ｙ）、２９４位（Ｄ，Ａ，Ｖ，Ｑ，Ｎ）、２９６位（Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｒ，Ｈ，Ｗ，Ｍ）、３０６位（Ｖ，Ａ，Ｓ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｔ）、３０９位（Ａ，Ｇ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｃ）、３１０位（Ｆ，Ａ，Ｃ，Ｗ，Ｍ）、３１３位（Ｖ，Ｔ，Ａ，Ｇ，Ｌ，Ｉ，Ｃ）、３１４位（Ｇ，Ａ，Ｅ，Ｈ，Ｍ，Ｓ，Ｗ，Ｑ）、及び３１５位（Ｖ，Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｍ，Ｌ，Ｔ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、本発明は、親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、生産的位置で試験された改変のうち少なくとも１つの改変でかつ１５％未満はａ、ｂ及びｃ（上記参照）に挙げた評価基準のうち少なくとも一つを満たしており、そして生産的位置が、３位、６位、７位、２０位、２３位、２４位、４４位、４８位、５０位、５７位、６３位、７２位、７５位、８１位、９２位、９３位、９４位、１００位、１０２位、１０３位、１０４位、１１０位、１１７位、１２０位、１３４位、１３５位、１３６位、１４０位、１４４位、１５３位、１７３位、１７４位、１７５位、１７８位、１８３位、１８５位、１８９位、１９３位、２０１位、２２３位、２３０位、２３８位、２３９位、２４１位、２４７位、２５１位、２６０位、２６２位、２６９位、及び２８５位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、改変が、３位（Ｇ，Ｙ）、６位（Ｔ，Ｃ，Ｖ）、７位（Ｖ，Ｌ，Ｉ）、２０位（Ｉ，Ｌ，Ｖ）、２３位（Ｔ，Ｆ，Ｗ）、２４位（Ｙ，Ｗ）、４４位（Ａ，Ｃ）、４８位（Ｔ，Ｅ，Ｄ）、５０位（Ｌ，Ｐ）、５７位（Ｄ，Ｋ）、６３位（Ｆ，Ｙ，Ｃ）、７２位（Ｄ，Ｆ，Ｗ）、７５位（Ｙ，Ａ）、８１位（Ｙ，Ｆ）、９２位（Ｓ，Ｌ）、９３位（Ｙ，Ｔ，Ｃ）、９４位（Ｄ，Ｔ）、１００位（Ｉ，Ｌ，Ｖ）、１０２位（Ｓ，Ｇ，Ｎ）、１０３位（Ｓ，Ｔ）、１０４位（Ｖ，Ａ）、１１０位（Ｙ，Ｌ）、１１７位（Ｇ，Ｈ）、１２０位（Ｍ，Ｌ）、１３４位（Ｓ，Ａ，Ｐ）、１３５位（Ｇ，Ａ）、１３６位（Ｇ，Ａ，Ｓ）、１４０位（Ｖ，Ｄ）、１４４位（Ｌ，Ｔ）、１５３位（Ａ，Ｔ）、１７３位（Ｇ，Ａ，Ｃ）、１７４位（Ｔ，Ｃ，Ａ）、１７５位（Ｌ，Ｈ，Ｓ）、１７８位（Ｆ，Ｈ，Ｙ）、１８３位（Ｎ，Ｓ）、１８５位（Ｄ，Ｅ）、１８９位（Ｇ，Ａ）、１９３位（Ｙ，Ｆ）、２０１位（Ｓ，Ｃ，Ａ）、２２３位（Ｇ，Ｄ，Ｋ）、２３０位（Ｖ，Ａ）、２３８位（Ｎ，Ｌ，Ｍ）、２３９位（Ｋ，Ａ）、２４１位（Ａ，Ｌ，Ｓ）、２４７位（Ｇ，Ａ，Ｓ）、２５１位（Ｙ，Ｍ）、２６０位（Ｒ，Ａ，Ｎ）、２６２位（Ｋ，Ａ）、２６９位（Ｒ，Ｖ，Ｋ）、及び２８５位（Ｒ，Ｋ，Ｙ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、本発明は、親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、改変は組み合わせ可能な活性を有する変異であって、組み合わせ可能な活性を有する位置で試験された改変のうち少なくとも１つの改変が、次の評価基準［すなわち、親酵素サーモリシンに対して、発現及び洗剤安定性又は熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、そして親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性に関する最小性能指数（ＰＩ）が１．５以上である、位置］を満たし、また、組み合わせ可能な活性を有する位置は、１７位、１９位、２４位、２５位、３１位、３３位、４０位、４８位、７３位、７９位、８０位、８１位、８５位、８６位、８９位、９４位、１０９位、１１７位、１４０位、１４１位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５６位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６８位、１７１位、１７４位、１７５位、１７６位、１７８位、１８０位、１８１位、１８２位、１８３位、１８９位、２０５位、２０６位、２０７位、２１０位、２１２位、２１３位、２１４位、２１８位、２２３位、２２４位、２２７位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４１位、２４４位、２４６位、２４８位、２４９位、２５０位、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、２５８位、２５９位、２６０位、２６１位、２６２位、２６６位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２７３位、２７４位、２７６位、２７８位、２７９位、２８０位、２８２位、２８３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、３００位、３０２位、３０６位、３１０位、及び３１２位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、改変が、１７位（Ｅ，Ｆ，Ｐ）、１９位（Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｉ，Ｒ，Ｔ，Ｖ）、２４位（Ｆ，Ｈ）、２５位（Ｈ）、３１位（Ｌ）、３３位（Ｑ）、４０位（Ｃ）、４８位（Ａ，Ｒ）、７３位（Ｙ）、７９位（Ｃ）、８０位（Ｃ，Ｒ）、８１位（Ｈ）、８５位（Ｃ，Ｍ，Ｙ）、８６位（Ｖ）、８９位（Ｋ，Ｒ，Ｔ，Ｖ）、９４位（Ｅ）、１０９位（Ｄ）、１１７位（Ａ，Ｋ，Ｒ，Ｔ）、１４０位（Ｓ）、１４１位（Ｔ）、１５０位（Ｅ，Ｍ，Ｗ）、１５１位（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｉ）、１５２位（Ｄ）、１５３位（Ｖ）、１５６位（Ｈ，Ｒ）、１５８位（Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｖ）、１５９位（Ｆ，Ｉ，Ｋ）、１６０位（Ｓ）、１６１位（Ｙ）、１６８位（Ｎ）、１７１位（Ｄ）、１７４位（Ｓ，Ｖ）、１７５位（Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ）、１７６位（Ｅ，Ｑ）、１７８位（Ｃ，Ｍ）、１８０位（Ｌ，Ｗ）、１８１位（Ｙ）、１８２位（Ｆ，Ｒ）、１８３位（Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｒ，Ｔ）、１８９位（Ｃ）、２０５位（Ｃ，Ｆ）、２０６位（Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）、２０７位（Ｔ）、２１０位（Ａ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｔ）、２１２位（Ｆ，Ｈ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ｔ）、２１３位（Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｖ，Ｙ）、２１４位（Ｑ）、２１８位（Ｒ）、２２３位（Ｙ）、２２４位（Ｉ，Ｒ）、２２７位（Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｋ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ）、２３５位（Ｄ，Ｌ，Ｔ）、２３６位（Ｐ）、２３７位（Ａ，Ｑ）、２３８位（Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｓ）、２３９位（Ｃ，Ｇ，Ｈ，Ｌ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｖ，Ｙ）、２４１位（Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｔ，Ｖ）、２４４位（Ｑ）、２４６位（Ｋ，Ｒ）、２４８位（Ｃ，Ｈ）、２４９位（Ｇ，Ｖ）、２５０位（Ｆ，Ｓ）、２５１位（Ｈ）、２５２位（Ｆ，Ｉ，Ｌ）、２５３位（Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｐ）、２５４位（Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ）、２５５位（Ｆ，Ｑ）、２５８位（Ｆ）、２５９位（Ｉ）、２６０位（Ｃ，Ｄ，Ｉ）、２６１位（Ｋ，Ｒ，Ｔ）、２６２位（Ｃ，Ｆ，Ｈ，Ｌ，Ｐ，Ｒ）、２６６位（Ｗ）、２６８位（Ｆ，Ｒ）、２６９位（Ｐ，Ｔ，Ｗ，Ｙ）、２７０位（Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｖ）、２７１位（Ｖ）、２７２位（Ｒ）、２７３位（Ｒ）、２７４位（Ｄ，Ｅ）、２７６位（Ｇ，Ｓ）、２７８位（Ｖ）、２７９位（Ｅ）、２８０位（Ｐ，Ｒ，Ｖ）、２８２位（Ｐ）、２８３位（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｔ，Ｖ）、２９４位（Ｔ）、２９５位（Ｒ）、２９６位（Ｅ，Ｉ）、２９７位（Ｉ，Ｖ）、３００位（Ｑ）、３０２位（Ｗ）、３０６位（Ｙ）、３１０位（Ｉ，Ｎ）、及び３１２位（Ｑ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、本発明は、親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、サーモリシン酵素変異体は、親酵素サーモリシンに比べて改善されたｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、又は洗剤安定性若しくは熱安定性を有しており、改変が、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列中の残基全てに関する主鎖平均温度因子よりも観測された分散の１．５倍分より大きい温度因子を有する位置で生じ、並びに残基位置が、１位、２位、１２７位、１２８位、１８０位、１８１位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２１１位、２２３位、２２４位、２９８位、２９９位、３００位、及び３１６位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、本発明は、親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、サーモリシン酵素変異体は、親酵素サーモリシンに比べて改善された洗剤安定性又は熱安定性を有しており、そして改変が、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列中の残基全てに関する主鎖平均温度因子よりも観測された分散の１．５倍分より大きい温度因子を有する位置で生じ、改変が、１位（Ｉ，Ｖ）、２位（Ｔ，Ｃ，Ｉ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｖ）、１２７位（Ｇ，Ｃ）、１２８位（Ｑ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｖ，Ｙ）、１８０位（Ａ，Ｅ，Ｎ）、１８１位（Ｎ，Ａ，Ｇ，Ｑ，Ｓ）、１９６位（Ｇ，Ｌ，Ｙ）、１９７位（Ｉ，Ｆ）、１９８位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）、２１１位（Ｙ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ）、２２４位（Ｔ，Ｄ，Ｈ，Ｙ）、２９８位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｗ，Ｙ）、２９９位（Ｔ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｗ）、及び３１６位（Ｋ，Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、本発明は、親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、改変が、サーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、生産的位置で試験された改変のうち少なくとも７５％は次の評価基準［すなわち、ａ）親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、ｂ）親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、ｃ）親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに生産的位置が、２、８７、９６、１９８、２７７、２９３、２９５、２９８及び３０１からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
１．更なる実施形態では、生産的位置が、２位（Ｔ，Ｆ，Ｌ，Ｐ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ｑ，Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｋ，Ｍ）、８７位（Ｖ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｉ，Ｓ，Ｐ，Ｒ，Ｔ，Ｃ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ，Ｙ）、９６位（Ｎ，Ｃ，Ｄ，Ｉ，Ｖ，Ｆ，Ｔ，Ｇ，Ｈ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｗ，Ｋ，Ｌ，Ｙ）、１９８位（Ｓ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｋ）、２７７位（Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｎ，Ｒ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｄ，Ｙ）、２９３位（Ｔ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｑ，Ｓ，Ｎ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｙ）、２９５位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｎ，Ｔ，Ｖ，Ｆ，Ｇ，Ａ，Ｋ，Ｍ，Ｗ）、２９８位（Ｓ，Ｃ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｅ，Ｎ，Ｐ，Ａ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｒ）、３０１位（Ｑ，Ｅ，Ｈ，Ｐ，Ｒ，Ｌ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｗ，Ｍ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｋ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、本発明は、親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、改変は生産的位置であり、生産的位置で試験された改変が次の評価基準［すなわち、親酵素サーモリシンに対して、発現、洗剤安定性、熱安定性、ＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄活性、又はＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性のパラメータのうち少なくとも３つに関する最小性能指数（ＰＩ）が１以上である、位置］を満たしており、並びに生産的位置は２７８位、２８３位、１８０位、２４４位、４８位及び６３位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
更なる実施形態では、生産的位置が、Ｔ２７８Ｒ、Ｑ２８３Ｅ、Ａ１８０Ｅ、Ｉ２４４Ｔ、Ｔ４８Ｅ及びＦ６３Ｃからなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、本発明は、親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、改変が、生産的位置で生じ、生産的位置で試験された改変のうち少なくとも１つの改変が、次の評価基準［すなわち、親酵素サーモリシン酵素に対して、発現、洗剤安定性、熱安定性、ＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄活性、又はＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性のパラメータの少なくとも全てに関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であるが、前記パラメータのうち一つ以下が０．８未満である、位置］を満たし、並びに生産的位置が、０１９位、０２５位、０２６位、０６３位、０９１位、０９６位、０９７位、１０１位、１０９位、１１８位、１３１位、１４０位、１５８位、１５９位、１７５位、１８０位、２１９位、２２５位、２３２位、２４４位、２４６位、２６１位、２７７位、２９３位、３００位、３０１位、３０１位、３０３位、３０５位、及び３１１位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
更なる実施形態では、生産的位置が、Ｎ０１９Ｄ、Ｓ０２５Ａ、Ｔ０２６Ｒ、Ｓ０６５Ａ、Ｌ０９１Ｍ、Ｎ０９６Ｑ、Ｎ０９６Ｒ、Ｎ０９６Ｙ、Ｎ０９７Ｋ、Ｒ１０１Ｍ、Ｇ１０９Ａ、Ｓ１１８Ａ、Ｉ１３１Ｌ、Ｖ１４０Ｄ、Ｑ１５８Ａ、Ｎ１５９Ｅ、Ｎ１５９Ｋ、Ｌ１７５Ｖ、Ａ１８０Ｒ、Ｇ１９６Ｔ、Ｇ１９６Ｙ、Ｋ２１９Ｓ、Ｑ２２５Ｅ、Ｉ２３２Ｒ、Ｉ２４４Ｌ、Ｑ２４６Ｄ、Ｄ２６１Ｎ、Ｐ２７７Ｇ、Ｔ２９３Ｙ、Ｓ３００Ｇ、Ｑ３０１Ｆ、Ｑ３０１Ｍ、Ｖ３０３Ｒ、Ｓ３０５Ａ、Ｄ３１１Ａからなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
一部の実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、Ｍ４ペプチダーゼである。一部の実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、ＭＡクランの一メンバーである。一部の実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃファミリーの一メンバーである。一部の実施形態では、変異体は、配列番号３で示されるサーモリシンと少なくとも５０％の同一性を有する。一部の実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、バチルス属、ゲオバチルス種、アリシクロバチルス属、乳酸桿菌、エクシグオバクテリウム属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、ヘルペトシフォン属、オセアノバチルス属、シュワネラ属、クロストリジウム属、ブドウ球菌属、フラボバクテリウム属、スチグマテラ属、ミクソコッカス属、ビブリオ属、メタノサルシナ属、クリセオバクテリウム属、ストレプトマイセス属、クリベラ属、ジャニバクター属、ノカルジオイデス属、ザンタモナス属（Xanthamonas）、ミクロモノスポラ属、バークホルデリア属、デハロコッコイデス属、クロセイバクター、コルジア属、マイクロシーラ属、サーモアクチノミセス属、クロロフレクサス属、リステリア属、プレシオシスチス属、ハリスコメノバクター属、サイトファーガ属、ハヘラ属、アルスロバクター属、ブラキバクテリウム属、クラビバクター属、マイクロバクテリウム属（Microbacterium）、イントラスポランギウム属、フランキア属、メイオテルムス属、シュードモナス属、トウゴマ属、カテヌリスポラ属、アナベナ属、ノストック属、ハロモナス属、クロモハロバクター属、ボルデテラ属、バリオボラックス属、ディケヤー属、ペクトバクテリウム属、シトロバクター属、エンテロバクター属、サルモネラ属、エルウィニア属、パントエア属、ラーネラ属、セラチア属、ゲオデルマトフィルス属、ゲンマタ属、ゼノラブダス属、フォトラブダス属、アスペルギルス属、ネオサルトリア属、ピレノフォラ属、サッカロポリスポラ属、ネクトリア属、ジベレラ属、メタリジウム属、ワドリア属、シアノセイス属、セルロファーガ属、プロビデンシア属、ブラディリゾビウム属、アグロバクテリウム属、ムシラジニバクター（Mucilaginibacter）、セラチア属、ソランジウム属、ストレプトスポランジウム属、レニバクテリウム属、アエロモナス属、レイネケア属、クロモバクテリウム属、モリテラ属、ハリアンギウム属、カンギエラ属、マリノモナス属、ビブリオナレス属、リストネラ属、サリニビブリオ属、フォトバクテリウム属、アルテロモナダーレス属、レジオネラ属、テレディニバクター属、レイネケア属、ヒドロゲニビルガ属、及びシュードアルテロモナス属からなる群から選択される一つの細菌属由来のものである。一部の実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、バチルス属、ゲオバチルス種、アリシクロバチルス属、乳酸桿菌、エクシグオバクテリウム属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、ヘルペトシフォン属、オセアノバチルス属、シュワネラ属、クロストリジウム属、ブドウ球菌属、フラボバクテリウム属、スチグマテラ属、ミクソコッカス属、ビブリオ属、メタノサルシナ属、クリセオバクテリウム属、及びシュードアルテロモナス属からなる群から選択される一つの細菌属由来のものである。一部の実施形態では、サーモリシン酵素は、バチルス属由来のものである。
一部の実施形態では、本発明は、先に挙げたような少なくとも１つの変異体を含むクリーニング組成物である。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、粒状、粉末、固形、棒状、液体、錠剤型、ゲル又はペースト組成物である。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、洗剤組成物である。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、洗濯洗剤組成物、食器用洗剤組成物、又は硬質表面クリーニング組成物である。一部の実施形態では、食器用洗剤は、食器手洗い用洗剤組成物又は自動食器洗浄用洗剤組成物である。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、洗濯洗剤組成物である。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、少なくとも１種の漂白剤を更に含む。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、リン酸塩を含まない。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、リン酸塩を含有する。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、少なくとも１種の追加の酵素を更に含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の追加の酵素は、アシルトランスフェラーゼ、αアミラーゼ、βアミラーゼ、αガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、βガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エクソマンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、βグルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼ、追加の酵素メタロプロテアーゼ酵素並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本発明は、先に挙げたようなクリーニング組成物を用いたクリーニング方法である。表面又は物品を、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体を少なくとも１種含むクリーニング組成物と接触させる工程を含む、クリーニング方法。一部の実施形態では、方法は、表面又は物品を、上述のクリーニング組成物と接触させる工程を含む。一部の実施形態では、前記表面又は物品をそれぞれ前記クリーニング組成物と接触させた後に、前記表面又は物品をすすぐ工程を含む。一部の実施形態では、物品は食器である。一部の実施形態では、物品は布である。一部の実施形態では、方法は、前記表面又は物品をそれぞれ前記クリーニング組成物と接触させた後に、前記表面又は物品をすすぐ工程を含む。一部の実施形態では、方法は、前記表面又は物品をすすいだ後に、前記表面又は物品を乾燥させる工程を含む。一部の実施形態では、方法は、上述のクリーニング組成物およびクリーニングが必要な表面又は物品を準備する工程と、クリーニング組成物を、クリーニングが必要な表面又は物品と、表面又は物品のクリーニングに適した条件下で接触させて、クリーニングされた表面又は物品を生じる工程と、を含む。一部の実施形態では、方法は、クリーニングされた表面又は物品をすすいで、すすがれた表面又は物品を生じる工程を含む。一部の実施形態では、方法は、すすがれた表面又は物品を乾燥する工程を更に含む。
ｐＨＰＬＴ−プロテイナーゼＴのプラスミドマップを表す。 メンバー数４２４のＭＥＲＯＰＳファミリーＭ４の系統樹を示している。Ｘ軸の位置は図２Ａが正しく、一方、図２Ｂ及び図２ＣのＸ軸は操作により移動している。 メンバー数４２４のＭＥＲＯＰＳファミリーＭ４の系統樹を示している。Ｘ軸の位置は図２Ａが正しく、一方、図２Ｂ及び図２ＣのＸ軸は操作により移動している。 メンバー数４２４のＭＥＲＯＰＳファミリーＭ４の系統樹を示している。Ｘ軸の位置は図２Ａが正しく、一方、図２Ｂ及び図２ＣのＸ軸は操作により移動している。
本発明は、改善されたメタロプロテアーゼ酵素、特に洗剤組成物に有用な酵素を提供する。具体的には、本発明は、親酵素メタロプロテアーゼと比べると、置換などの改変を１つ以上有するメタロプロテアーゼ酵素変異体を提供する。これは、酵素に改良を加えることにより、すなわち洗浄性能、洗剤組成物中での酵素の安定性及び／又は酵素の熱安定性を改善して洗浄サイクル中における酵素の有効性を増強することにより、達成することが可能である。本発明は、サーモリシンメタロプロテアーゼ酵素変異体が挙げられるが、これに限定されない、メタロプロテアーゼ酵素変異体であって、様々なクリーニング用途に特にうまく適合しかつ有用なメタロプロテアーゼ酵素変異体を提供する。本発明は、本明細書に前述したメタロプロテアーゼ酵素変異体（例えば、サーモリシン変異体）を少なくとも１種含む組成物を包含する。このような組成物のうち一部のものは、洗剤組成物を含む。本発明は、バチルス及びゲオバチルス種を包含する様々な種のメタロプロテアーゼ酵素変異体、並びにかかるサーモリシン変異体を１種以上含む組成物を提供する。本発明のメタロプロテアーゼ酵素変異体は、洗剤組成物に有用な他の酵素と組み合わせることが可能である。本発明はまた、本発明のメタロプロテアーゼ酵素変異体を用いたクリーニング方法も提供する。
本発明は、親酵素メタロプロテアーゼからの改変を１つ以上有するメタロプロテアーゼ酵素変異体を包含する。この酵素変異体は、洗浄性能、洗剤組成物中での酵素の安定性及び酵素の熱安定性に関する最小性能指数を有し、これらの特性のうち少なくとも１種が親酵素メタロプロテアーゼよりも改善されたことにより、洗剤組成物中で有用となり得る。
さらに、本発明は、洗剤組成物中で有用となり得るメタロプロテアーゼ酵素中の１つ以上のアミノ酸位置に、置換などの改変を付与するものであり、好ましい改変は結果として、洗浄性能、洗剤組成物中での酵素の安定性及び酵素の熱安定性に関する最小性能指数を提供すると同時に、これらの特性のうち少なくとも１種を親酵素メタロプロテアーゼよりも改善することとなる。これら改変は、本発明の好適な改変とみなされる。これらのアミノ酸の位置は、親酵素メタロプロテアーゼに対する改変の組み合わせに有用な位置であると考えられ得る。有用な位置であることが分かっているメタロプロテアーゼ酵素のアミノ酸位置は、洗剤組成物での使用に適した複数の改変を有することを更に特徴とすることができる。それぞれの位置では、好適な改変の見込まれる数が多いほど、特定の位置の生産力が高いことを意味する。
更に、本発明はこれらのメタロプロテアーゼ変異体を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、これらのメタロプロテアーゼ変異体のうちの少なくとも１種を含むクリーニング組成物を提供する。
これら本発明の特定の特徴は、明確にするために個別の実施形態に照らして上記及び以降で説明するが、一つの実施形態において組み合わせて提供されうると認識されるべきである。その逆に、手短に説明するためにただ一つの実施形態に照らして説明された本発明の様々な特徴もまた、別個に又は任意のサブコンビネーションで提供される場合もある。
用語の定義
特に指定しない限り、本発明の実施は、当該技術分野内の分子生物学、タンパク質工学、微生物学及び組み換えＤＮＡにおいて通常使用される従来技術を伴う。このような技術は当業者に既知のものであり、当業者に広く知られている数多くの文献及び参考文献に記載されている。本明細書の上述の及び以降に記載されるすべての特許、特許出願、論文及び刊行物は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。多くの専門用語辞典が当業者に既知である。本明細書に記載されているものと類似した又は等価な任意の方法及び材料が本発明の実施に使用されるが、本明細書には一部の好適な方法及び材料を記載する。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。同様に、本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で明示されない限り、対象物が複数個ある場合も含まれる。数範囲は、範囲を定義する数を包含する。別途記載のない限り、核酸（の塩基配列）は５’側から３’側へ向かって左から右に表示され、そしてアミノ酸配列はアミノ基からカルボキシ基へ向かって左から右に表示される。本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に制限されるものではなく、これらは当業者により使用される文脈に応じて変動し得ると解されるべきである。
本発明の実施は、別途記載のない限り、タンパク質精製、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術及びタンパク質配列決定の従来技術を採用し、これらはすべて、当該技術分野内のものである。
加えて、本明細書で提供される見出しは本発明の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。それでもなお、本発明に対する理解を容易にする目的で、数多くの用語を以下に定義する。
本明細書全体を通じて記載されているあらゆる最大数値限度には、それよりも小さいあらゆる数値限度が、あたかもこうしたより小さい数値限度が本明細書に明確に記載されているかのように包含されることが意図される。本明細書の全体を通じて記載されているあらゆる最小数値限度には、それよりも大きいあらゆる数値限度が、あたかもこうしたより大きい数値限度が本明細書に明確に記載されているかのように包含される。本明細書の全体を通じて記載されているあらゆる数値範囲には、このような広い数値的範囲に含まれるより狭いあらゆる数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値範囲がすべて本明細書に明確に記載されているかのように包含される。
本明細書で使用するとき、用語「プロテアーゼ」及び「プロテイナーゼ」は、他のタンパク質を分解する能力を有する酵素タンパク質を指す。プロテアーゼは、タンパク質を形成するペプチド鎖又はポリペプチド鎖中のアミノ酸を連結するペプチド結合を加水分解することにより、タンパク質の異化を開始する、「タンパク質分解」の実行能を有する。プロテアーゼの、タンパク質消化酵素としてのこのような活性は、「タンパク質分解活性」と呼ばれる。タンパク質分解活性の測定には多くの周知の手順が存在する（例えば、Ｋａｌｉｓｚ，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，」Ｉｎ：Ｆｉｅｃｈｔｅｒ（ｅｄ．）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８８年）を参照されたい）。例えば、タンパク質分解活性は、各プロテアーゼが市販の基質を加水分解する能力を解析する比較アッセイにより確認することができる。プロテアーゼ活性又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質としては、限定するものではないが、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ Ｃ−９８０１）、ウシコラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃ−９８７９）、ウシエラスチン（Ｓｉｇｍａ Ｅ−１６２５）、及びウシケラチン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ９０２１１１）が挙げられる。これらの基質を用いる比色分析が当該技術分野において周知である（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ９９／３４０１１号及び米国特許第６，３７６，４５０号を参照されたい）。同様に、ｐＮＡアッセイ（例えば、Ｄｅｌ Ｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：３１６〜３２０頁（１９７９年）を参照されたい）も、勾配溶出時に回収される分画中の活性な酵素濃度の測定に有用である。このアッセイは、可溶性の合成基質、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を酵素が加水分解する際に放出されるｐ−ニトロアニリンの放出速度を測定する。加水分解反応による黄色の生成速度を分光光度計で４１０ｎｍにて測定するが、この速度は活性酵素濃度に比例する。加えて、２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度測定を使用して、総タンパク質濃度を測定することができる。活性酵素／総タンパク質比によって酵素純度が与えられる。
本明細書で使用するとき、用語「サーモリシン」とは、ＭＥＲＯＰＳ（ペプチダーゼデータベース）（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３４ Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ，Ｄ２７０〜２７２頁［２００６年］を参照されたい）に掲載されているＭ４プロテアーゼファミリーの任意のメンバーを指し、そのプロトタイプがサーモリシン（ＴＬＮ；ＥＣ ３．４．２４．２７）である。サーモリシン（ＥＣ ３．４．２４．２７）（バチルス・サーモプロテオリティカスから分泌される中性のメタロエンドペプチダーゼ）のアミノ酸配列については、Ｔｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌによって最初に報告された（Ｔｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２３８：３５〜３７頁（１９７２年））。その後、Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅ ｅｔ ａｌはこの酵素の遺伝子をクローニングして（Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅ，Ｍ．Ｊ、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｐｒ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ Ｒｏｋｋｏ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３００：５９９〜６０３頁（１９９４））、その配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの受託番号Ｐ００８００（配列番号４）として記載された。Ｔｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌが公表したタンパク質配列とＯ’Ｄｏｎｏｈｕｅ ｅｔ ａｌが公表したタンパク質配列は、３７位のＡｓｎ（Ａｓｐの代わり）及び１１９位のＧｌｎ（Ｇｌｕの代わり）のみが相違する。そのため、用語「サーモリシン」、「ステアロリシン」、「バシロリシン」、「プロテイナーゼＴ」、「ＰｒＴ」、「サーモリシン様プロテアーゼ」、及び「ＴＬＰ」は、バチルス・サーモプロテオリティカスの中性メタロプロテアーゼ酵素を指すものとして本明細書ではほぼ同じ意味で使用される。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド変異体」は、親又は基準ポリペプチド（限定するものではないが野生型ポリペプチドが挙げられる）のアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）属」としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）」属のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、枯草菌（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシイ（B. clausii）、バチルス・ハロデュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（巨大菌、B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サークランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類学上の再構築を絶えず受けているものと認識される。したがって、この属は、再分類された種を包含することを意図し、例えば、限定するものではないが、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス」と命名されているバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のような生物を包含する。酸素存在下での耐性芽胞の生成は、バチルス属を決定付ける特徴と考えられるが、この特徴は最近命名されたアリシクロバチルス属（Alicyclobacillus）、アンフィバチルス属（Amphibacillus）、アニューリニバチルス属（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス属（Anoxybacillus）、ブレビバチルス属（Brevibacillus）、フィロバチルス属（Filobacillus）、グラシリバチルス属（Gracilibacillus）、ハロバチルス属（Halobacillus）、パエニバチルス属（Paenibacillus）、サリバチルス属（Salibacillus）、サーモバチルス属（Thermobacillus）、ウレイバチルス属（Ureibacillus）、及びバージバチルス属（Virgibacillus）にも当てはまる。
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書ではほぼ同じ意味で使用され、ヌクレオチドモノマーが鎖状に共有結合している任意の長さのポリマーを指す。デオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであるＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、及びリボヌクレオチドポリマーであるＲＮＡ（リボ核酸）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチド又は核酸の例である。ポリヌクレオチド又は核酸としては、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン塩基及びピリミジン塩基、若しくは他の天然の、化学的に改変された、生化学的に改変された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが挙げられる。次のものはポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、発現配列タグ（ＥＳＴ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。
本明細書で使用するとき、用語「変異」は、基準とするアミノ酸配列又は核酸配列に生じた変化を指す。この用語には、置換、挿入及び欠失が包含されることを意図する。
本明細書で使用するとき、用語、「ベクター」は、核酸を標的細胞又は組織の中に導入する又は移入するために使用される核酸構築物を指す。ベクターは、典型的には、外来ＤＮＡを細胞又は組織に導入するために使用される。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクター、バクテリオファージ、ウイルス（例えば、ウイルスベクター）、コスミド、発現ベクター、シャトルベクターなどが挙げられる。典型的には、ベクターは複製開始点、マルチクローニング部位、及び選択マーカーを備えている。ベクターを標的細胞に挿入するプロセスは、典型的に形質転換と呼ばれる。一部の実施形態では、本発明は、メタロプロテアーゼポリペプチド（例えば、前駆体又は成熟メタロプロテアーゼポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを包含するものであり、当該ＤＮＡ配列は、好適な宿主内でのＤＮＡ配列の発現、並びに組み換えポリペプチド鎖のフォールディング及び転座を行うことができる好適なプロ配列（例えば、分泌性のシグナルペプチド配列など）に機能的に連結される。
本明細書で使用するとき、用語「発現カセット」、「発現プラスミド」又は「発現ベクター」は、対象とする核酸を標的細胞で発現させるための組み換え又は合成により生成される核酸構築物又はベクターを指す。発現ベクター又は発現カセットは、典型的には外来核酸の発現を促進するプロモーターヌクレオチド配列を含む。また、典型的には発現ベクター又はカセットは、標的細胞で特定の核酸の転写を可能にする任意の他の指定された核酸エレメントを包含する。組み換え型発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込むことができる。多くの原核及び真核細胞発現ベクターが、市販されている。
一部の実施形態では、配列の両末端は、ＤＮＡ構築物が閉環を形成するように閉じている。当業者に周知である技術を用いてＤＮＡ構築物に組み込まれる、対象とする核酸配列は、野生型、変異型、又は修飾型核酸であり得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞染色体と相同である核酸配列を１種以上含む。他の実施形態においては、ＤＮＡ構築物は、非相同的なヌクレオチド配列を１種以上含む。ＤＮＡ構築物はインビトロでアセンブルされた後、例えば：１）非相同配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入するために、及び／又は２）宿主細胞染色体領域に変異を誘発する（すなわち、内因性配列を非相同配列と置き換える）ために、３）標的遺伝子を欠失させるために、及び／又は４）複製プラスミドを宿主に導入するために用いられうる。「ＤＮＡ構築物」は、本明細書において「発現カセット」とほぼ同じ意味で使用される。
本明細書で使用するとき、「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することのできる染色体外ＤＮＡ分子を指す。プラスミドは二本鎖（ｄｓ）であり、環状であってもよく、典型的にはクローニングベクターとして使用される。
本明細書で、核酸配列を細胞に導入する文脈において使用するとき、用語「導入」は、核酸配列を細胞に移入するのに好適な任意の方法を指す。かかる導入方法としては、限定するものではないが、プロトプラスト融合、トランスフェクション、形質転換、電気穿孔、コンジュゲーション、及び形質導入が挙げられる（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ Ｈａｒｄｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，ｐｐ．５７〜７２頁［１９８９年］を参照されたい）。
形質転換は、遺伝子材料（例えば、ＤＮＡ）の取り込み、任意でゲノムへの組み込み、及び発現により生じる、細胞の遺伝的変化を指す。
本明細書で使用するとき、核酸は、別の核酸配列と機能的に関連を持つよう配置された場合に、別の核酸配列と「機能的に連結」される。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響を与える場合、プロモーター又はエンハンサーは、ヌクレオチドコード配列に機能的に連結される。リボソーム結合部位は、コード配列の翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に機能的に連結され得る。通常、「機能的に連結された」ＤＮＡ配列は隣接している。ただし、エンハンサーは、隣接する必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合には、従来の実践に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーが用いられ得る。
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を指し、コード領域の前及び後に続く領域、並びに個々のコード配列（エキソン）の間に存在する介在配列（イントロン）を包含する。
本明細書で使用するとき、細胞を参照して使用する場合の「組み換え」は、典型的には、その細胞が外来核酸配列の導入により改変されていること、あるいは、その細胞がそのように改変された細胞から誘導されることを指す。例えば、組み換え細胞は、ネイティブ（非組み換え型）型の細胞において同一の形で見られない遺伝子を含み得るか、又は組み換え細胞は、改変されて細胞に再導入されているネイティブ遺伝子（ネイティブ型の細胞で見られる遺伝子）を含み得る。組み換え細胞は、細胞から核酸を除去することなく改変されている細胞に対して内因性の核酸を含み得るが、このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、及び当業者に既知の関連技術によって生じる改変が挙げられる。組み換えＤＮＡ技術には、インビトロで組み換えＤＮＡを生産する技術、及び組み換えＤＮＡが発現され得る又は増加し得る細胞に組み換えＤＮＡを移入して、それによって組み換えポリペプチドが産生される技術が挙げられる。ポリヌクレオチド又は核酸の「組み換え（Recombination）」、「組換する（recombining）」及び「組み換えられた（recombined）」は、概して、２つ以上の核酸若しくはポリヌクレオチド鎖若しくは断片をアセンブル又は結合させて新しいポリヌクレオチド又は核酸を生成することを指す。組み換えポリヌクレオチド又は核酸は、時にキメラと呼ばれる。核酸又はポリペプチドは、人工的であるか又は操作されている場合、「組み換え型」である。
本明細書で使用するとき、核酸又は遺伝子の「増幅」といった用語は、増幅させた核酸又は遺伝子が、ゲノム中に最初に存在していたコピー数よりもより多くのコピー数で存在するように、特異的ＤＮＡ配列を不釣り合いに複製させるプロセスを指す。一部の実施形態では、薬剤（例えば、阻害可能な酵素の阻害剤）の存在下で増殖させることによる細胞選別の結果、薬剤の存在下での増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする内因性遺伝子が増幅されるか、又はこの核酸若しくは遺伝子産物又はこれら両方をコードする外因性の（すなわち、導入）配列が増幅されることになる。
「増幅」は鋳型特異性を伴う核酸複製の特殊例である。これは非特異的な鋳型複製（すなわち、鋳型依存的であるが、特定の鋳型に依存しない複製）と対比をなす。ここで、鋳型特異性は、複製の忠実度（すなわち、適切なポリヌクレオチド配列が合成される度合い）及びヌクレオチド（リボ又はデオキシリボヌクレオチド）の特異性とは区別される。鋳型特異性は、しばしば「標的」特異性に関して記載される。標的配列は、他の核酸から選別されることが求められるという意味での「標的」である。増幅技術は主にこの選別のために設計されている。
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」は、精製された制限酵素消化物として天然に存在するか、又は合成により生成されるかによらず、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件（すなわち、ヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導物質の存在下で、かつ好適な温度及びｐＨ）下に置かれた場合に、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド残基のポリマー）を指す。好ましくは、プライマーは増幅効率を最大にするために一本鎖であるが、あるいは、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーを最初に処理してその鎖を分離した後、伸長産物を調製するために使用する。一部の実施形態では、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導物質の存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー供給源、及び使用方法などの様々な要因に依存する。
本明細書で使用するとき、用語「プローブ」は、精製された制限酵素消化物として天然に存在するか、又は合成、組み換え、若しくはＰＣＲ増幅により生成されるかによらず、典型的に対象とする他のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。プローブは一本鎖又は二本鎖であり得る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、及び単離に有用である。本発明で使用される任意のプローブは、限定するものではないが酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、並びに酵素を用いる組織化学アッセイ）、蛍光、放射活性、及び発光システムなどの任意の検出システムで検出され得るように、任意の「リポーター分子」により標識されると想到される。本発明は、任意の特定の検出システム又は標識に制限されないと意図される。
本明細書で使用するとき、用語「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応に関し使用する場合、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーが結合する核酸領域を指す。したがって、「標的」は他の核酸配列から選別されることが求められる。ヌクレオチド「セグメント」は、標的核酸配列内の核酸領域である。
本明細書で使用するとき、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，９６５，１８８号（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法を指し、クローニング又は精製することなくゲノムＤＮＡ混合物中の標的配列セグメントの濃度を増加させる方法を包含する。標的配列のこの増幅プロセスは当業者に周知である。
本明細書で使用するとき、用語「増幅試薬」は、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素を除く、増幅に必要とされる試薬を指す（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液など）。典型的に、増幅試薬は他の反応成分と共に反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に入れて、その中に含まれる。
本明細書で使用するとき、用語「制限エンドヌクレアーゼ」又は「制限酵素」は、制限部位として知られる特異的ヌクレオチド配列又はその近傍で二本鎖又は一本鎖ＤＮＡを切断することのできる酵素（例えば、細菌酵素）を指す。制限部位を含むヌクレオチド配列は、所定の制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素により認識及び開裂され、しばしばＤＮＡ断片の挿入部位になる。制限部位は、発現ベクター又はＤＮＡ構築物中に工学操作することができる。
「相同的組換え」は、同一の若しくはほとんど同一のヌクレオチド配列部位での２つのＤＮＡ分子又は染色体対の間で生じるＤＮＡ断片の交換を指す。一部の実施形態では、染色体への組み込みは相同的組換えである。
核酸又はポリヌクレオチドは、ネイティブな状態にせよ又は当業者に既知の手法により工学操作された場合にせよ、転写及び／又は翻訳されてポリペプチド又はそれらの断片を産生できるのであれば、ポリペプチドを「コードする」と言われる。このような核酸のアンチセンス鎖も、同様に、配列をコードすると言われる。
「宿主株」又は「宿主細胞」は、対象とするＤＮＡ配列を含む発現ベクターにとって好適な宿主を指す。
「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列からなる。「タンパク質」及び「ポリペプチド」なる用語は、本明細書ではほぼ同じ意味で使用される。ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従い定義されるアミノ酸の一文字表記及び三文字表記を、本開示全体を通して使用する。一文字のＸは、２０種のアミノ酸のうちのいずれかを指す。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重により１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。変異は、親アミノ酸の１文字表記、続いて位置番号、次に変異アミノ酸を表す１文字表記により記載される。例えば、８７位でのグリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）への変異は、「Ｇ０８７Ｓ」又は「Ｇ８７Ｓ」と表される。変異は、また、アミノ酸の３文字表記に続いて、ポリペプチド鎖のＮ末端から数えた位置により記載されることがあり、例えば、１０位のアラニンはＡｌａ１０で記載される。複数の変異は、「−」を変異の間に挿入することで示される。８７位及び９０位での変異は、「Ｇ０８７Ｓ−Ａ０９０Ｙ」若しくは「Ｇ８７Ｓ−Ａ９０Ｙ」、又は「Ｇ８７Ｓ＋Ａ９０Ｙ」若しくは「Ｇ０８７Ｓ＋Ａ０９０Ｙ」のいずれかとして表される。欠失については、一文字コード「Ｚ」を使用する。親配列に対する挿入については、一文字コード「Ｚ」を位置番号の左側に記載する。欠失については、一文字コード「Ｚ」を位置番号の右側に記載する。挿入については、位置番号は、挿入されるアミノ酸の前の位置番号にアミノ酸毎に０．０１を加えた番号である。例えば、３種のアミノ酸アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）及びチロシン（Ｙ）を位置８７と８８の間に挿入する場合は、「Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ」として示される。そのため、上記の全ての変異と１００位での欠失とを組み合わせると、「Ｇ０８７Ｓ−Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ−Ａ０９０Ｙ−Ａ１００Ｚ」となる。改変を記載する場合、位置番号の後に括弧で括られたアミノ酸記号が続くと、括弧で括られたアミノ酸のうちいずれかによるその位置での置換のリストを表す。例えば、６（Ｌ，Ｉ）とは、６位がロイシン又はイソロイシンで置換され得ることを意味する。
「プロ配列」又は「プロペプチド配列」とは、適切なフォールディング及びプロテアーゼの分泌にとって必要な、シグナルペプチド配列と成熟型プロテアーゼ配列との間のアミノ酸配列を指す。これらは、分子内シャペロン分子と称されることもある。プロ配列又はプロペプチド配列の開裂により、成熟型活性プロテアーゼを生じる。細菌メタロプロテアーゼは、プロ酵素と表現されることが多い。
用語「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、成熟型又は前駆体型タンパク質の分泌又は直接輸送に関与し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、典型的に、前駆体型又は成熟型タンパク質配列のＮ端末に位置する。シグナル配列は内因性又は外来性であり得る。シグナル配列は通常、成熟型タンパク質には存在しない。シグナル配列は、典型的には、タンパク質の輸送後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質から開裂される。
用語「成熟型」タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとは、シグナルペプチド配列及びプロぺプチド配列を持たないタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的形態を指す。
用語「前駆体」型タンパク質又はペプチドとは、タンパク質のアミノ末端又はカルボニル末端に機能的に連結されたプロ配列を有する成熟型タンパク質を指す。前駆体型タンパク質又はペプチドは、プロ配列のアミノ末端に、機能的に連結された「シグナル」配列を有する場合もある。前駆型タンパク質又はペプチドは、翻訳後活性に関係する追加のポリペプチド（例えば、前駆体から開裂されて、成熟型のタンパク質又はペプチドを後に残すポリペプチド）を有する場合もある。
アミノ酸配列又は核酸配列に関する用語「野生型」は、そのアミノ酸配列又は核酸配列がネイティブ又は天然起源の配列であることを示す。本明細書で使用するとき、用語「天然起源」とは、自然界で見出される任意のもの（例えば、タンパク質、アミノ酸、又は核酸配列）を指す。
本明細書で使用するとき、用語「非天然起源」とは、自然界で見出されない任意のもの（例えば、研究室で産生された組み換え型核酸及びタンパク質配列）を指す。
本明細書でアミノ酸残基の位置に関して使用するとき、「対応する（「corresponding to」又は「corresponds to」又は「corresponds」）」とは、タンパク質若しくはペプチド中の列挙された位置にあるアミノ酸残基、又はタンパク質若しくはペプチド中の列挙された残基と類似、相同、若しくは等価であるアミノ酸残基を指す。本明細書で使用するとき、「対応する領域」とは、概して、関連するタンパク質又は基準タンパク質における類似の位置を指す。
本明細書で使用するとき、用語「に由来する」及び「から得られる」とは、当該生物株により産生されるあるいは産生され得るタンパク質だけでなく、このような株から単離されるＤＮＡ配列によってコードされ、このようなＤＮＡ配列を含有している宿主生物で産生されるタンパク質も指す。更にこれらの用語は、合成ＤＮＡ配列及び／又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされかつ当該タンパク質の識別特徴を有するタンパク質を指す。例示すると、「バチルス属に由来するプロテアーゼ」は、バチルス属により自然に生産されたタンパク質分解活性を有する酵素、並びにバチルス属供給源により生産される酵素と類似であるが、遺伝子工学技術を使用することにより、セリンプロテアーゼをコードする核酸によって形質転換された非バチルス生物によって生産されるセリンプロテアーゼを指す。
２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」は、以下の配列比較又は解析アルゴリズムのうちの１つを用いて測定する際に、最大限一致するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。
本明細書で使用するとき、用語「相同な遺伝子」は、互いに対応し、かつ互いに同一であるか又は非常に類似している、異なるが通常は近縁種からの一対の遺伝子を指す。この用語は、種分化（すなわち、新種の発生）により分離される遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、並びに遺伝子複製により分離されている遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
本明細書で使用するとき、「同一性（％）又は同一性パーセント」とは、配列類似性を指す。同一性パーセントは、当該技術分野で既知の標準的な方法を用いて求めることができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁［１９８１年］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁［１９７０年］、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４頁［１９８８年］、ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及びＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５頁［１９８４年］を参照されたい）。有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメント法を用いて、関連する配列群から複数の配列のアラインメントを作成する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを作成するのに使用されるクラスタリング関連性を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント法を単純化したものを使用する（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０頁［１９８７年］を参照されたい）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記載されたものと類似のものである（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３頁［１９８９年］を参照されたい）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとしては、３．００のデフォルトギャップ重み（default gap weight）、０．１０のデフォルトギャップ長重み（default gap length weight）及び重み付きエンドギャップ（weighted end gaps）が挙げられる。他の有用なアルゴリズムには、Ａｌｔｓｃｈｕｌらが記載しているＢＬＡＳＴアルゴリズムがある（Ｓｅｅ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁［１９９０年］、及びＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７頁［１９９３年］）。ＢＬＡＳＴプログラムは、そのほとんどがデフォルト値に設定される複数の検索パラメータを使用する。
ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、生物学的類似性の観点から最も関連性がある配列を見出すが、残基数が２０未満の問い合わせ配列には推奨されない（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）、及びＳｃｈａｆｆｅｒ，ＡＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：２９９４〜３００５頁（２００１年））。核酸配列の検索におけるデフォルトのＢＬＡＳＴパラメータ例は次の通りである。
・隣接ワード閾値：１１
・Ｅ値カットオフ：１０
・スコア行列：ＮＵＣ．３．１（マッチ＝１、ミスマッチ＝−３）
・ギャップ開始ペナルティ：５
・ギャップ伸長ペナルティ：２
・また、アミノ酸配列検索におけるデフォルトのＢＬＡＳＴパラメータ例は次の通りである。
・ワードサイズ：３
・Ｅ値カットオフ：１０
・スコア行列：ＢＬＯＳＵＭ６２
・ギャップ開始ペナルティ：１１
・ギャップ伸長ペナルティ：１
アミノ酸配列同一性パーセント（％）は、最適／最大のアラインメントが得られるようにプログラムによって作成された任意のギャップを含む「基準」配列の残基総数で、マッチする同一残基数を除することによって決定される。配列が配列番号Ａと９０％同一である場合、配列番号Ａは「基準」配列である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、「基準」配列を「問い合わせ」配列と呼ぶ。
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムは、別の配列アラインメントアルゴリズム例である。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０頁（１９９４）を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメータは、次の通りである。
Figure 2015534820
ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムでは、どちらか一方の末端に存在する欠失を含める。例えば、５００個のアミノ酸からなるポリペプチドのどちらか一方の末端で（又はポリペプチド内に）アミノ酸５個の欠失を有する変異体は、「基準」ポリペプチドに対して９９％の配列同一性パーセントを有する（同一残基４９５個／５００個×１００）。このような変異体は、ポリペプチドに対して「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含されるであろう。
対象とするポリペプチドが基準ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む場合、対象とするポリペプチドは基準ポリペプチドと「実質上同一である」と言われ得る。２つのこのようなポリペプチド間の同一性（％）は、最適に整列させた２つのポリペプチド配列を目視することにより、又は標準的なパラメータを用いるソフトウェアプログラム若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ，ＡＬＩＧＮ，ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することにより、決定することができる。第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応することは、２つのポリペプチドが実質的に同一であるの１つの指標になる。典型的に、保存的アミノ酸置換が異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのペプチドが、保存的アミノ酸置換のみが異なる、又は１つ以上の保存的アミノ酸置換のみが異なる場合、ポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に同一である。
対象とする核酸が基準核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む場合、対象とする核酸は基準核酸と「実質上同一である」と言われうる。２つのこのような核酸間の同一性（％）は、最適に整列させた２つの核酸配列を目視することにより、又は標準的なパラメータを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することにより、決定することができる。ストリンジェントな条件下（例えば、中程度から高ストリンジェンシーまでの範囲）で、２つの核酸分子が互いにハイブダイズすることは、２つの核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標になる。
核酸又はポリヌクレオチドが、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から少なくとも部分的又は完全に分離されているとき、核酸又はポリヌクレオチドは「単離され」ている。同様に、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドが、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から少なくとも部分的又は完全に分離されているとき、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドは「単離され」ている。単離された種は、モルベースで、組成物中に他の種よりも豊富に含まれている。例えば、単離された種は、含まれている全ての高分子種の（モルベースで）少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９又は約１００％を構成し得る。好ましくは、対象とする種は、本質的に均一に精製される（すなわち、通常の検出手法により組成物中で汚染種が検出されることはない）。純度及び均一性は、当該技術分野で周知の多数の技術、例えば核酸又はタンパク質試料のそれぞれアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動後の染色による可視化を用いて決定することができる。必要に応じて、高解像度の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は同様の手法を用いて材料を精製することができる。
「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一つの鎖が、相補鎖と二本鎖、すなわち塩基対を形成するプロセスを指す。中等度〜高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で２つの配列が互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸配列は基準核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であるものと見なされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば一般的に、「最高のストリンジェンシー」はおよそＴｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い温度）で起こり、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃低い温度で起こり、「中等度のストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃低い温度で起こり、そして「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃低い温度で起こる。機能上、最高限度のストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いられ、一方、中等度又は低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列同族体を同定又は検出するために用いられ得る。
中度及び高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において周知である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、次の条件下でのハイブリダイゼーションにより例示される：６５℃及び０．１×ＳＳＣ（ここで、１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３、ｐＨ ７．０）。ハイブリダイズした二本鎖核酸は、ハイブリダイズした核酸の半分が相補鎖と塩基対を形成していない融解温度（Ｔｍ）で特徴づけられる。二本鎖核酸中にミスマッチ核酸があれば、Ｔｍが低下する。非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６８℃及び０．１×ＳＳＣを要する。メタロプロテアーゼ変異体をコードする核酸は、配列番号４の核酸とその同一の相補体との間に形成された二重鎖核酸に比べて１℃〜３℃以上低いＴｍを有し得る。
高ストリンジェンシー条件の別の例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でのハイブリダイゼーションの後、室温において２×ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳで２回洗浄し、そして４２℃において０．１×ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳで更に２回洗浄することが挙げられる。中等度のハイブリダイゼーション条件の例としては、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０ｍｇ／ｍｌ断片処理済の変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃において一晩インキュベーションした後、フィルターを約３７〜５０℃において１×ＳＳＣで洗浄することが挙げられる。プローブ長などの要因を適応させるために、温度、イオン強度などを調節する方法は当業者に既知である。
核酸又はポリペプチドに使用される場合、用語「精製された」は、概して、当業者に周知の解析技術により決定したときに、核酸又はポリペプチドが他の成分を本質的に含まないことを意味する（例えば、精製ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液、及び／又は密度勾配遠心分離にかけた培養液中で、別個のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲル中で本質的に１つのバンドを生じる核酸又はポリペプチドは、「精製され」ている。精製された核酸又はポリペプチドの純度（例えば、モルベースの重量％）は、少なくとも約５０％、通常は少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％又はそれ以上である。これに関連し、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチド又はポリヌクレオチドのような本発明の分子１つ以上について組成物を濃縮する方法を提供する。精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に増加している場合、組成物はその分子について濃縮されている。本発明の実質的に純粋なポリペプチド又はポリヌクレオチド（例えばそれぞれ、実質的に純粋なメタロプロテアーゼポリペプチド、又は本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）は、典型的には、特定の組成物中ですべての高分子種の（モルベースで）少なくとも約５５重量％、約６０重量％、約６５重量％、約７０重量％、約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９１重量％、約９２重量％、約９３重量％、約９４重量％、約９５重量％、約９６重量％、約９７重量％、約９８重量％、約９９重量％、又は約９９．５重量％又はそれ以上を構成する。
用語「濃縮された」とは、化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、アミノ酸、又は他の特定の材料若しくは成分が開始組成物よりも高い相対濃度又は絶対濃度で組成物中に存在することを指す。
これに関連して、本発明は、１つ以上の本発明の分子、例えば１つ以上の本発明のポリペプチド（例えば、１つ以上の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド）又は１つ以上の本発明の核酸（例えば、１つ以上の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードする１つ以上の核酸）について組成物を濃縮する方法を提供する。精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に増加している場合、組成物はその分子について濃縮されている。実質的に純粋なポリペプチド又はポリヌクレオチドは、典型的には、特定の組成物中で、すべての高分子種の（モルベースで）少なくとも約５５重量％、約６０重量％、約６５重量％、約７０重量％、約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９１重量％、約９２重量％、約９３重量％、約９４重量％、約９５重量％、約９６重量％、約９７重量％、約９８重量％、約９９重量％、約９９．５重量％又はそれ以上を構成する。
本明細書で使用するとき、用語「コンビナトリアル変異導入」又は「コンビナトリアル」とは、基準核酸配列の核酸変異体のライブラリを作成する方法を指す。これらのライブラリでは、変異体は既定の変異の組から選択された１つ以上の変異を含有している。この方法は、既定の変異の組のメンバーではないランダム変異を導入する手段も提供する。このような方法のうちのいくつかのものは、米国特許第６，５８２，９１４号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。このようなコンビナトリアル変異導入法のうち一部のものには、市販のキット（例えば、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ融合／伸長ＰＣＲ）で具体化される方法が挙げられ、及び／又は包含される。
本明細書で使用するとき、変異体プロテアーゼに関連して使用される「改善された特性を有する」とは、対応する基準プロテアーゼ（例えば、野生型又は天然起源のプロテアーゼ）と比較した場合に、変異型プロテアーゼの洗浄性能若しくはクリーニング性能が改善又は増強されていること、及び／又は場合により洗浄若しくはクリーニング性能は保持されたまま安定性が改善又は増強されている変異体プロテアーゼを意味する。変異体プロテアーゼの特性の改善には、洗浄若しくはクリーニング性能の改善及び／又は安定性の改善が含まれ得る。一部の実施形態では、本発明は、次の特性のうち１つ以上を呈する本発明の変異型プロテアーゼを提供する：基準プロテアーゼ（例えば、野生型サーモリシンなどの、野生型プロテアーゼ）と比較した場合に、手洗いの洗浄性能の改善、食器手洗い性能若しくは手動食器洗浄性能の改善、自動食器洗浄性能の改善、洗濯性能の改善、及び／又は安定性の改善。
本明細書で使用するとき、用語「機能的アッセイ」は、タンパク質活性の指標を提供するアッセイを指す。一部の実施形態では、この用語は、タンパク質を、通常の能力範囲でで機能できるかに関して解析するアッセイ系を指す。例えば、酵素の場合、機能的アッセイは、反応を触媒する酵素の有効性を決定することを包含する。
本明細書で使用するとき、用語「標的特性」は、開始遺伝子から変化させることになる特性を指す。本発明は、任意の特定の標的特性に制限されないと意図される。しかしながら、一部の実施形態では、標的特性は遺伝子産物の安定性（例えば、変性、タンパク質分解又は他の分解要因に対する抵抗性）である一方、他の実施形態では、生産宿主による生産レベルが変化する。
本明細書で使用するとき、核酸に関する文脈における用語「特性」又はそれらの文法的に等価な表現は、選別又は検出が可能な核酸の任意の特性若しくは属性を指す。これらの特性としては、限定するものではないが、ポリペプチドに対する結合に影響する特性、特定の核酸を含む細胞に与えられる特性、遺伝子の転写に影響を与える特性（例えば、プロモーター強度、プロモーター認識、プロモーター制御、エンハンサー機能）、ＲＮＡのプロセシングに影響を与える特性（例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡコンフォメーション、及び転写後修飾）、翻訳に影響を与える特性（例えば、ｍＲＮＡのレベル、調節、リボソームタンパク質に対する結合、翻訳後修飾）が挙げられる。例えば、核酸における、転写因子、ポリメラーゼ、制御因子などの結合部位を変化させることで、所望の特性を生じる、又は望ましくない特性を同定することができる。
本明細書で使用するとき、（タンパク質を含む）ポリペプチドに関する文脈における用語「特性」又はそれらの文法的に等価な表現は、選別又は検出が可能なポリペプチドの任意の特徴又は属性を指す。これらの特性としては、限定するものではないが、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、酵素活性、熱安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク質分解に対する抵抗性、ＫＭ、ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／ｋＭ比、タンパク質フォールディング、免疫応答の誘導、リガンドに対する結合能、受容体に対する結合能、分泌され得るか否か、細胞の表面に提示され得るか否か、オリゴマー形成能、シグナル伝達能、細胞増殖の刺激能、細胞増殖の阻害能、アポトーシス誘導能、リン酸化又はグリコシル化により改変され得るか否か、及び／又は疾患の治療能などが挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「スクリーニング」は、当該技術分野で通常使用される意味を有する。スクリーニングプロセスの一例では、変異核酸、又はこの核酸によってコードされるポリペプチド変異体が提供されて、変異核酸又はポリペプチド変異体の特性がそれぞれ評価又は決定される。変異核酸又はポリペプチド変異体について決定された特性を、それぞれ、対応する核酸前駆体（親核酸）の特性又は対応する親ポリペプチドの特性と比較することもできる。
特性が変化した核酸又はタンパク質を得る際のスクリーニング手順は、変異核酸の生成により、その改変が促進されると意図される開始材料の特性に依存することは当業者には明白である。したがって、本発明はスクリーニングされる任意の特定の特性に制限されるものではなく、また、以下の特性に関する記載は例証のみを掲載していることを、当業者は認識するであろう。任意の特定の特性に関するスクリーニング方法は、一般的に当該技術分野で記載されているものである。例えば、ある方法は、変異の前後の結合、ｐＨ、特異性などを測定することができ、それらの変化が変更の指標である。好ましくは、スクリーニングは、同時にスクリーニングされる多数の試料を含むハイスループット方式で実施されるものであって、例えば、限定するものではないが、チップ、ファージディスプレイ、並びに複数の基質及び／又は指示薬を利用するアッセイが挙げられる。
本明細書で使用するとき、一部の実施形態では、スクリーニングプロセスは、対象とする変異体を、変異体集団から濃縮する選別工程を一工程以上包含する。これらの実施形態の例としては、宿主生物に増殖優位性を与える変異体の選別、並びにファージディスプレイ法又は任意の他のディスプレイ法が挙げられるが、これらの方法では、変異体の結合特性又は触媒特性に基づき、変異体を変異体集団から捕捉することができる。一部の実施形態では、変異体ライブラリをストレス（例えば、熱、変性など）に曝露して、続いてインタクトなままの変異体を、スクリーニングにより同定するか、又は選別により濃縮する。この用語は、選別に関する任意の好適な手段を包含することを意図するものである。実際のところ、本発明は、任意の特定のスクリーニング方法に制限されることを意図しない。
用語「改変核酸配列」及び「改変遺伝子」は、天然起源の（すなわち、野生型の）核酸配列の欠失、挿入又は中断を包含する核酸配列を指すために、本明細書においてほぼ同じ意味で使用される。一部の実施形態では、改変された核酸配列の発現産物は、切断型タンパク質である（例えば、改変が配列の欠失又は中断である場合）。一部の実施形態では、切断型タンパク質は生物活性を保持している。代替的な実施形態では、改変された核酸配列の発現産物は、伸長型タンパク質である（例えば、改変が核酸配列への挿入を含む場合）。一部の実施形態では、核酸配列にヌクレオチドを挿入することで切断型タンパク質が得られる（例えば、挿入により終止コドンが形成される場合）。したがって、挿入によって、切断型タンパク質又は伸長型タンパク質のいずれかが発現産物として生じ得る。
「変異体」核酸配列は、典型的には、変異体核酸配列の発現産物が、野生型タンパク質と比較してアミノ酸配列が変化しているタンパク質であるよう、宿主細胞の野生型配列に存在する少なくとも１つのコドンの変化を有する核酸配列を指す。発現産物は、変化した機能的能力（例えば、酵素活性の増強）を有し得る。
本明細書で使用するとき、語句「基質特異性の変化」は、酵素の基質特異性に生じる変化を指す。一部の実施形態では、基質特異性の変化は、酵素の変異、又は反応条件の変化により生じる、特定の基質に関するｋｃａｔ及び／又はＫｍの変化として定義される。酵素の基質特異性は、その酵素が示す触媒効率を異なる基質と比較することで決定される。概して、対象とする基質のｋｃａｔ／Ｋｍ比がより大きい変異体酵素を生産することが所望されることから、これらの決定は、変異体酵素の効率を評価する際に特に有用である。しかしながら、本発明は、いかなる特定の基質組成物又は基質特異性にも制限されないと意図される。
本明細書で使用するとき、「表面特性」は、静電荷、並びにタンパク質の表面が示す疎水性及び親水性などの特性に関して使用される。
本明細書で使用するとき、用語「実効電荷」は、分子中に存在するすべての電荷の合計として定義される。親タンパク質分子の「実効電荷を変化」させることで、親分子とは異なる実効電荷を有する変異体が得られる（すなわち、変異体は親分子と同じではない実効電荷を有する）。例えば、中性アミノ酸を負電荷を持つアミノ酸に置き換えるか、又は正電荷を持つアミノ酸を中性アミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が−１になる。正電荷を持つアミノ酸を負電荷を持つアミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が−２になる。中性アミノ酸を正電荷を持つアミノ酸に置き換えるか、又は負電荷を持つアミノ酸を中性アミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が＋１になる。負電荷を持つアミノ酸を正電荷を持つアミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が＋２になる。親タンパク質の実効電荷は、電荷を持つアミノ酸の欠失及び／又は挿入によっても変化し得る。
用語「熱的に安定な」及び「熱安定性の」及び「熱安定性」は、変化した温度に曝露されているがタンパク質分解、加水分解、クリーニング、又は本発明の他のプロセスの際に一般的に適用される条件下で、所定の時間にわたって特定の温度に曝露された後でも、明記された量の酵素活性を保持するプロテアーゼを意味する。「変化した温度」は、温度の上昇又は低下を包含する。一部の実施形態では、プロテアーゼは、変化した温度に、例えば少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分などの所定の時間にわたって曝露した後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質分解活性を保持する。
酸化安定性、キレート剤安定性、熱安定性及び／又はｐＨ安定性のプロテアーゼに関する文脈において、用語「安定性の強化」は、他のプロテアーゼ（例えば、サーモリシンプロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した場合に、時間が経過しても保持されるタンパク質分解活性が高いことを意味する。
酸化安定性、キレート化安定性、熱安定性及び／又はｐＨ安定性のプロテアーゼに関する文脈において、用語「安定性の低下」は、他のプロテアーゼ（例えば、サーモリシンプロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した場合に、時間が経過するにつれて保持されるタンパク質分解活性が低下することを意味する。
用語「クリーニング活性」は、タンパク質分解、加水分解、クリーニング、又は本発明の他のプロセスの際に一般的に適用される条件下で、プロテアーゼ変異体又は基準プロテアーゼにより得られるクリーニング性能を指す。一部の実施形態では、プロテアーゼ変異体又は基準プロテアーゼのクリーニング性能は、物品又は表面上の１種以上の様々な酵素反応性の染み（例えば、食物、草類、血液、インク、牛乳、油及び／又は卵タンパク質による染み）をクリーニングするための様々なアッセイを用いることで決定され得る。プロテアーゼ変異体又は基準プロテアーゼのクリーニング性能は、物品又は表面上の染みを標準的な洗浄条件に晒す工程、及び染みが除去される程度を、様々なクロマトグラフィー、分光光度法、又はその他の定量法を用いて評価する工程によって決定され得る。例示的なクリーニングアッセイ及び方法は当該技術分野において既知であり、かつ限定されるものではないが、例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ９９／３４０１１号及び米国特許第６，６０５，４５８号（これら公報はいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載のもの、並びに本明細書のこれより以降に提供される実施例に包含されるクリーニングアッセイ及びクリーニング方法が挙げられる。
プロテアーゼ変異体又は基準プロテアーゼの「クリーニング有効量」という表現は、特定のクリーニング組成物中で、所望のレベルの酵素活性を達成するプロテアーゼの量を指す。このような有効量は、当業者によって容易に確認され、使用される特定のプロテアーゼ、クリーニング用途、クリーニング組成物の具体的な組成、及び必要とされる組成物が液体又は乾燥形態（例えば、粒状、錠剤、バー状）のいずれであるのか、などの多くの要因に基づくものである。
用語「クリーニング助剤」は、クリーニング組成物に包含される、本発明の変異体プロテアーゼ以外の任意の液体、固体、又はガス状の材料を指す。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上のクリーニング助剤を包含する。各クリーニング助剤は、典型的には、クリーニング組成物の特定のタイプ及び形態（例えば、液体、粒状、粉末、バー状、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、フォーム、又はその他の構成）に応じて選択される。好ましくは、各クリーニング助剤は、組成物に使用されるプロテアーゼ酵素と適合性である。
クリーニング活性の文脈における表現「性能の強化」は、標準的な洗浄サイクル及び／又は複数回の洗浄サイクル後に通常の評価により決定されたときに、卵、牛乳、草類、インク、油、及び／又は血液などの特定の酵素反応性の染みに対する酵素によるクリーニング活性が増加又はより大きいことを指す。
クリーニング活性の文脈における表現「性能の低下」は、標準的な洗浄サイクル後に通常の評価により決定されたときに、卵、牛乳、草類又は血液などの特定の酵素反応性の染みに対する酵素によるクリーニング活性が低下又はより低いことを指す。
クリーニング性能は、標準的な洗浄サイクル条件後に通常の分光光度法又は分析技法により決定されたときに、草類、血液、インク、油、及び／又は牛乳などの酵素反応性の染みに関する様々なクリーニングアッセイにおいて、本発明のプロテアーゼ変異体を基準プロテアーゼと比較することで決定することができる。
本明細書で使用するとき、用語「消費者製品」は、布地ケア製品及びホームケア製品を意味する。本明細書で使用するとき、用語「布地ケア製品及びホームケア製品」又は「布地ケア及び家庭用ケア製品」は、販売される形態で使用又は消費されることが一般的に意図され、かつ布地、硬質表面及び任意の他の表面を処理するための製品、非生物表面のケア及びクリーニングの全般に関するクリーニング系、並びに布地コンディショナー製品及び布地のケア及び維持のために特に設計されたその他の製品、エアケア製品（例えば、エアフレッシュナー及び香り送達系など）、カーケア、ペットケア、家畜ケア、パーソナルケア、ジュエリーケア、食器洗浄、布地コンディショニング（例えば、柔軟化及び／又はフレッシュニングなど）、洗濯洗剤、洗濯及びすすぎ添加剤及び／又はケア剤、前処理クリーニング組成物、硬質表面クリーニング及び／又は処理剤（例えば、床及び便器クリーナー、ガラスクリーナー及び／又は処理剤、タイルクリーナー及び／又は処理剤、セラミッククリーナー及び／又は処理剤など）、並びに消費者若しくは業務用の他のクリーニング剤を包含する。一部の実施形態では、布地ケア製品及びホームケア製品は、創傷部及び／又は皮膚への使用に好適である。「布地ケア製品及びホームケア製品」としては、消費者製品及び業務用製品が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「非布地用ケア製品及びホームケア製品」は、他の組成物に添加することで布地ケア製品及びホームケア製品となり得る最終製品を生成する組成物を指す。
本明細書で使用するとき、用語「業務用クリーニング組成物」は、限定するものではないが、学校、病院、工場、商店、企業、建造物、飲食店、総合オフィスビル、加工及び／又は製造プラント、動物病院、畜産場、大牧場などの施設での使用に好適な製品を指す。
本明細書で使用するとき、用語「クリーニング及び／又は処理組成物」は、別途記載のない限り、物品のクリーニング及び／又は処理に好適な組成物などが挙げられる、布地ケア及びホームケア製品に属する組成物である。このような製品としては、限定するものではないが、次のような布地処理用の製品、硬質面処理用の製品、並びに布地ケア及びホームケアの領域の任意の他の表面処理用の製品が挙げられる：エアフレッシュナー及び香り送達系などの空気ケア、カーケア、食器洗浄、布地コンディショニング（例えば、柔軟化及び／又はフレッシュニングなど）、洗濯洗浄、洗濯及びすすぎ添加剤及び／又はケア剤、硬質表面クリーナー及び／又は処理剤（例えば、床及び便器クリーナーなど）、粒状又は粉末形態の万能又は「強力」洗浄剤（特にクリーニング用洗剤）、液体、ゲル、又はペースト形態の万能洗浄剤（特にいわゆる強力液体型万能洗浄剤）、おしゃれ着用液体洗剤、食器手洗い用洗剤又はライトデューティ食器洗浄剤（特に高起泡型のもの）、食器洗浄機用食器洗浄剤（家庭用及び業務用の、様々な錠剤型、粒状、液体及びすすぎ補助型洗浄剤）：車又はカーペット洗浄剤、便器クリーナーを含む風呂場クリーナー、並びにクリーニング補助剤（漂白添加剤及び「染み抜きスティック」又は前処理型、或いは乾燥機用シートなどの、基材添加製品（substrate-laden product））。
実際には、本明細書で使用するとき、本発明の「クリーニング組成物」又は「クリーニング配合物」は、クリーニングされる物体、物品又は表面から化合物（例えば望ましくない化合物）を除去又は排除するのに有用な本発明の任意の組成物を指し、クリーニングされる物体、物品又は表面としては、これらに限定するものではないが、例えば、布地、布地物品、食器類、食卓用食器類、ガラス製品類、コンタクトレンズ、その他の固体基材、毛髪（シャンプー）（ヒト又は動物の毛髪を包含する）、皮膚（石鹸及び／又はクリーム）、歯（マウスウォッシュ、歯磨き粉）、物品又は対象物の表面（例えば、テーブルの硬質表面、テーブルトップ、壁、家具、床、天井、皿以外の物品、食卓用食器以外の物品などの硬質表面）、フィルター、薄膜（例えば、限外濾過膜を含むがこれに限定されない濾過膜）等が挙げられる。上記の用語は、組成物に使用されるプロテアーゼ及びその他の酵素とその組成物が適合する限り、所望の特定の種類のクリーニング組成物及び所望の特定の形態の製品（例えば、液体、ゲル、粒状、スプレー、又はその他の構成）のために選択されるいかなる材料及び／又は添加化合物も包含する。クリーニング組成物材料の具体的な選別は、クリーニングされる表面、物体、物品、又は布地を考慮することにより、及び使用時のクリーニング条件に所望される組成物の形態を考慮することにより、容易に行われる。
クリーニング組成物及びクリーニング配合物は、任意の対象物、物品、及び／又は表面をクリーニング、漂白、消毒、及び／又は殺菌するのに好適な任意の組成を含む。このような組成物及び配合物としては、限定するものではないが、液体及び／又は固体組成物、例えば、クリーニング又は洗剤組成物（例えば、液体、錠剤、ゲル、バー状、粒状、及び／又は固体洗濯洗浄又は洗剤組成物、並びにおしゃれ着用洗剤組成物など）；硬質表面クリーニング組成物及び配合物（例えば、ガラス、木材、セラミック及び金属製のカウンター甲板及び窓用のもの）；カーペットクリーナー；オーブンクリーナー；布地フレッシュナー；布地柔軟剤；及び繊維製品、洗濯洗浄性能増進用クリーニング又は洗剤組成物、洗濯用添加型クリーニング組成物、及び洗濯物のシミ抜き前処理用クリーニング組成物；食器手洗い用又は食器手動洗浄用組成物（例えば、食器「手洗い」用又は食器「手動」洗浄用の洗剤）及び自動食器洗浄機用組成物（例えば、「自動食器洗浄機用の洗剤」）を包含する食器洗浄用組成物などが挙げられる。
本明細書で使用するとき、クリーニング組成物又はクリーニング配合物としては、別途記載のない限り、粒状又は粉末状万能又は強力洗浄剤、特に、クリーニング洗剤；液状、粒状、ゲル状、固形、錠剤型又はペースト状万能洗浄剤、特にいわゆる強力液体（ＨＤＬ）洗剤又は強力粉末洗剤（ＨＤＤ）型；おしゃれ着用液体洗剤；高起泡型のものを含む食器手洗い又は食器手動洗浄剤；食器手洗い又は食器手動洗浄、食器自動洗浄、或いは家事用及び業務用の様々な錠剤、粉末、固形、粒状、液状、ゲル状及びすすぎ助剤型の食器類若しくは食卓用食器類洗浄剤；抗菌性手洗い用液体クリーニング及び殺菌剤、固形石鹸、マウスウォッシュ、義歯クリーナー、車洗浄剤、カーペット洗浄剤、風呂場クリーナーなどの液体クリーニング及び殺菌剤；人間及び他の動物用毛髪用シャンプー及び／又は毛髪用リンス；シャワージェル及びバブルバス、並びに金属製品クリーナー；加えて、漂白添加剤及び「染み抜きスティック」又は前処理型などのクリーニング補助剤が挙げられる。一部の実施形態では、粒状組成物は「コンパクト」形態であり；一部の実施形態では、液体組成物は「濃縮」形態である。
本明細書で使用するとき、「布地クリーニング組成物」としては、洗濯用添加型組成物などの手洗い用及び洗濯機用洗剤組成物、並びに染みの付いた布地（例えば、衣類、リネン類、及び他の繊維材料）の浸け置き及び／又は前処理に使用するのに好適な組成物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「非布地用クリーニング組成物」としては、限定するものではないが、例えば、食器手洗い用若しくは手動食器洗浄用又は自動食器洗浄用洗剤組成物、口腔洗浄用組成物、義歯洗浄用組成物、及びパーソナルクレンジング組成物などの、非繊維製品（すなわち、非布地）表面用のクリーニング組成物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「布地及び／又は硬質表面用のクリーニング及び／又は処理組成物」は、別途記載のない限り、粒状又は粉末状の万能又は「強力」洗浄剤、特にクリーニング用洗剤、液体、ゲル、又はペースト状の万能洗浄剤、特にいわゆる強力液体洗浄剤、おしゃれ着用液体洗剤、食器手洗い用洗浄剤又はライトデューティ食器洗浄剤（特に高起泡型のもの）、家庭用及び業務用の各種の錠剤型、粒状、液体、及びすすぎ補助型を含む食器洗浄機用洗剤、液体洗浄剤及び殺菌剤、車又はカーペット洗浄剤、便器クリーナーを含む浴室クリーナー、液体、固体、及び／又は乾燥機用シート形態であり得る柔軟化及び／又はフレッシュニングを含む布地コンディショニング製品、並びに漂白剤添加型及び「染み抜きスティック」又は前処理型そして乾燥機用シート（dryer added sheet）などの基材添加製品（substrate-laden product）のようなクリーニング補助剤を包含する、クリーニング及び処理組成物に属する組成物である。適用可能であるこのような製品の全ては、標準形態又は濃縮形態であってよく、又は特定の態様では、このような製品は、更には非水性となり得る程度まで高濃縮された形態であってもよい。
本明細書で使用するとき、用語「洗剤組成物」又は「洗剤配合物」は、特定の布地及び／又は非布地製の物体又は物品などの、汚れた又は泥のついた物体を洗浄するために洗浄媒質中で使用することが意図される組成物に関して使用される。本発明のこのような組成物は、任意の特定の洗剤組成物又は配合物に限定されない。実際に、一部の実施形態では、本発明の洗剤は、少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体に加え、界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー（例えば、ビルダー塩など）、漂白剤、漂白活性化剤、ブルーイング剤、蛍光染料、ケーキング防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化物質、及び／又は可溶化剤を１種以上含有する。場合によっては、ビルダー塩はケイ酸塩とリン酸塩の混合物であり、好ましくはケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）をリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）よりも多く含む。例えば、限定するものではないが、クリーニング組成物又は洗剤組成物などの、本発明の一部の組成物は、リン酸塩（例えば、リン酸塩又はリン酸塩ビルダー）を含まない。
本明細書で使用するとき、用語「漂白」は、材料の増白（すなわち、ホワイトニング）及び／若しくはクリーニングを行うために充分な時間及び／又は適切なｐＨ及び／又は温度条件下での物質（例えば、布地、洗濯物、パルプなど）又は表面の処理を指す。漂白に好適な化学物質の例としては、限定するものではないが、例えば、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２、などが挙げられる。
本明細書で使用するとき、プロテアーゼ（例えば、本発明のプロテアーゼ変異体）の「洗浄性能」は、組成物にプロテアーゼ変異体を加えていない洗剤と比較して、追加のクリーニング性能を洗剤に付与するプロテアーゼ変異体の洗浄への貢献を指す。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。一部の試験系では、洗剤組成物、泡濃度、水硬度、洗浄機構、時間、ｐＨ、及び／又は温度などの他の関連する要因を、特定のマーケットセグメントにおける家事用途に典型的な条件（例えば、食器手洗い又は食器手動洗浄、自動食器洗浄、食器クリーニング、食卓用食器類クリーニング、及び布地クリーニングなど）を模倣するように調節することができる。
本明細書において、用語「関連する洗浄条件」は、食器手洗い、自動食器洗浄、又は洗濯洗剤のマーケットセグメントに含まれる家事で実際に使用される条件であって、具体的には、洗浄温度、時間、洗浄機構、泡濃度（sud concentration）、洗剤のタイプ及び水硬度などの条件を意味する。
用語「洗浄性能の改善」は、関連する洗浄条件下で、染み除去において、より良好な仕上がり結果が得られること、又は対応する野生型若しくは開始親プロテアーゼと比較して同様の仕上がり結果を得るにあたり必要とされるプロテアーゼ変異体が重量ベースでより少量ですむことを表すのに使用される。
本明細書で使用するとき、用語、「消毒」は、汚染物質を表面から除去すること、並びに、物品の表面上の微生物の阻害又は死滅を指す。本発明は、任意の特定の表面、物品、又は除去される汚染物若しくは微生物に限定されないと意図される。
本明細書では、「コンパクト」形態のクリーニング組成物は、密度によって最善に表され、組成の点で言えば無機塩充填剤の量によって最善に表される。無機塩充填剤は、粉末形態の洗剤組成物の通常の成分である。通常の洗剤組成物では、無機塩充填剤は、相当量で、典型的には組成物全体の約１７〜約３５重量％で存在する。対照的に、コンパクト組成物では、塩充填剤は、組成物全体の約１５重量％以下の量で存在する。一部の実施形態では、無機塩充填剤は、組成物の約１０重量％以下、より好ましくは約５％重量以下の量で存在する。一部の実施形態では、無機塩充填剤は、硫酸アルカリ塩及びアルカリ土類金属塩、並びアルカリ塩化物及びアルカリ土類金属塩化物から選択される。一部の実施形態では、塩充填剤は硫酸ナトリウムである。
所与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置は、本明細書では典型的には、配列番号３に示されるゲオバチルス・カルドプロテオリティカス（G. caldoproteolyticus）サーモリシンのアミノ酸配列における対応するアミノ酸残基の位置に割り振られた番号を用いて番号付けされる。すなわち、配列番号３に示されるゲオバチルス・カルドプロテオリティカスサーモリシンのアミノ酸配列は、基準配列となる。本明細書に記載されるプロテアーゼ変異体のアミノ酸配列などの、所与のアミノ酸配列は、本明細書に記載されるアラインメントアルゴリズムを使用してゲオバチルス・カルドプロテオリティカスの配列（配列番号３）と整列させることができ、ゲオバチルス・カルドプロテオリティカスの配列中のアミノ酸残基と整列する（好ましくは最適に整列する）所与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基を、ゲオバチルス・カルドプロテオリティカスサーモリシンの配列中の対応するアミノ酸残基を参照することで、都合よく番号付けすることができる。
概して、本明細書で使用する命名法、並びに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、分子生物学、核酸化学、及びタンパク質化学的な実験手順の多くは周知のものであり、当業者により一般的に採用される。組み換え核酸の製造及び操作法、核酸合成法、細胞培養法、及びトランスジーンの組み込み法（例えば、トランスフェクション、電気穿孔法）は当業者に既知のものであり、様々な一般的な文献に記載されている。オリゴヌクレオチドの合成工程及び精製工程は、典型的には本明細書に従って実施される。概して技術及び手順は、当業者に周知の従来法、並びに本明細書を通して提供される様々な一般参考文献に従って実施される。それらの手順は当業者に周知のものであると考えられ、読み手には便宜のため提供される。
本発明のサーモリシン酵素
本明細書で使用するとき、サーモリシン酵素には、酵素、ポリポリペプチド又はタンパク質、或いはその活性断片が包含される。これにはペプチダーゼファミリーＭ４のファミリーメンバーも包含され、そのプロトタイプがサーモリシン（ＴＬＮ；ＥＣ ３．４．２４．２７）である。
サーモリシン酵素の生産的位置
本発明は、洗剤組成物において有用となり得るサーモリシン酵素におけるアミノ酸位置であって、当該アミノ酸位置における好ましい改変によって、洗浄性能、洗剤組成物中での酵素安定性、および酵素の熱安定性に関する最小性能指数が得られ、更には親酵素サーモリシンよりもこれらの特性のうち少なくとも１つが改善された、アミノ酸位置を提供する。これらの改変は、本発明の好適な改変と考えられる。
本発明のサーモリシン酵素の安定性は、標準の、例えば配列番号３のゲオバチルス・カルドプロテオリティカスのサーモリシンの安定性と比較することができる。
「熱的安定性」及び「熱安定性」なる用語は、脂肪分解プロセス、加水分解プロセス、クリーニングプロセス、又は本明細書において開示される他のプロセスの際に一般に使用される条件下で一定の時間にわたって特定の温度に曝された後に（例えば、変化した温度に曝されている間に）、所定量の酵素活性を維持する本開示のサーモリシンを指す。変化した温度には、温度の上昇又は低下が含まれる。一部の実施形態では、サーモリシン変異体（variant thermolysin variant）は、例えば、少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分などの所定の時間にわたって変化した温度に晒された後でも、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のサーモリシン活性を保持する。
本明細書で使用するとき、特性が改善されたサーモリシン変異体としては、対応する親酵素サーモリシン（例えば、野生型又は天然起源のサーモリシン酵素）と比較してその洗浄性能若しくはクリーニング性能が改善又は増強された、並びに／又は任意選択で洗浄若しくはクリーニング性能は保持されているが安定性が改善又は増強された、プロテアーゼ変異体が挙げられる。サーモリシン酵素変異体の特性の改善には、洗浄若しくはクリーニング性能の改善及び／又は安定性の改善が含まれ得る。一部の実施形態では、本発明は、次の特性のうち１つ以上を示す本発明のサーモリシン酵素変異体を提供する。すなわち、基準とする親酵素サーモリシン（例えば、配列番号３の配列を有する野生型サーモリシンなどの、野生型サーモリシン酵素）と比較して、手洗い洗浄性能の改善、食器手洗い性能又は手動食器洗浄性能の改善、自動食器洗浄機洗浄性能の改善、洗濯性能の改善、並びに／又は安定性の改善。
生産的位置は、特性の改善を示すコンビナトリアル変異体を作製するのに最も有用な分子内の位置として記載されており、この位置では、少なくとも１つの組み合わせ可能な変異が許容される。組み合わせ可能な変異は、コンビナトリアル変異体を作製するのに使用することのできる分子内の置換として記載され得る。組み合わせ可能な変異は、少なくとも１つの所望の分子特性を改善する一方で、発現、活性又は安定性をいずれも有意に低下させないものである。
組み合わせ可能な変異は、少なくとも１つの所望の分子特性を改善する一方で、発現、活性又は安定性をいずれも有意に低下させないものである。例えば、サーモリシンにおける組み合わせ可能な変異は、実施例１に記載のアッセイ（Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａプロテアーゼアッセイ（活性）、ＰＡＳ−３８微小布見本アッセイ（活性）、洗剤安定性及び熱安定性アッセイ、並びにタンパク質定量（発現））によって得られる性能指数（ＰＩ）値を利用して決定することができる。
組み合わせ可能な変異の他に、サーモリシンの第二の群の変異は、組み合わせ可能な活性を有する変異である。組み合わせ可能な活性を有する変異とは、分子の少なくとも１つの活性特性を改善し、性能指数が１．５以上であり、発現又は安定性にかかるどちらのＰＩ値をも０．５より下に低下させない変異である。この組み合わせ可能な活性を有する変異を利用することで、分子の他の既知の望ましい特性（例えば、発現又は安定性）を有意に低下させることなく所望の特性を達成できるように、分子を改変することができる。
有用な位置であることが分かっているサーモリシン酵素のアミノ酸位置は、洗剤組成物で使用するのに好適な様々な改変を有し得る。改変としては、特定の位置での挿入、欠失又は置換を挙げることができる。一実施形態では、改変は置換である。各々の位置において、起こり得る好適な改変の数が多ければ、その位置での生産性スコアが高くなる。例えば、アミノ酸の位置は、好適な改変として生産的位置で試験された改変のうち少なくとも７５％、４０％又は１５％を有し得るが、その場合、改変は、次の適合性基準のうち少なくとも１つを満たす。
ａ）親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これらの試験のうちのいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
ｂ）親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、又は
ｃ）親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置。
本発明のサーモリシン酵素において、好適な改変として試験された改変のうち少なくとも７５％が生じる位置としては、２位、２６位、４７位、４９位、５３位、６５位、８７位、９１位、９６位、１０８位、１１８位、１２８位、１５４位、１７９位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２０９位、２１１位、２１７位、２１９位、２２５位、２３２位、２５６位、２５７位、２５９位、２６１位、２６５位、２６７位、２７２位、２７６位、２７７位、２８６位、２８９位、２９０位、２９３位、２９５位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０３位、３０５位、３０８位、３１１位、及び３１６位が挙げられる（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。好適な改変としては、２位（Ｔ，Ｆ，Ｌ，Ｐ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ｑ，Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｋ，Ｍ）、２６位（Ｔ，Ｋ，Ｌ，Ｒ，Ｖ，Ｙ，Ｗ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｃ，Ｄ）、４７位（Ｒ，Ａ，Ｃ，Ｈ，Ｋ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｔ）、４９位（Ｔ，Ａ，Ｄ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｓ，Ｗ，Ｌ，Ｎ，Ｑ，Ｖ，Ｅ，Ｍ，Ｙ）、５３位（Ｓ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｑ，Ｔ，Ｗ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｎ，Ｖ，Ｃ，Ｌ）、６５位（Ｓ，Ｉ，Ｍ，Ｑ，Ｖ，Ｌ，Ｔ，Ｗ，Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｐ，Ｙ）、８７位（Ｖ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｉ，Ｓ，Ｐ，Ｒ，Ｔ，Ｃ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ，Ｙ）、９１位（Ｌ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｋ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ａ，Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ｙ）、９６位（Ｎ，Ｃ，Ｄ，Ｉ，Ｖ，Ｆ，Ｔ，Ｇ，Ｈ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｗ，Ｋ，Ｌ，Ｙ）、１０８位（Ｑ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ａ，Ｄ，Ｉ，Ｋ，Ｎ，Ｌ，Ｍ）、１１８位（Ｓ，Ｃ，Ｇ，Ｅ，Ａ，Ｄ，Ｍ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｖ）、１２８位（Ｑ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｓ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ａ，Ｌ，Ｙ）、１５４位（Ｇ，Ｌ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｄ，Ｉ，Ｗ，Ｃ，Ｎ，Ａ，Ｈ，Ｋ，Ｍ，Ｙ）、１７９位（Ｙ，Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｆ）、１９６位（Ｇ，Ｄ，Ｅ，Ｔ，Ｋ，Ｒ，Ｖ，Ｈ，Ｌ，Ｙ，Ａ，Ｗ）、１９７位（Ｉ，Ｄ，Ｋ，Ｌ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ａ，Ｈ，Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｒ，Ｆ，Ｃ）、１９８位（Ｓ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｋ）、１９９位（Ｇ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｌ，Ａ，Ｙ）、２０９位（Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｇ，Ｉ，Ｋ，Ｐ，Ｒ，Ｙ，Ｃ，Ｍ）、２１１位（Ｙ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｅ，Ｒ）、２１７位（Ｙ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｇ，Ａ，Ｆ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｌ）、２１９位（Ｋ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ａ，Ｅ，Ｒ，Ｓ）、２２５位（Ｑ，Ｄ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｍ，Ｒ，Ｃ，Ｅ，Ｋ，Ｌ，Ｓ）、２３２位（Ｉ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ，Ｇ，Ｌ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）、２５６位（Ｖ，Ｌ，Ｔ，Ｋ，Ａ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｒ，Ｓ，Ｎ）、２５７位（Ｇ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｙ，Ｋ，Ｒ）、２５９位（Ｇ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，Ｗ，Ｋ，Ｒ，Ｎ，Ｓ，Ｔ）、２６１位（Ｄ，Ａ，Ｎ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｓ）、２６５位（Ｋ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｒ，Ｎ）、２６７位（Ｆ，Ｅ，Ｇ，Ｎ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｃ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｔ，Ｙ）、２７２位（Ｔ，Ｅ，Ｌ，Ｖ，Ｗ，Ｐ，Ｙ，Ｃ，Ｆ，Ｎ，Ｑ，Ａ，Ｋ）、２７６位（Ｔ，Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｐ，Ｑ，Ｗ，Ｈ，Ａ，Ｌ，Ｖ，Ｙ）、２７７位（Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｎ，Ｒ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｄ，Ｙ）、２８６位（Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｓ，Ｐ，Ｃ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｙ）、２８９位（Ｖ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｎ，Ｓ，Ｗ，Ｒ，Ｔ，Ｌ，Ｍ，Ｙ，Ａ）、２９０位（Ｑ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｌ，Ｗ，Ｙ，Ｒ，Ｔ，Ｖ，Ａ，Ｈ，Ｎ）、２９３位（Ｔ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｑ，Ｓ，Ｎ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｙ）、２９５位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｎ，Ｔ，Ｖ，Ｆ，Ｇ，Ａ，Ｋ，Ｍ，Ｗ）、２９８位（Ｓ，Ｃ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｅ，Ｎ，Ｐ，Ａ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｒ）、２９９位（Ｔ，Ｃ，Ｆ，Ｌ，Ｍ，Ｒ，Ｗ，Ｐ，Ｄ，Ｑ，Ｎ，Ａ，Ｋ）、３００位（Ｓ，Ｃ，Ｋ，Ｍ，Ｒ，Ｙ，Ｉ，Ｌ，Ｈ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｄ，Ｎ）、３０１位（Ｑ，Ｅ，Ｈ，Ｐ，Ｒ，Ｌ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｗ，Ｍ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｋ）、３０３位（Ｖ，Ｃ，Ｈ，Ｇ，Ｋ，Ｌ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｐ，Ｙ）、３０５位（Ｓ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｗ，Ｙ，Ｑ，Ｈ，Ｔ，Ｖ，Ａ，Ｋ，Ｍ）、３０８位（Ｑ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｍ，Ｒ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ａ，Ｌ）、３１１位（Ｄ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ａ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｖ，Ｗ，Ｙ）、及び３１６位（Ｋ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｌ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ａ，Ｍ）が挙げられる（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
本発明のサーモリシン酵素において、好適な改変として試験された改変のうち少なくとも４０％でかつ７５％未満が生じる位置としては、１位、４位、１７位、２５位、４０位、４５位、５６位、５８位、６１位、７４位、８６位、９７位、１０１位、１０９位、１４９位、１５０位、１５８位、１５９位、１７２位、１８１位、２１４位、２１６位、２１８位、２２１位、２２２位、２２４位、２５０位、２５３位、２５４位、２５８位、２６３位、２６４位、２６６位、２６８位、２７１位、２７３位、２７５位、２７８位、２７９位、２８０位、２８２位、２８３位、２８７位、２８８位、２９１位、２９７位、３０２位、３０４位、３０７位、及び３１２位が挙げられる（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。好適な改変としては、１位（Ｉ，Ｋ，Ｍ，Ｖ，Ａ，Ｈ，Ｗ，Ｙ，Ｃ，Ｌ）、４位（Ｔ，Ｅ，Ａ，Ｎ，Ｒ，Ｖ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｙ）、１７位（Ｑ，Ｉ，Ｗ，Ｙ，Ｃ，Ｒ，Ｖ，Ｔ，Ｌ）、２５位（Ｓ，Ｄ，Ｆ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｍ，Ｒ）、４０位（Ｆ，Ｅ，Ｇ，Ｍ，Ｑ，Ｓ，Ｙ，Ｗ，Ａ，Ｋ，Ｌ）、４５位（Ｋ，Ｅ，Ｌ，Ｓ，Ｆ，Ｈ，Ｑ，Ｙ，Ａ，Ｇ，Ｍ）、５６位（Ａ，Ｋ，Ｑ，Ｖ，Ｗ，Ｈ，Ｉ，Ｙ，Ｅ，Ｍ）、５８位（Ａ，Ｎ，Ｙ，Ｃ，Ｖ，Ｅ，Ｌ）、６１位（Ｑ，Ｍ，Ｒ，Ｗ，Ｆ，Ｖ，Ｃ，Ｉ，Ｌ）、７４位（Ｈ，Ｅ，Ｌ，Ｖ，Ｃ，Ｆ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ）、８６位（Ｎ，Ｌ，Ｓ，Ｙ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｋ，Ｄ）、９７位（Ｎ，Ｋ，Ｃ，Ｒ，Ｓ，Ｙ，Ｅ，Ｍ）、１０１位（Ｒ，Ｔ，Ｃ，Ｌ，Ｓ，Ｈ）、１０９位（Ｇ，Ａ，Ｌ，Ｓ，Ｅ，Ｍ，Ｒ，Ｗ）、１４９位（Ｔ，Ｍ，Ｖ，Ａ，Ｌ，Ｄ，Ｓ，Ｎ）、１５０位（Ｄ，Ａ，Ｆ，Ｋ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｓ）、１５８位（Ｑ，Ａ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｌ，Ｒ，Ｙ，Ｓ）、１５９位（Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｍ，Ｔ，Ｓ，Ｙ）、１７２位（Ｆ，Ｇ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ｄ，Ｈ）、１８１位（Ｎ，Ｌ，Ａ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｔ，Ｓ）、２１４位（Ｐ，Ｃ，Ｇ，Ｋ，Ｓ，Ｎ，Ａ，Ｒ）、２１６位（Ｈ，Ｃ，Ｅ，Ｓ，Ｔ，Ｒ，Ａ）、２１８位（Ｓ，Ｋ，Ｌ，Ｙ，Ｆ，Ｇ，Ｔ，Ｖ）、２２１位（Ｙ，Ｋ，Ｎ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ａ，Ｆ，Ｇ，Ｍ）、２２２位（Ｔ，Ｃ，Ｄ，Ｌ，Ｙ，Ｉ，Ｖ，Ａ，Ｍ，Ｋ）、２２４位（Ｔ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｌ，Ｐ，Ｑ，Ｖ，Ｙ，Ｅ，Ｈ）、２５０位（Ｈ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｖ，Ｙ）、２５３位（Ｖ，Ｎ，Ｔ，Ｉ，Ｒ，Ｙ，Ｍ，Ｑ）、２５４位（Ｓ，Ａ，Ｍ，Ｒ，Ｙ，Ｋ，Ｌ，Ｎ，Ｖ，Ｗ）、２５８位（Ｉ，Ｅ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｑ，Ｖ）、２６３位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｑ，Ｔ，Ｈ，Ｋ，Ｎ，Ｖ，Ａ，Ｍ）、２６４位（Ｇ，Ｃ，Ｒ，Ａ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ）、２６６位（Ｉ，Ａ，Ｆ，Ｌ，Ｓ，Ｃ，Ｍ，Ｔ，Ｖ）、２６８位（Ｙ，Ｍ，Ｑ，Ｖ，Ａ，Ｓ，Ｋ）、２７１位（Ｌ，Ａ，Ｄ，Ｆ，Ｉ，Ｎ，Ｙ，Ｈ）、２７３位（Ｑ，Ａ，Ｈ，Ｙ，Ｃ，Ｓ，Ｗ，Ｅ，Ｇ，Ｎ）、２７５位（Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｖ，Ｃ，Ｑ，Ｓ，Ｔ）、２７８位（Ｔ，Ｇ，Ｋ，Ｒ，Ｙ，Ｃ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｓ）、２７９位（Ｓ，Ａ，Ｄ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ｇ）、２８０位（Ｎ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｑ，Ｈ，Ｔ）、２８２位（Ｓ，Ｋ，Ｎ，Ｒ，Ａ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，Ｔ）、２８３（Ｑ，Ｋ，Ｌ，Ｐ，Ｒ，Ｗ，Ｙ，Ｓ）、２８７位（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｖ，Ｙ，Ｋ，Ｒ，Ｔ，Ｄ，Ｃ）、２８８位（Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｍ）、２９１位（Ｓ，Ｅ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｖ，Ａ，Ｔ）、２９７位（Ｇ，Ａ，Ｍ，Ｒ，Ｙ，Ｃ，Ｆ，Ｋ，Ｔ，Ｄ，Ｎ）、３０２位（Ｅ，Ｋ，Ｌ，Ｇ，Ｔ，Ｖ，Ｄ，Ｑ，Ａ）、３０４位（Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｅ，Ｋ，Ｙ）、３０７位（Ｋ，Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｉ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｒ，Ｗ，Ｙ，Ｈ）、及び３１２位（Ａ，Ｇ，Ｍ，Ｖ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｔ，Ｃ）が挙げられる（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
本発明のサーモリシン酵素において、好適な改変として試験された改変のうち少なくとも１５％でかつ４０％未満が生じる位置としては、５位、９位、１１位、１９位、２７位、３１位、３３位、３７位、４６位、６４位、７３位、７６位、７９位、８０位、８５位、８９位、９５位、９８位、９９位、１０７位、１２７位、１２９位、１３１位、１３７位、１４１位、１４５位、１４８位、１５１位、１５２位、１５５位、１５６位、１６０位、１６１位、１６４位、１６８位、１７１位、１７６位、１８０位、１８２位、１８７位、１８８位、２０５位、２０６位、２０７位、２１０位、２１２位、２１３位、２２０位、２２７位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２４２位、２４４位、２４６位、２４８位、２４９位、２５２位、２５５位、２７０位、２７４位、２８４位、２９４位、２９６位、３０６位、３０９位、３１０位、３１３位、３１４位、及び３１５位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。好適な改変としては、５位（Ｓ，Ｄ，Ｎ，Ｐ，Ｈ，Ｌ）、９位（Ｖ，Ｌ，Ｔ，Ｉ）、１１位（Ｒ，Ｉ，Ｙ，Ｋ）、１９位（Ｎ，Ｌ，Ｙ，Ｋ，Ｓ）、２７位（Ｙ，Ｗ，Ａ，Ｍ，Ｖ，Ｃ，Ｌ）、３１位（Ｑ，Ａ，Ｋ，Ｖ，Ｉ，Ｃ，Ｙ）、３３位（Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｋ，Ａ，Ｃ，Ｌ，Ｍ）、３７位（Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｒ，Ｌ，Ｋ）、４６位（Ｙ，Ｌ，Ｈ，Ｎ，Ｃ）、６４位（Ａ，Ｈ，Ｑ，Ｔ，Ｄ，Ｅ）、７３位（Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｌ，Ｍ，Ｗ）、７６位（Ｙ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｔ）、７９位（Ｖ，Ｌ，Ｑ，Ｔ，Ａ，Ｎ，Ｓ）、８０位（Ｔ，Ｉ，Ｄ，Ａ，Ｌ，Ｎ）、８５位（Ｋ，Ｅ，Ａ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｓ）、８９位（Ｎ，Ｌ，Ｍ，Ｈ）、９５（Ｇ，Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｓ）、９８位（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｈ，Ｒ，Ｙ，Ｋ，Ｖ）、９９位（Ａ，Ｅ，Ｋ，Ｐ，Ｒ，Ｓ）、１０７位（Ｓ，Ｄ，Ｋ，Ｙ，Ａ，Ｇ）、１２７位（Ｇ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）、１２９位（Ｔ，Ｉ，Ｒ，Ｅ，Ｙ，Ｌ，Ｍ）、１３１位（Ｉ，Ｙ，Ｗ，Ｌ）、１３７位（Ｉ，Ｐ，Ａ，Ｅ，Ｔ，Ｖ，Ｌ）、１４１位（Ａ，Ｓ，Ｃ，Ｇ）、１４５位（Ｔ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｍ，Ｎ，Ｑ）、１４８位（Ｖ，Ｌ，Ｎ，Ｙ，Ｍ，Ａ，Ｑ）、１５１位（Ｙ，Ｋ，Ｇ，Ｈ，Ｓ，Ｗ）、１５２位（Ｔ，Ｓ，Ｌ，Ｍ，Ｇ）、１５５位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｍ）、１５６位（Ｉ，Ｍ，Ｔ，Ｌ，Ｑ）、１６０位（Ｅ，Ｌ，Ｙ，Ｑ）、１６１位（Ｓ，Ａ，Ｎ，Ｐ，Ｔ）、１６４位（Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｃ，Ａ）、１６８位（Ｉ，Ａ，Ｍ，Ｔ，Ｌ）、１７１位（Ｉ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｌ，Ｓ，Ｇ）、１７６位（Ｖ，Ｌ，Ｎ，Ｃ）、１８０位（Ａ，Ｅ，Ｇ，Ｋ，Ｔ，Ｓ）、１８２位（Ｋ，Ｌ，Ａ，Ｗ）、１８７位（Ｅ，Ｌ，Ｄ）、１８８位（Ｉ，Ｌ，Ｖ）、２０５位（Ｍ，Ｌ，Ａ，Ｖ，Ｑ）、２０６位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｒ）、２０７位（Ｄ，Ａ，Ｈ，Ｎ）、２１０位（Ｋ，Ｉ，Ｌ，Ｖ）、２１２位（Ｇ，Ｙ，Ａ，Ｄ，Ｑ）、２１３位（Ｄ，Ｎ，Ｓ，Ｌ，Ａ，Ｇ，Ｗ）、２２０位（Ｒ，Ｋ，Ｖ，Ａ）、２２７位（Ｎ，Ｄ，Ｌ，Ｙ，Ａ）、２３４位（Ｓ，Ｄ，Ｎ，Ａ，Ｃ）、２３５位（Ｇ，Ｍ，Ｃ，Ｑ，Ｓ，Ａ）、２３６位（Ｉ，Ｍ，Ａ，Ｃ）、２３７位（Ｉ，Ｎ，Ｆ，Ｍ）、２４２位（Ｙ，Ｃ，Ｆ，Ｎ，Ｖ）、２４４位（Ｉ，Ｔ，Ｖ，Ｆ，Ａ，Ｍ，Ｌ）、２４６位（Ｑ，Ｅ，Ｎ，Ｔ，Ｌ，Ｃ，Ｄ）、２４８位（Ｇ，Ａ，Ｅ，Ｓ）、２４９位（Ｔ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｌ，Ｙ，Ｐ）、２５２位（Ｇ，Ｋ，Ｙ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｗ）、２５５位（Ｖ，Ｌ，Ｐ，Ａ，Ｙ，Ｍ，Ｎ）、２７０位（Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｓ，Ｇ）、２７４位（Ｙ，Ｆ，Ｈ，Ａ，Ｃ，Ｑ，Ｔ，Ｍ）、２８４位（Ｌ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｍ，Ｙ）、２９４位（Ｄ，Ａ，Ｖ，Ｑ，Ｎ）、２９６位（Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｒ，Ｈ，Ｗ，Ｍ）、３０６位（Ｖ，Ａ，Ｓ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｔ）、３０９位（Ａ，Ｇ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｃ）、３１０位（Ｆ，Ａ，Ｃ，Ｗ，Ｍ）、３１３位（Ｖ，Ｔ，Ａ，Ｇ，Ｌ，Ｉ，Ｃ）、３１４位（Ｇ，Ａ，Ｅ，Ｈ，Ｍ，Ｓ，Ｗ，Ｑ）、及び３１５位（Ｖ，Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｍ，Ｌ，Ｔ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
本発明のサーモリシン酵素において、少なくとも１つの改変でかつ好適な改変として試験された改変のうち１５％未満が生じる位置としては、３位、６位、７位、２０位、２３位、２４位、４４位、４８位、５０位、５７位、６３位、７２位、７５位、８１位、９２位、９３位、９４位、１００位、１０２位、１０３位、１０４位、１１０位、１１７位、１２０位、１３４位、１３５位、１３６位、１４０位、１４４位、１５３位、１７３位、１７４位、１７５位、１７８位、１８３位、１８５位、１８９位、１９３位、２０１位、２２３位、２３０位、２３８位、２３９位、２４１位、２４７位、２５１位、２６０位、２６２位、２６９位、及び２８５位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。好適な改変としてはは、３位（Ｇ，Ｙ）、６位（Ｔ，Ｃ，Ｖ）、７位（Ｖ，Ｌ，Ｉ）、２０位（Ｉ，Ｌ，Ｖ）、２３位（Ｔ，Ｆ，Ｗ）、２４位（Ｙ，Ｗ）、４４位（Ａ，Ｃ）、４８位（Ｔ，Ｅ，Ｄ）、５０位（Ｌ，Ｐ）、５７位（Ｄ，Ｋ）、６３位（Ｆ，Ｙ，Ｃ）、７２位（Ｄ，Ｆ，Ｗ）、７５位（Ｙ，Ａ）、８１位（Ｙ，Ｆ）、９２位（Ｓ，Ｌ）、９３位（Ｙ，Ｔ，Ｃ）、９４（Ｄ，Ｔ）、１００位（Ｉ，Ｌ，Ｖ）、１０２位（Ｓ，Ｇ，Ｎ）、１０３位（Ｓ，Ｔ）、１０４位（Ｖ，Ａ）、１１０位（Ｙ，Ｌ）、１１７位（Ｇ，Ｈ）、１２０位（Ｍ，Ｌ）、１３４位（Ｓ，Ａ，Ｐ）、１３５位（Ｇ，Ａ）、１３６位（Ｇ，Ａ，Ｓ）、１４０位（Ｖ，Ｄ）、１４４位（Ｌ，Ｔ）、１５３位（Ａ，Ｔ）、１７３位（Ｇ，Ａ，Ｃ）、１７４位位（Ｔ，Ｃ，Ａ）、１７５位（Ｌ，Ｈ，Ｓ）、１７８位（Ｆ，Ｈ，Ｙ）、１８３位（Ｎ，Ｓ）、１８５位（Ｄ，Ｅ）、１８９（Ｇ，Ａ）、１９３位（Ｙ，Ｆ）、２０１位（Ｓ，Ｃ，Ａ）、２２３位（Ｇ，Ｄ，Ｋ）、２３０位（Ｖ，Ａ）、２３８位（Ｎ，Ｌ，Ｍ）、２３９位（Ｋ，Ａ）、２４１位（Ａ，Ｌ，Ｓ）、２４７位（Ｇ，Ａ，Ｓ）、２５１位（Ｙ，Ｍ）、２６０位（Ｒ，Ａ，Ｎ）、２６２位（Ｋ，Ａ）、２６９位（Ｒ，Ｖ，Ｋ）、及び２８５位（Ｒ，Ｋ，Ｙ）が挙げられる（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
これらアミノ酸の位置は、親酵素サーモリシンに対する改変を組み合わせるために有用な位置であると考えられる。したがって、本発明は、前記位置のいずれかにおいて１つ以上の改変を有するサーモリシン酵素を包含する。好適な改変としては、１位（Ｉ，Ｖ）、２位（Ｔ，Ｃ，Ｉ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｖ）、１２７位（Ｇ，Ｃ）、１２８位（Ｑ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｖ，Ｙ）、１８０位（Ａ，Ｅ，Ｎ）、１８１位（Ｎ，Ａ，Ｇ，Ｑ，Ｓ）、１９６位（Ｇ，Ｌ，Ｙ）、１９７位（Ｉ，Ｆ）、１９８位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）、２１１位（Ｙ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ）、２２４位（Ｔ，Ｄ，Ｈ，Ｙ）、２９８位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｗ，Ｙ）、２９９位（Ｔ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｗ）、及び３１６位（Ｋ，Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）が挙げられる（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
サーモリシン酵素の好適な改変
本発明は、親酵素サーモリシンに１つ以上の改変を生じさせて得られたサーモリシン酵素変異体を包含する。酵素変異体は、洗浄性能、洗剤組成物中の酵素の安定性及び酵素の熱安定性に関する最小性能指数を有し、更に、これらの特性のうち少なくとも一つが親酵素サーモリシンよりも改善されていることにより、洗剤組成物中で有用であり得る。
親酵素サーモリシンに比べて改善された洗剤安定性又は熱安定性を有しており、そして改変が、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列中の残基全てに関する主鎖平均温度因子よりも観測された分散の１．５倍超大きい温度因子を有する位置で生じる本発明のサーモリシン酵素の位置は、例えば１位、２位、１２７位、１２８位、１８０位、１８１位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２１１位、２２３位、２２４位、２９８位、２９９位、３００位、及び３１６位が挙げられる（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
好適なサーモリシン変異体は、高分子を構成する個々の原子の相対運動の尺度である結晶学的温度因子に基づいて、温度因子が増加する位置に改変を包含し得る。温度因子は、個々の結晶Ｘ線回折強度の最大値として与えられる回折パターン計算値が観測パターンと最も良くマッチするように結晶学的モデルを精密化した成果、生じるものである。運動性が高い原子が散乱角（θ）の関数としての高分子凝集体全体の回折を減少させる効果があることを反映するように、次の式：−ｅｘｐ（−Ｂｓｉｎ２θ／λ）（式中、Ｂは、温度因子である）を用いて温度因子を減衰係数として精密化することができる（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｌ．Ｎ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９７６年）１２１頁）。全体的に運動性が高い領域は、折り畳まれた高分子の安定性が低い場所を表し、そのため、温度の増加又は変性剤によって分子がストレスを受けるとアンフォールディングが始まる場所を表す可能性が高い。さらに、全体的に運動性が高いこれらの領域は、平均温度因子が最も高い領域であるとも見込まれる。
サーモリシンのコンセンサス柔軟性領域として算出された領域には、１位〜２位、１２７位〜１２８位、１８０位〜１８１位、１９５位〜１９９位、２１１位、２２３位〜２２４位、２９８位〜３００位及び３１６位の領域が含まれる。これら各領域を利用することで、サーモリシンを改変して、熱安定性または洗濯性能の改善を達成することができる。高い温度因子（柔軟性の高い領域）を有する位置に改変を生じることによって熱安定性又は洗濯性能の改善のいずれかを付与する組み合わせ可能な変異体の位置としては、１位、２位、１２７位、１２８位、１８０位、１８１位、１９６位、１９７位、１９８位、２１１位、２２４位、２９８位、２９９位、及び３１６位が挙げられる。好適な改変としては、１位（Ｉ，Ｖ）、２位（Ｔ，Ｃ，Ｉ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｖ）、１２７位（Ｇ，Ｃ）、１２８位（Ｑ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｖ，Ｙ）、１８０位（Ａ，Ｅ，Ｎ）、１８１位（Ｎ，Ａ，Ｇ，Ｑ，Ｓ）、１９６位（Ｇ，Ｌ，Ｙ）、１９７位（Ｉ，Ｆ）、１９８位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）、２１１位（Ｙ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ）、２２４位（Ｔ，Ｄ，Ｈ，Ｙ）、２９８位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｗ，Ｙ）、２９９位（Ｔ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｗ）、３１６位（Ｋ，Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）が挙げられる（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
組み合わせ可能な活性を有する変異
組み合わせ可能な変異の他に、サーモリシンに関する第二の群の変異は、組み合わせ可能な活性を有する変異がある。組み合わせ可能な活性を有する変異とは、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄を有し、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性が１．５以上であり、更に、洗剤安定性及び熱安定性に関するＰＩ値を０．５より下に低下させないものである。組み合わせ可能な活性を有する変異の位置としては、１７位、１９位、２４位、２５位、３１位、３３位、４０位、４８位、７３位、７９位、８０位、８１位、８５位、８６位、８９位、９４位、１０９位、１１７位、１４０位、１４１位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５６位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６８位、１７１位、１７４位、１７５位、１７６位、１７８位、１８０位、１８１位、１８２位、１８３位、１８９位、２０５位、２０６位、２０７位、２１０位、２１２位、２１３位、２１４位、２１８位、２２３位、２２４位、２２７位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４１位、２４４位、２４６位、２４８位、２４９位、２５０位、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、２５８位、２５９位、２６０位、２６１位、２６２位、２６６位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２７３位、２７４位、２７６位、２７８位、２７９位、２８０位、２８２位、２８３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、３００位、３０２位、３０６位、３１０位、及び３１２位からなる群から選択される位置が挙げられる（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。組み合わせ可能な活性を有する変異としては、１７位（Ｅ，Ｆ，Ｐ）、１９位（Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｉ，Ｒ，Ｔ，Ｖ）、２４位（Ｆ，Ｈ）、２５位（Ｈ）、３１位（Ｌ）、３３位（Ｑ）、４０位（Ｃ）、４８位（Ａ，Ｒ）、７３位（Ｙ）、７９位（Ｃ）、８０位（Ｃ，Ｒ）、８１位（Ｈ）、８５位（Ｃ，Ｍ，Ｙ）、８６位（Ｖ）、８９位（Ｋ，Ｒ，Ｔ，Ｖ）、９４位（Ｅ）、１０９位（Ｄ）、１１７位（Ａ，Ｋ，Ｒ，Ｔ）、１４０位（Ｓ）、１４１位（Ｔ）、１５０位（Ｅ，Ｍ，Ｗ）、１５１位（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｉ）、１５２位（Ｄ）、１５３位（Ｖ）、１５６位（Ｈ，Ｒ）、１５８位（Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｖ）、１５９位（Ｆ，Ｉ，Ｋ）、１６０位（Ｓ）、１６１位（Ｙ）、１６８位（Ｎ）、１７１位（Ｄ）、１７４位（Ｓ，Ｖ）、１７５位（Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ）、１７６位（Ｅ，Ｑ）、１７８位（Ｃ，Ｍ）、１８０位（Ｌ，Ｗ）、１８１位（Ｙ）、１８２位（Ｆ，Ｒ）、１８３位（Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｒ，Ｔ）、１８９位（Ｃ）、２０５位（Ｃ，Ｆ）、２０６位（Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）、２０７位（Ｔ）、２１０位（Ａ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｔ）、２１２位（Ｆ，Ｈ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ｔ）、２１３位（Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｖ，Ｙ）、２１４位（Ｑ）、２１８位（Ｒ）、２２３位（Ｙ）、２２４位（Ｉ，Ｒ）、２２７位（Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｋ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ）、２３５位（Ｄ，Ｌ，Ｔ）、２３６位（Ｐ）、２３７位（Ａ，Ｑ）、２３８位（Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｓ）、２３９位（Ｃ，Ｇ，Ｈ，Ｌ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｖ，Ｙ）、２４１位（Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｔ，Ｖ）、２４４位（Ｑ）、２４６位（Ｋ，Ｒ）、２４８位（Ｃ，Ｈ）、２４９位（Ｇ，Ｖ）、２５０位（Ｆ，Ｓ）、２５１位（Ｈ）、２５２位（Ｆ，Ｉ，Ｌ）、２５３位（Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｐ）、２５４位（Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ）、２５５位（Ｆ，Ｑ）、２５８位（Ｆ）、２５９位（Ｉ）、２６０位（Ｃ，Ｄ，Ｉ）、２６１位（Ｋ，Ｒ，Ｔ）、２６２位（Ｃ，Ｆ，Ｈ，Ｌ，Ｐ，Ｒ）、２６６位（Ｗ）、２６８位（Ｆ，Ｒ）、２６９位（Ｐ，Ｔ，Ｗ，Ｙ）、２７０位（Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｖ）、２７１位（Ｖ）、２７２位（Ｒ）、２７３位（Ｒ）、２７４位（Ｄ，Ｅ）、２７６位（Ｇ，Ｓ）、２７８位（Ｖ）、２７９位（Ｅ）、２８０位（Ｐ，Ｒ，Ｖ）、２８２位（Ｐ）、２８３位（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｔ，Ｖ）、２９４位（Ｔ）、２９５位（Ｒ）、２９６位（Ｅ，Ｉ）、２９７位（Ｉ，Ｖ）、３００位（Ｑ）、３０２位（Ｗ）、３０６位（Ｙ）、３１０位（Ｉ，Ｎ）、及び３１２位（Ｑ）が挙げられる（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）。
本発明のポリペプチド
本発明は新規ポリペプチドを提供し、これらは集合的に「本発明のポリペプチド」と呼ばれ得る。本発明のポリペプチドは、例えば、酵素活性（例えば、サーモリシン活性）を有するサーモリシン酵素変異体ポリペプチドのような、単離された、組換え型の、実質的に純粋な、又は非天然起源のサーモリシン酵素変異体ポリペプチドを包含する。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、クリーニング用途に有用であり、クリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、物品の表面）をクリーニングする方法に有用なクリーニング組成物中に組み込まれ得る。
一部の実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、バチリス属又はゲオバチルス種由来の親酵素サーモリシンの変異体であり得る。互いに高い同一性を有しかつ配列番号３で示されるサーモリシン酵素とも高い同一性を有する様々なサーモリシン酵素が、バチリス属又はゲオバチルス種において見出されている。例えば、実施例４の表４．１及び図４．１を参照されたい。他の実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、表４．２に挙げる属のいずれかに由来する親酵素サーモリシンの変異体であってよく、前記属としては、バチルス属、ゲオバチルス種、アリシクロバチルス属、乳酸杆菌、エクシグオバクテリウム属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、ヘルペトシフォン属、オセアノバチルス属、シュワネラ属、クロストリジウム属、ブドウ球菌属、フラボバクテリウム属、スチグマテラ属、ミクソコッカス属、ビブリオ属、メタノサルシナ属、クリセオバクテリウム属、ストレプトマイセス属、クリベラ属、ジャニバクター属、ノカルジオイデス属、ザンタモナス属（Xanthamonas）、ミクロモノスポラ属、バークホルデリア属、デハロコッコイデス属、クロセイバクター、コルジア属、マイクロシーラ属、サーモアクチノミセス属、クロロフレクサス属、リステリア属、プレシオシスチス属、ハリスコメノバクター属、サイトファーガ属、ハヘラ属、アルスロバクター属、ブラキバクテリウム属、クラビバクター属、マイクロバクテリウム（Microbacterium）、イントラスポランギウム属、フランキア属、メイオテルムス属、シュードモナス属、トウゴマ属、カテヌリスポラ属、アナベナ属、ノストック属、ハロモナス属、クロモハロバクター属、ボルデテラ属、バリオボラックス属、ディケヤー属、ペクトバクテリウム属、シトロバクター属、エンテロバクター属、サルモネラ属、エルウィニア属、パントエア属、ラーネラ属、セラチア属、ゲオデルマトフィルス属、ゲンマタ属、ゼノラブダス属、フォトラブダス属、アスペルギルス属、ネオサルトリア属、ピレノフォラ属、サッカロポリスポラ属、ネクトリア属、ジベレラ属、メタリジウム属、ワドリア属、シアノセイス属、セルロファーガ属、プロビデンシア属、ブラディリゾビウム属、アグロバクテリウム属、ムシラジニバクター（Mucilaginibacter）、セラチア属、ソランジウム属、ストレプトスポランジウム属、レニバクテリウム属、アエロモナス属、レイネケア属、クロモバクテリウム属、モリテラ属、ハリアンギウム属（Haliangium）、カンギエラ属、マリノモナス属、ビブリオナレス属、リストネラ属、サリニビブリオ属、フォトバクテリウム属、アルテロモナダーレス属、レジオネラ属、テレディニバクター属、レイネケア属、ヒドロゲニビルガ属、及びシュードアルテロモナス属からなる群から選択される属が挙げられる。いくつかの実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、表４．１又は４．２に記載のいずれかの種に由来する親酵素サーモリシンの変異体であり得る。一部の実施形態では、サーモリシン変異体は、バチルス属、ゲオバチルス種、アリシクロバチルス属、乳酸杆菌、エクシグオバクテリウム属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、ヘルペトシフォン属、オセアノバチルス属、シュワネラ属、クロストリジウム属、ブドウ球菌属、フラボバクテリウム属、スチグマテラ属、ミクソコッカス属、ビブリオ属、メタノサルシナ属、クリセオバクテリウム属、及びシュードアルテロモナス属からなる群から選択される属の親酵素サーモリシンの変異体であってよい。
一部の実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、バチリス属又はゲオバチルス種由来のサーモリシン酵素と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する変異体であり得る。いくつかの実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、表４．１に挙げた任意の属由来のサーモリシン酵素と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する変異体であり得る。いくつかの実施形態では、サーモリシン酵素変異体は、表４．２に挙げた任意の属由来のサーモリシン酵素と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する変異体であり得る。
特定の実施形態では、本発明は、バチリス属又はゲオバチルス種由来の酵素である。特定の実施形態では、本発明は、ゲオバチルス・カルドプロテオリティカス種由来のサーモリシンから誘導される酵素である。
ゲオバチルス・カルドプロテオリティカスからクローニングされたサーモリシンに関連する組成物及び方法について説明する。当該組成物及び方法は、クローニング及び発現されたサーモリシンが、洗剤組成物の存在下でタンパク質分解活性を有するという観察に一部基づいたものである。サーモリシンはまた、洗剤組成物中で優れた安定性を示す。こうしたサーモリシンの特徴により、サーモリシンは、酵素が、洗剤組成物に含まれている界面活性剤及び他の成分の存在下でタンパク質を加水分解することができる、様々なクリーニング用途で使用するのによく適している。
一態様では、本発明の組成物及び方法は、サーモリシン変異体ポリペプチドを提供する。親酵素サーモリシンポリペプチドは（配列番号４）から単離された。成熟サーモリシンポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。同様に、実質的に同一のサーモリシンポリペプチドが、自然界、例えばゲオバチルス・カルドプロテオリティカスの他の株又は単離体に存在し得る。本発明の組成物及び方法には、これら及び他の組み換え型サーモリシンポリペプチドが含まれる。
一部の実施形態では、本発明は、サーモリシン活性を有する、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然起源のサーモリシン酵素変異体を包含するものであり、このポリペプチドは、本明細書で提供される親酵素サーモリシンと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド変異体は、例証されるサーモリシンポリペプチドと明記された程度のアミノ酸配列相同性、例えば配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の配列相同性を有する変異体である。相同性は、例えば本明細書において述べるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用したアミノ酸配列アラインメントにより決定することができる。
サーモリシン活性を有するサーモリシン変異体酵素をコードする単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然起源の配列も提供され、上記のサーモリシン酵素変異体（例えば、サーモリシン変異体）は、配列番号４のアミノ酸配列とは５０個以下、４０個以下、３０個以下、３５個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含む（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸位置は、サーモリシン酵素変異体のアミノ酸配列とゲオバチルス・カルドプロテオリティカスのサーモリシンアミノ酸配列とのアラインメントによって決定したときに配列番号３に示されるサーモリシンのアミノ酸配列における対応するアミノ酸の位置に割り振られた番号に従って番号付けされる）。
上記のように、本発明のサーモリシン酵素変異体ポリペプチドは、酵素活性（例えば、サーモリシン活性）を有し、例えば、限定するものではないが、食器類、食卓用食器類、布地、及び硬質表面を有する物品（例えば、テーブル、卓上、壁、家具、床、天井などの硬質表面）をクリーニングする方法などといった、クリーニング用途に有用である。本発明のサーモリシン酵素変異体ポリペプチドを１つ以上含むクリーニング組成物の例を以下に記載する。本発明のサーモリシン酵素変異体ポリペプチドの酵素活性（例えば、サーモリシン酵素活性）は、当業者に周知の手順を用いて、容易に決定することができる。以下に記載の実施例では、酵素活性、クリーニング性能、洗剤安定性及び／又は熱安定性の評価方法について説明する。染み（例えば、脂質による染み）の除去時、硬質表面のクリーニング時、又は洗濯物、食器類若しくは食卓用食器類のクリーニング時の本発明のサーモリシン酵素変異体の性能は、当業者に周知の手順を用いて、及び／又は以降の実施例に記載の手順を用いて、容易に決定され得る。
本発明のポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は保存的若しくは非保存的のいずれかの置換などといった様々な変化を受けることができ、このような変化としては、この変化によってポリペプチドの酵素活性が実質的に変更されないものが包含される。同様に、本発明の核酸は、様々な変化を受けることもでき、それらの変化には、例えば、特定のコドンが同一の又は異なるアミノ酸をコードするが、それによってサイレント変異（例えば、コードされるアミノ酸が核酸変異により変化しない場合では、ヌクレオチド配列中の変異によってアミノ酸配列中にサイレント変異が生じる）若しくは非サイレント変異が起こる１つ以上のコドンにおける１つ以上の核酸の１つ以上の置換、配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の欠失、配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の付加若しくは挿入、及び／又は配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の開裂若しくは切断、などが挙げられる。核酸配列における多くのこのような変化は、結果として得られたコードされたサーモリシン酵素変異体の酵素活性を、元の核酸配列によりコードされたサーモリシン酵素変異体の酵素活性と比較して実質的に変化させなくてもよい。同様に、本発明の核酸は、発現系（例えば、細菌の発現系）で最適な発現をもたらすが、必要に応じてなおも同じアミノ酸をコードするコドンを１つ以上包含するように改変され得る。
一部の実施形態では、本発明は、所望の酵素活性（例えば、サーモリシン酵素活性又はクリーニング性能活性）を有するサーモリシン酵素変異体ポリペプチドを含むポリペプチドの種類であって、本明細書に記載のアミノ酸置換を有する配列を含み、かつ保存的及び非保存的置換などのような１つ以上の更なるアミノ酸置換も含み、しかも所望の酵素活性（例えば、サーモリシン酵素変異体のクリーニング活性又はクリーニング性能に反映されるようなサーモリシン酵素活性又はタンパク質分解活性）を示し、維持し、又はおよそ維持するポリペプチドの種類を提供する。本発明に従うアミノ酸置換には、限定するものではないが、１つ以上の非保存的置換及び／又は１つ以上の保存的アミノ酸置換が包含され得る。保存的アミノ酸残基置換は、典型的には、アミノ酸残基の１機能分類に含まれるアミノ酸を、同一の機能分類に属する残基（同一のアミノ酸残基は、機能的に相同であるとみなされるか又は機能的相同性パーセントの算出において保存されている）と交換することを含む。保存的アミノ酸置換は、典型的には、アミノ酸配列中のアミノ酸を機能的に類似するアミノ酸により置換することを含む。例えば、アラニン、グリシン、セリン、及びトレオニンは機能的に類似するものであり、このため互いに保存的アミノ酸置換を提供し得る。アスパラギン酸及びグルタミン酸は、互いに保存的置換を提供し得る。アスパラギン及びグルタミンは、互いに保存的置換を提供し得る。アルギニン、リシン、及びヒスチジンは、互いに保存的置換を提供し得る。イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリンは、互いに保存的置換を提供し得る。フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンは、互いに保存的置換を提供し得る。
他の保存的アミノ酸置換基も想定され得る。例えば、アミノ酸は、類似の機能又は化学構造又は組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、イオウ含有）により分類することができる。例えば、脂肪族基は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）を含み得る。互いに保存的置換であるとみなされるアミノ酸を含有する他の基としては、例えば、芳香族基としてのフェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；イオウ含有基としてのメチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性基としてのアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性基としてのアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；非極性非荷電残基としてのシステイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、及びプロリン（Ｐ）；親水性非荷電残基としてのセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、及びグルタミン（Ｑ）が包含される。アミノ酸のその他の分類も当業者に周知であり、様々な一般的な文献に記載されている。上記の置換基と共に、本明細書においてポリペプチド配列を列挙することで、保存的に置換されたすべてのポリペプチド配列の明白な一覧を提供する。
上記のアミノ酸残基分類には、より保存的な置換が存在し、これらも同様に又は別法として好適であり得る。より保存的である保存的置換基としては：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
本発明のポリペプチド配列の保存的置換変異体（例えば、本発明のプロテアーゼ変異体）は、ポリペプチド配列中のアミノ酸のうち僅かな割合の、場合により２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、若しくは６％未満のアミノ酸、又はポリペプチド配列中のアミノ酸の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、若しくは１％未満、又は１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、又は１個未満のアミノ酸と、同じ保存的置換基の保存的に選択されたアミノ酸との置換を包含する。
本明細書内の他の箇所で更に詳細に記載されるように、及び本明細書で提供される実施例に記載されるように、本発明のポリペプチドは、既知のメタロプロテアーゼを包含する既知のプロテアーゼに匹敵し得るクリーニング能力を有し得る。
一部の実施形態では、プロテアーゼ変異体は、１つ以上の変異を含み、ゲオバチルス・カルドプロテオリティカスのサーモリシン（配列番号３）と比較して−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、又は５の総実効電荷を有する。
一部の実施形態では、上記のイオン強度の高いサーモリシンプロテアーゼ変異体は、典型的には、洗濯機内で、水で希釈されて伝導度が約３ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、又は更には約４ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの洗濯用洗浄液を形成する、洗剤組成物の一部を形成する。
サーモリシンプロテアーゼ変異体の電荷は、配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型のゲオバチルス・カルドプロテオリティカスのサーモリシンプロテアーゼと比較して表現されるものである。１つの負電荷を付与するアミノ酸はＤ及びＥであり、１つの正電荷を付与するアミノ酸はＲ、Ｈ及びＫである。配列番号２と比較して電荷を変化させる任意のアミノ酸の変化を用いて、サーモリシンプロテアーゼ変異体の電荷を計算する。例えば、野生型の、電荷が中性である位置に負電荷の変異を導入すると、−１の実効電荷がサーモリシンプロテアーゼ変異体に加えられる一方で、野生型の正電荷を持つアミノ酸残基（Ｒ、Ｈ、又はＫ）に負電荷の変異（Ｄ又はＥ）を導入すると、−２の実効電荷が加えられることになる。配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型のゲオバチルス・カルドプロテオリティカスのサーモリシンプロテアーゼと比較した場合に異なっている、プロテアーゼ変異体のすべてのアミノ酸残基の電荷の変化を合計することで、プロテアーゼ変異体の電荷変化が得られる。電荷を正しく選択することにより、予想外にレベルが改善したサーモリシンクリーニング性能を得ることができる。「伝導度の低い洗濯洗剤溶液」は、約０．１ｍＳ／ｃｍ〜約３ｍＳ／ｃｍ、約０．３ｍＳ／ｃｍ〜約２．５ｍＳ／ｃｍ、又は更には約０．５ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するものとして定義される。「伝導度の高い洗濯洗剤溶液」は、約３ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、又は更には約４ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するものとして定義される。上記の実施例は非限定的なものであることが意図される。サーモリシン性能をサーモリシンの性能を最適化させるために変異を組み合わせる場合、更なる位置に変異を導入することで、酵素の電荷平衡をとることもできる。
一部の実施形態では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然起源のプロテアーゼ変異体（例えば、サーモリシン変異体）を提供し、このプロテアーゼ変異体は、配列番号３に示されるアミノ酸配列とは５０個以下、４５個以下、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、又は８個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含む（ここで、アミノ酸位置は、プロテーゼ変異体のアミノ酸配列と、ゲオバチルス・カルドプロテオリティカスのサーモリシンのアミノ酸配列とのアラインメントによって決定したときに、配列番号３に示されるゲオバチルス・カルドプロテオリティカスサーモリシンのアミノ酸配列の対応するアミノ酸の位置に割り振られた番号に従って番号付けされる）。
一部の実施形態では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然起源のプロテアーゼ変異体（例えば、サーモリシン変異体）を提供し、このプロテアーゼ変異体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列とは５０個以下、４５個以下、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含む（ここで、アミノ酸位置は、プロテーゼ変異体のアミノ酸配列と、ゲオバチルス・カルドプロテオリティカスのサーモリシンのアミノ酸配列とのアラインメントによって決定したとき、配列番号３に示されるゲオバチルス・カルドプロテオリティカスサーモリシンのアミノ酸配列の対応するアミノ酸の位置に割り振られた番号に従って番号付けされる）。
本発明の核酸
本発明は、単離された、非天然起源の、又は組み換え型の核酸（本明細書では「ポリヌクレオチド」とも呼ばれる）を提供し、これは集合的に本発明のポリペプチドをコードする「本発明の核酸」又は「本発明のポリヌクレオチド」と呼ばれ得る。以下に記載のすべてのものを含む本発明の核酸は、典型的に、対象とするポリペプチドをコードする配列又はそれらの断片を含むプラスミド発現ベクターの発現を介した本発明のポリペプチドの組み換えによる産生（例えば発現）に有用である。上述のように、ポリペプチドには、酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を有するサーモリシン変異体ポリペプチドなどのプロテアーゼ変異体ポリペプチドであって、クリーニング用途、及びクリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、物品の表面）をクリーニングするためのクリーニング組成物に有用である、プロテアーゼ変異体ポリペプチドが包含される。
一部の実施形態では、本発明は、上記の表題「本発明のポリペプチド」と付けられた節及び本明細書の他の場所に記載される、任意のポリペプチド（任意の融合タンパク質などが包含される）をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然起源の核酸を提供する。本発明は、上記及び本明細書の他の箇所に記載の、本発明の任意のポリペプチドの２つ以上の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然起源の核酸も提供する。
一部の実施形態では、本発明は、サーモリシン活性を有する、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然起源のサーモリシン酵素変異体をコードするポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、本明細書で提供される親酵素サーモリシンと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、ポリペプチド変異体は、例示されるサーモリシンポリペプチドと明記された程度のアミノ酸配列相同性を有する変異体であり、例えば配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の配列相同性を有する変異体である。相同性は、例えば本明細書において述べるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用した、アミノ酸配列アラインメントにより決定することができる。
同様に、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然起源の核酸も提供するものであって、前記プロテアーゼ変異体（例えば、サーモリシン変異体）は、配列番号２のアミノ酸配列と５０個以下、４０個以下、３０個以下、３５個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含む（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸位置は、プロテーゼ変異体のアミノ酸配列と、ゲオバチルス・カルドプロテオリティカスのサーモリシンのアミノ酸配列とのアラインメントによって決定したときに配列番号３に示されるゲオバチルス・カルドプロテオリティカスサーモリシンのアミノ酸配列の対応するアミノ酸の位置に割り振られた番号に従って番号付けされる）。
本発明は、ゲオバチルス属又はバチルス属サーモリシンのサーモリシン変異体をコードする核酸を提供するものであり、このサーモリシン変異体は、タンパク質分解活性を有する成熟型であり、かつ本明細書全体を通じて列挙されているようなアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含む（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示されるゲオバチルス・カルドプロテオリティカスサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされる）。
本発明の核酸は、任意の好適な合成技術、操作技術、及び／又は単離技術、又はこれらの組み合わせを用いて作製できる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の固相合成法などの標準的な核酸合成技術を用いて製造することもできる。このような技術では、典型的には５０個まで又はそれ以上のヌクレオチド塩基の断片を合成して、次いで連結することで（例えば、酵素的若しくは化学的連結方法、又はポリメラーゼによる組み換え方法）、本質的に任意の所望の連続的な核酸配列が形成される。本発明の核酸の合成はまた、古典的なホスホロアミダイト法を用いる化学合成が挙げられるがこれに限定されない当該技術分野において既知の任意の好適な方法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９〜６９頁［１９８１年］を参照されたい）により、又は自動合成方法で典型的に実施されるＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌに記載の方法（Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１〜８０５頁［１９８４年］を参照されたい）により、促進（或いは達成）することができる。本発明の核酸は、自動ＤＮＡ合成装置を使用しても作製できる。カスタマイズされた核酸を、各種供給業者（例えば、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．及びＤＮＡ２．０）に発注することができる。他の核酸合成方法及び関連する原理も当業者には既知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３頁［１９８４年］、及びＩｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６頁［１９８４年］を参照されたい）。
上記のように、核酸の改変に有用な、ＤＮＡの組み換え技術は、当該技術分野において周知である。例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、逆転写、及びｃＤＮＡの生産、並びにポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）などの技法が知られており、当業者により容易に使用される。本発明のヌクレオチドは、本発明のプロテアーゼ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズすることのできる又は前記ポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅することのできるオリゴヌクレオチドプローブを１つ以上用い、ｃＤＮＡライブラリ（例えば、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で一般的に使用される変異導入技術を用いて生成されたｃＤＮＡライブラリ）をスクリーニングすることでも得ることができる。ｃＤＮＡクローンのスクリーニング及び単離手順、並びにＰＣＲによる増幅手順は当業者に周知のものであり、当業者に既知の標準的な参考文献に記載されている。本発明の核酸のいくつかは、天然起源のポリヌクレオチド主鎖（例えば、酵素又は親プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド主鎖）を、例えば既知の変異導入法（例えば、部位特異的変異導入法、部位飽和変異導入法、及びインビトロ組み換え）によって変化させることによって得ることができる。
本発明の改変プロテアーゼ変異体の製造方法
本発明のプロテアーゼ変異体をコードする本発明の改変ポリヌクレオチドを生成するのに好適な様々な方法が当該技術分野において既知であり、こうした方法としては、限定するものではないが、例えば、部位飽和変異導入法、スキャニング変異導入法、挿入変異法、欠失変異法、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、及び定向進化方法、並びに様々な他の組み換えアプローチが挙げられる。改変ポリヌクレオチド及びタンパク質（例えば、変異型プロテアーゼ）の製造方法としては、ＤＮＡシャフリング方法、遺伝子の非相同的組み換えに基づく方法、例えばＩＴＣＨＹ（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，７：２１３９〜４４頁［１９９９年］を参照されたい）、ＳＣＲＡＣＨＹ（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，９８：１１２４８〜５３頁［２００１年］を参照されたい）、ＳＨＩＰＲＥＣ（Ｓｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９：４５６〜６０頁［２００１年］を参照されたい）、及びＮＲＲ（Ｂｉｔｔｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０：１０２４〜９頁［２００１年］、Ｂｉｔｔｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１０１：７０１１〜６頁［２００４年］を参照されたい）、並びにランダム変異及び標的突然変異、欠失並びに／又は挿入を組み込むためにオリゴヌクレオチドを使用することに基づく方法（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０：１２５１〜５頁［２００２年］、Ｃｏｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０：１２４６〜５０頁［２００２年］、Ｚｈａ ｅｔ ａｌ．，４：３４〜９頁［２００３年］、Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１４９：３９０３〜１３頁［１９９２年］を参照されたい）が挙げられる。
本発明のプロテアーゼ変異体を製造するためのベクター、細胞、及び方法
本発明は、本明細書に記載の少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の本発明の変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド）を含む単離若しくは組み換え型のベクター、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離若しくは組み換え型の発現ベクター又は発現カセット、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離された、実質的に純粋な、又は組み換えＤＮＡ構築物、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチドを含む単離又は組み換え型細胞、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含む細胞培養物、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む細胞培養物、並びにこのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、ＤＮＡ構築物、細胞、細胞培養物、又はこれらの任意の組み合わせ若しくは混合物を１種以上含む組成物を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１種の核酸又はポリヌクレオチドを含む本発明のベクター（例えば、発現ベクター又はＤＮＡ構築物）を少なくとも１つ含む組み換え細胞を提供する。このような組み換え細胞の一部のものは、このような少なくとも１つのベクターにより形質転換又はトランスフェクトされる。このような細胞は、典型的には宿主細胞と呼ばれる。このような細胞の一部のものは、細菌細胞、例えば、限定するものではないが、枯草菌細胞などのバチルス種の細胞を含む。本発明は、本発明の少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含む組み換え細胞（例えば、組み換え宿主細胞）も提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする本発明のポリヌクレオチド配列が、効率的な遺伝子発現に必要とされる１つ又は追加の核酸セグメント（例えば、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする本発明のポリヌクレオチドに機能的に連結されるプロモーター）に機能的に連結される、発現ベクター又は発現カセットである。ベクターには、転写ターミネーター、及び／又は抗菌剤含有培地での増殖により、プラスミド感染宿主細胞の持続的な培養維持を可能にする、抗生物質耐性遺伝子などの選択遺伝子が包含され得る。
発現ベクターは、プラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導され得るか、又は代替的な実施形態では、これらの両方の要素を含有する。例示的なベクターとしては、限定するものではないが、ｐＸＸ、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３が挙げられる（Ｈａｒｗｏｏｄ及びＣｕｔｔｉｎｇ［ｅｄｓ．］，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ［１９９０年］（枯草菌に好適な複製プラスミドとしては９２頁に記載されているものが挙げられる）、そして更に、Ｐｅｒｅｇｏ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｉｎ Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，［ｅｄｓ．］Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．［１９９３年］６１５〜６２４頁も参照されたい）。
対象とするタンパク質（例えば、プロテアーゼ変異体）を細胞において発現及び生産する際、改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１コピー及び好ましくは複数コピー含む発現ベクターを少なくとも１つ用い、プロテアーゼの発現に好適な条件下で細胞を形質転換する。本発明の一部の実施形態では、プロテアーゼ変異体（並びにベクターに含まれる他の配列）をコードするポリヌクレオチド配列は宿主細胞のゲノムに組み込まれ、一方、他の実施形態では、プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターは自律性の染色体外因子として細胞内に留まる。本発明は、染色体外の核酸エレメント、並びに宿主細胞のゲノムに組み込まれる移入ヌクレオチド配列の両方を提供する。本明細書に記載のベクターは、本発明のプロテアーゼ変異体の生産に有用である。一部の実施形態では、プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド構築物は、プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを細菌染色体に組み込み、そして場合により増幅することのできる組み込みベクターに存在する。組み込み部位の例は、当業者に周知である。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドの転写は、選択された前駆体プロテアーゼのための野生型プロモーターであるプロモーターによりもたらされる。他の一部の実施形態では、プロモーターは、前駆体プロテアーゼとは異種であるものの、宿主細胞中で機能するものである。具体的には、細菌宿主細胞で使用するのに好適なプロモーターの例としては、限定するものではないが、例えば、ａｍｙＥ、ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、ｐｓｔＳ、ｓａｃＢ、ｐＳＰＡＣ、ｐＡｐｒＥ、ｐＶｅｇ、ｐＨｐａＩＩプロモーター；並びにバチルス・ステアロサーモフィルスのマルトース生成型アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・クラウシイのアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミルスのキシロシダーゼ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシスのｃｒｙＩＩＩＡ、及びバチルス・リケニフォルミスのα−アミラーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。追加のプロモーターとしては、限定するものではないが、Ａ４プロモーター、並びにファージλ ＰＲ又はＰＬプロモーター、及び大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが挙げられる。
本発明のプロテアーゼ変異体は、細菌及び真菌を包含する任意の好適なグラム陽性微生物の宿主細胞で生産され得る。例えば、一部の実施形態では、プロテアーゼ変異体は真菌及び／又は細菌由来の宿主細胞で生産される。一部の実施形態では、宿主細胞は、バチルス種、ストレプトマイセス種（Streptomyces sp.）、エシェリキア種（Escherichia sp.）、又はアスペルギルス種（Aspergillus sp.）である。一部の実施形態では、プロテアーゼ変異体は、バチルス種の宿主細胞により生産される。本発明のプロテアーゼ変異体の生産において有用であるバチルス種の宿主細胞の例としては、限定するものではないが、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レンタス、枯草菌、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・レンタス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアギュランス、バチルス・サークランス、バチルス・プミルス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・クラウシイ、及びバチルス・メガテリウム、並びにバチルス（Bacillus）属に属する他の生物が挙げられる。一部の実施形態では、枯草菌宿主細胞は、プロテアーゼ変異体の生産に使用される。米国特許第５，２６４，３６６号及び同第４，７６０，０２５号（再発行特許第３４，６０６号）は、本発明のプロテアーゼ変異体の生産に使用することができる様々なバチルス属の宿主株を記述しているが、他の好適な株も使用することができる。
本発明のプロテアーゼ変異体の生産に使用することができるいくつかの工業用の細菌種としては、非組み換え型（すなわち、野生型）のバチルス種株、並びに天然起源の株の変異体及び／又は組み換え株が挙げられる。一部の実施形態では、宿主株は組み換え株であり、宿主には、対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている。一部の実施形態では、宿主株は枯草菌宿主株であり、特に組み換え型枯草菌宿主株である。数多くの枯草菌株が既知であり、限定するものではないが、例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ ３９，０８７）、ＡＴＣＣ ２１３３２、ＡＴＣＣ ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ １１０、及びＰＥＰ ２１１株が挙げられる（例えば、Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７３：２１５〜２２８頁［１９７３年］、また同様に、米国特許第４，４５０，２３５号及び同第４，３０２，５４４号、並びに欧州特許第０１３４０４８号を参照されたい。これら各公報は参照によりその全文が組み込まれる）。発現宿主細胞としての枯草菌の使用は当業者に周知である（例えば、Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９：８１〜８７頁［１９８２年］；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６〜８０４頁［１９８６年］；並びにＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６９：３９〜４７頁［１９８８年］を参照されたい）。
一部の実施形態では、バチルス属の宿主細胞は、次の遺伝子：ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ及びｄｅｇＱのうちの少なくとも１つの遺伝子において変異又は欠失を含むバチルス種の宿主細胞である。好ましくは変異はｄｅｇＵ遺伝子において生じ、より好ましくは変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である（例えば、Ｍｓａｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：８２４〜８３４頁［１９９０年］、及びＯｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５３：５６２〜５６７頁［１９９７年］を参照されたい）。変異ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）を有する枯草菌は、１つの好適な宿主株である。一部の実施形態では、バチルス属の宿主は、ｓｃｏＣ４（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：７３２９〜７３４０頁［２００１年］を参照されたい）、ｓｐｏＩＩＥ（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：１４０７〜１４１５頁［１９９９年］を参照されたい）、及び／又はｏｐｐＡ若しくはｏｐｐオペロンの他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１７３〜１８５頁［１９９１年］を参照されたい）に変異又は欠失を含む。実際に、ｏｐｐＡの遺伝子の変異と同じ表現型を生じるｏｐｐオペロンにおけるいかなる変異も、本発明の変化したバチルス株に関する一部の実施形態において有用であろうと想到される。一部の実施形態では、これらの変異は単独で生じるが、他の実施形態では複数の変異が組み合わさって存在する。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体の生産に使用することができる変化したバチルス属の宿主細胞株は、上記の遺伝子のうちの１つ以上に予め変異を包含しているバチルス属の宿主株である。加えて、内因性のプロテアーゼ遺伝子に関する変異及び／又は欠失を含むバチルス種の宿主細胞も有用である。一部の実施形態では、バチルス属の宿主細胞は、ａｐｒＥ遺伝子及びｎｐｒＥ遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、バチルス種の宿主細胞がプロテアーゼ遺伝子を５つ欠失している一方で、他の実施形態では、バチルス種の宿主細胞はプロテアーゼ遺伝子を９つ欠失している（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０２５３５号を参照し、この公報は参照として本明細書に組み込まれる）。
宿主細胞は、当該技術分野において既知の任意の好適な手段を用いて、本発明の少なくとも１種のプロテアーゼ変異体をコードする少なくとも１つの核酸により形質転換される。核酸がベクターに組み込まれるか、又はプラスミドＤＮＡの非存在下で用いられるかによらず、核酸は、典型的には微生物に導入され、一部の実施形態では、好ましくは大腸菌細胞又はコンピテントバチルス細胞に導入される。プラスミドＤＮＡ構築物又はベクターを利用して、核酸（例えば、ＤＮＡ）をバチルス属の細胞又は大腸菌細胞に導入する方法、及びこのようなプラスミドＤＮＡ構築物又はベクターによりそのような細胞を形質転換する方法は周知である。一部の実施形態では、プラスミドは、次に大腸菌細胞から単離され、バチルス属の細胞を形質転換する。しかしながら、大腸菌などの介在微生物を用いることは必須ではなく、一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物又はベクターは直接バチルス属の宿主に導入される。
本発明の核酸又はポリヌクレオチド配列をバチルス属の細胞に導入する好適な方法は当業者には周知である（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ Ｈａｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．［ｅｄｓ．］，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、５７〜７２頁［１９８９年］、Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：７１８〜７２６頁［１９８４年］、Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：１９２５〜１９３７頁［１９６７年］、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１〜１３５頁［１９８６年］、Ｈｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７頁［１９８５年］、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１〜１１５頁［１９７９年］、Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：２６１〜２６３頁［１９８０年］、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４頁［１９８６年］、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３〜２１７頁［１９８１年］、並びにＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３頁［１９８４年］を参照されたい）。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合（congression）を包含する形質転換、形質導入、及びプロトプラスト融合などの方法は周知であり、本発明でも好適に使用される。本発明のプロテアーゼ変異体をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物又はベクターを宿主細胞に導入するために、形質転換法が使用される。当該技術分野において既知のバチルス属細胞の形質転換方法としては、部分的に相同な常在性プラスミドを保持するコンピテント細胞によるドナープラスミドの取り込みを伴う、プラスミドマーカー救出形質転換などの方法が挙げられる（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ２：５５５〜５７１頁［１９７９年］、Ｈａｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５〜１９１頁［１９９０年］、Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１０７７〜１０８７頁［１９８３年］、及びＷｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：１２０５〜１２１１頁［１９８７年］を参照されたい）。この方法では、組み込まれるドナープラスミドは、染色体の形質転換を模倣するプロセスにおいて、常在性の「ヘルパー」プラスミドの相同領域と組み換えられる。
一般的に使用される方法に加えて、一部の実施形態では、宿主細胞は、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物又はベクターにより直接的に形質転換される（すなわち、宿主細胞への導入前に、ＤＮＡ構築物又はベクターを増幅またはそうでなければ処理するために、中間細胞は用いられない）。本発明のＤＮＡ構築物又はベクターの宿主細胞への導入法には、核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を、プラスミド又はベクターに挿入することなく、宿主細胞に導入するための、当該技術分野において既知の物理的及び化学的方法が包含される。このような方法としては、限定するものではないが、塩化カルシウム沈殿、電気穿孔、裸のＤＮＡ、及びリポソームなどが挙げられる。更なる実施形態では、ＤＮＡ構築物又はベクターは、プラスミドに挿入されることなく、プラスミドと共に同時形質転換される。更なる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野において既知の方法により、変化したバチルス属の株から欠失される（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１〜４１８頁［１９８４年］；及びＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２４７：２５５〜２６４頁［２０００年］参照）。
一部の実施形態では、本発明の形質転換細胞は、一般的な栄養培地で培養される。温度及びｐＨなどの好適な具体的な培養条件は当業者に既知であり、科学文献に詳しく記載されている。一部の実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１種のプロテアーゼ変異体又は本発明の少なくとも１種の核酸を含む培養物（例えば、細胞培養物）を提供する。同様に、本発明の核酸、ベクター、又はＤＮＡ構築物を少なくとも１つ含む組成物も提供する。
一部の実施形態では、本発明の少なくとも１種のプロテアーゼ変異体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列によって形質転換された宿主細胞を、本発明のプロテアーゼの発現を可能にする条件下で、好適な栄養培地で培養した後、得られたプロテアーゼを培養物から回収する。細胞培養に使用する培地には、宿主細胞を増殖させるのに好適な、適切な添加剤を含有している最少培地又は複合培地などといった任意の一般的な培地を含む。好適な培地は、販売元から入手することができ、又は公開されている処方に従って調製することもできる（例えば、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログを参照されたい）。一部の実施形態では、細胞により生産されたプロテアーゼは、限定するものではないが、例えば、遠心沈降又は濾過による培養液からの宿主細胞の分離、塩（例えば、硫酸アンモニウム）による上清又は濾液中のタンパク質様成分の沈殿、クロマトグラフィー精製（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティなど）などの従来法により培地から回収される。プロテアーゼ変異体を回収又は精製するための任意の好適な方法が、本発明において有用である。
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞により生産されたプロテアーゼ変異体は、培養培地に分泌される。精製を促進するドメインをコードする核酸配列を使用して、可溶性タンパク質の精製を容易にすることもできる。プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター又はＤＮＡ構築物は、プロテアーゼ変異体の精製を促進する精製促進ドメインをコードする核酸配列を更に含みうる（例えば、Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４４１〜４５３頁［１９９３年］を参照されたい）。このような精製促進ドメインとしては、限定されないが、例えば、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド（Ｐｏｒａｔｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３〜２８１頁［１９９２年］を参照されたい）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ拡張／アフィニティ精製システムにおいて利用されるドメイン（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から入手可能なプロテインＡドメイン）が挙げられる。精製ドメインと非相同的なタンパク質との間に、凝固因子ＸＡ又はエンテロキナーゼなどの開裂可能なリンカー配列（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能な配列）を含めることも、精製を促進するために有用である。
本発明のプロテアーゼ変異体などの酵素の酵素活性を検出及び測定するためのアッセイは周知である。プロテアーゼ（例えば、本発明の変異型プロテアーゼ）の活性を検出及び測定するための様々なアッセイも当業者には既知である。特に、当業者に周知であるように、２８０ｎｍでの吸光度として又はフォーリン法を用いる比色法により測定した、カゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイを、プロテアーゼの活性を測定するのに利用できる。他の例示的なアッセイは、発色性基質の可溶化を伴う（例えば、Ｗａｒｄ，「Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，」ｉｎ Ｆｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，［１９８３年］，２５１〜３１７頁を参照されたい）。他の例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドアッセイ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当業者に既知の多数の更なる参考文献にも、好適な方法が提示されている（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：７９１１〜７９２５頁［１９８３年］、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：１１９〜１２９頁［１９９４年］、及びＨｓｉａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：２２１〜２２７頁［１９９９年］を参照されたい）。
宿主細胞での成熟プロテアーゼ（例えば、本発明の成熟型のプロテアーゼ変異体）の生産レベルを決定するために、様々な方法を使用することができる。このような方法としては、限定するものではないが、例えば、プロテアーゼに特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを利用する方法が挙げられる。例示的な方法としては、限定するものではないが、例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらのアッセイ及びその他のアッセイは当該技術分野において周知のものである（例えば、Ｍａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１頁［１９８３年］を参照されたい）。
他の一部の実施形態では、本発明は、本発明の成熟型のプロテアーゼ変異体を製造又は生産する方法を提供する。成熟型プロテアーゼ変異体は、シグナルペプチド配列又はプロペプチド配列を含有しない。この方法の一部のものは、例えば、バチルス種細胞（例えば、枯草菌細胞）などの、組み換え型細菌宿主細胞において、本発明のプロテアーゼ変異体を製造又は生産する工程を含む。一部の実施形態では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体の生産方法を提供し、この方法は、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする核酸を含む組み換え発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を、プロテアーゼ変異体の生産を誘導する条件下で培養する工程を含む。このような方法の一部のものは、更に、培養物からプロテアーゼ変異体を回収する工程を含む。
一部の実施形態では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体の生産方法を提供し、方法は：（ａ）本発明のプロテアーゼ変異体をコードする核酸を含む組み換え発現ベクターを細胞集団（例えば、枯草菌細胞などの細菌細胞）に導入する工程；及び（ｂ）発現ベクターによりコードされるプロテアーゼ変異体の生産を誘導する条件下で、培養培地中で細胞を培養する工程、を含む。このような方法のうち一部のものは、（ｃ）細胞又は培養培地からプロテアーゼ変異体を単離する工程を更に含む。
布地ケア及びホームケア製品
一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体は、補助材料及びプロテアーゼ変異体を含む組成物で使用することができ、ここで、組成物は布地ケア製品及びホームケア製品である。
一部の実施形態では、少なくとも１種のサーモリシン変異体を含む布地ケア製品組成物及びホームケア製品組成物には、次の成分のうち１種以上（組成物の総重量に対して）、すなわち、約０．０００５重量％〜約０．１重量％、約０．００１重量％〜約０．０５重量％、又は更に約０．００２重量％〜約０．０３重量％の前記サーモリシンプロテアーゼ変異体、並びに約０．００００３重量％〜約０．１重量％の布地色調剤、約０．００１重量％〜約５重量％の芳香カプセル、約０．００１重量％〜約１重量％の冷水可溶性増白剤、約０．００００３重量％〜約０．１重量％の漂白触媒、約０．００００３重量％〜約０．１重量％の第１リパーゼ洗液、約０．００００３重量％〜約０．１重量％の細菌洗浄用セルラーゼ、及び／又は約０．０５重量％〜約２０重量％のゲルべ非イオン性界面活性剤のうち１種以上が含まれる。
一部の実施形態では、布地ケア製品組成物及びホームケア製品組成物は液体洗濯洗剤、食器用洗剤である。
布地ケア製品及びホームケア製品は、流体又は固体を包含する任意の好適な形態で提供されることが意図される。布地ケア製品及びホームケア製品は、特に、液体形態の場合には１回用量パウチの形態であってよく、典型的には、布地ケア製品及びホームケア製品は、少なくとも一部が又は更には完全に水溶性パウチ中に封入される。加えて、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含む布地ケア製品及びホームケア製品に関する一部の実施形態では、布地ケア製品及びホームケア製品は上記のパラメータ及び／又は特徴の任意の組み合わせを有し得る。
クリーニング組成物
特に断りのない限り、本明細書に提供される成分又は組成物のレベルはすべて、成分又は組成物の活性レベルに関するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は除外される。酵素成分の重量は活性タンパク質の合計に基づくものである。百分率（％）及び比率はすべて、別途記載のない限り、重量で計算している。百分率（％）及び比率はすべて、別途記載のない限り、全組成物を基準として計算している。例示された洗剤組成物において、酵素レベルは、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ特に断りのない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表記される。
本明細書で示されるように、一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、更に、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ剥離ポリマー、移染剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、充填塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光剤、布地コンディショナー、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、収縮防止剤、防皺剤、殺菌剤、防カビ剤、色スペックル、銀製品ケア剤、変色防止剤及び／又は防食剤、アルカリ度供給源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、色素、及びｐＨ調整剤などの補助材料を含む（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号及び同第５，６４６，１０１号を参照し、これら公報はいずれも参照により組み込まれる）。特定のクリーニング組成物材料の具体例をは以下に詳細に例示する。クリーニング助剤が、クリーニング組成物中で本発明の変異型プロテアーゼ変異体と適合しない実施形態では、２つの成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤及びプロテアーゼを分離した（すなわち、互いに接触させない）ままにしておくという好ましい手段が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離など）。
本発明のクリーニング組成物は、例えば、洗濯用途、硬質表面クリーニング用途、食器洗浄用途、並びに義歯、歯、毛髪、及び皮膚などの美容的化粧用途に好都合に使用採用される。加えて、低温の溶液中で有効性作用が増大するという独特の利点によりを有することから、本発明の酵素は洗濯用途に理想的なものである。更に本発明の酵素は、粒状及び液体組成物において有用であるでの使用が見出される。
本発明の変異型プロテアーゼ変異体は、クリーニング添加剤においても有用であるも使用される。一部の実施形態では、低温溶液を用いるクリーニング応用において有用である用途での使用が見出される。一部の実施形態では、本発明は、本発明の酵素を少なくとも１種含むクリーニング添加剤を提供し、当該クリーニング添加剤は、更に漂白効果が所望される場合に、洗浄プロセスに含めるために理想的に適している過程で包含させるのに理想的なものである。このような場合の例としては、限定するものではないが、例えば、低温溶液を用いるクリーニング応用が挙げられる。一部の実施形態では、添加剤は最も単純な形態の１種以上のプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、添加剤は、洗浄プロセスに添加される剤形にパッケージングされる。一部の実施形態では、添加剤は、過酸化物供給源が用いられかつ漂白効果の増加が所望されるクリーニングプロセスに添加される剤形にパッケージングされる。限定するものではないが、例えば、丸剤、錠剤、ゲルキャップ、又は予め計量された粉末若しくは液体などの他の一回用量単位が挙げられる、任意の好適な一回用量単位が、本発明において有用である。一部の実施形態では、このような組成物を増量するために充填剤又はキャリア材料を含める。好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、様々な硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩並びにタルク、及びクレイなどが挙げられる。液体組成物に好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、水、又はポリオール及びジオールなどの低分子量の一級及び二級アルコールが挙げられる。このようなアルコールの例としては、限定するものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、このような材料を約５％〜約９０％含有する。酸性充填剤はｐＨを低下させるために有用である。あるいは、一部の実施形態では、クリーニング添加剤として、以下により詳細に記載されるような補助成分が挙げられる。
本発明のクリーニング組成物及びクリーニング添加剤は、本明細書で提供される少なくとも１種のプロテアーゼ変異体の有効量を単独で、あるいは他のプロテアーゼ及び／又は追加の酵素と組み合わせて必要とする。必要とされる酵素レベルは、本発明のプロテアーゼ変異体を１種以上加えることにより達成される。典型的には、本発明のクリーニング組成物は、少なくとも約０．０００１重量％、約０．０００１〜約１０重量％、約０．００１〜約１重量％、又は更には約０．０１〜約０．１重量％の、少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を含む。
本明細書のクリーニング組成物は、典型的には、水性クリーニング操作で使用した場合に、洗浄水のｐＨが約５．０〜約１１．５又は更には約７．５〜約１０．５となるように配合される。液体製剤は、典型的には、約３．０〜約９．０又は更には約３〜約５の原液のｐＨを有するよう配合される。粒状洗濯製品は、典型的にはｐＨが約９〜約１１になるよう配合される。推奨される使用レベルでｐＨを調節する技術としては、緩衝剤、アルカリ、酸などの使用が挙げられ、これらは当業者には周知のものである。
好適な「低ｐＨのクリーニング組成物」は、典型的には、原液のｐＨが約３〜約５のものであり、典型的には、このようなｐＨ環境で加水分解される界面活性剤を含まない。このような界面活性剤としては、エチレンオキシド部分を少なくとも１つ又は更にはエチレンオキシド約１〜約１６モルを含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤が挙げられる。このようなクリーニング組成物は、典型的には、原液のｐＨが約３〜約５であるクリーニング組成物を提供するのに十分な量のｐＨ調整剤、例えば、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸などを含む。このような組成物は、典型的には、酸に安定な酵素を少なくとも１種含む。一部の実施形態では、組成物は液体であるが、他の実施形態では、組成物は固体である。このような液体組成物のｐＨは、典型的には原液のｐＨとして測定される。このような固形組成物のｐＨは、上記組成物の１０％固体溶液として測定され、ここで、その溶媒は蒸留水である。これらの実施形態では、別途記載のない限り、ｐＨの測定はすべて２０℃で行われる。
一部の実施形態では、プロテアーゼ変異体が粒状組成物又は液体組成物に使用される場合、保存時にプロテアーゼ変異体を粒状組成物の他の成分から保護するために、変異型プロテアーゼはカプセル封入粒子の形態であることが望ましい。加えて、カプセル封入は、クリーニングプロセスでプロテアーゼ変異体の利用能を制御する手段でもある。一部の実施形態では、カプセル封入は、プロテアーゼ変異体及び／又は追加の酵素の性能を向上させる。この観点から、本発明のプロテアーゼ変異体は、当該技術分野において既知の任意の好適な封入剤によりカプセル封入される。一部の実施形態では、封入剤は、典型的には、本発明のプロテアーゼ変異体に関する触媒の少なくとも一部を封入する。典型的には、封入剤は、水溶性及び／又は水分散性である。一部の実施形態では、封入剤のガラス転移温度（Ｔｇ）は０℃以上である。ガラス転移温度は、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ９７／１１１５１号により詳細に記載されている。封入剤は、典型的には、炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。封入剤が炭水化物である場合、典型的には、単糖、オリゴ糖、多糖、及びこれらの組み合わせから選択される。一部の典型的な実施形態では、封入剤はデンプンである（例えば、欧州特許第０ ９２２ ４９９号；米国特許第４，９７７，２５２号、同第５，３５４，５５９号、及び同第５，９３５，８２６号を参照されたい）。一部の実施形態では、封入剤は、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル及びこれらの混合物などのプラスチックから製造されるマイクロスフェアであり、有用な市販のマイクロスフェアとしては、限定するものではないが、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）、並びにＰＭ ６５４５、ＰＭ ６５５０、ＰＭ ７２２０、ＰＭ ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ Ｃｏｒｐ．，Ｖａｌｌｅｙ Ｆｏｒｇｅ，ＰＡ）として供給されるものが挙げられる。
本明細書に記載のように、本発明のプロテアーゼ変異体は、限定するものではないが、洗濯用洗剤及び食器用洗剤などのクリーニング産業において特に有用である。これらの用途では、酵素を様々な環境ストレス下に置く。本発明のプロテアーゼ変異体は、様々な条件下で安定であることから、現在使用されている多数の酵素よりも有利である。
実際に、多様な洗剤の配合、多様な洗浄水の容量、多様な洗浄水の温度、及び多様な洗浄時間の長さを含む各種洗浄条件が存在し、洗浄に関与するプロテアーゼはこれらの条件に晒される。加えて、異なる地域で使用される洗剤配合物では、洗浄水中に、関連する成分が異なる濃度で存在する。例えば、欧州の洗剤は一般的には４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水中に有するが、日本の洗剤は一般的には６６７ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水に有する。北アメリカ、特に合衆国では、一般的には約９７５ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水中に有する。
低濃度洗剤系には、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤が包含される。日本の洗剤は、洗浄水中におよそ６６７ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に低濃度洗剤系とみなされる。
中間濃度の洗剤には、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤が包含される。北アメリカの洗剤は、洗浄水中におよそ９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に中間濃度の洗剤系であるとみなされる。ブラジルでは、典型的に洗浄水中におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。
高濃度洗剤系には、約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分が洗浄水中に存在している洗剤が包含される。欧州の洗剤は、洗浄水中におよそ４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に高濃度洗剤系であるとみなされる。
ラテンアメリカの洗剤は、概して高起泡性のリン酸塩ビルダー洗剤であり、洗浄水中に１５００〜６０００ｐｐｍの範囲の洗剤成分が存在していることから、ラテンアメリカで使用されている洗剤の範囲は、中間濃度及び高濃度洗剤の両方に包含される。上記のように、ブラジルでは、洗浄水中に典型的におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。しかしながら、例えば、他のラテンアメリカの国々に限定されないが、高起泡性のリン酸ビルダー洗剤が使用されている他の地域では、洗浄水中に、洗剤成分が最大で約６０００ｐｐｍ存在している高濃度洗剤系が使用されている場合がある。
前述の内容を考慮すると、世界中の典型的な洗浄液中の洗剤組成物の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「低濃度洗剤地域」）、例えば、日本の約６６７ｐｐｍのものから、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤組成物（「中間濃度の洗剤地域」）、例えば、米国の約９７５ｐｐｍ及びブラジルの約１５００ｐｐｍのもの、そして約２０００ｐｐｍ超の洗剤組成物（「高濃度洗剤地域」）、例えば、欧州の約４５００ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍのもの、及び高起泡性リン酸ビルダーの地域では約６０００ｐｐｍのものまでさまざまであることが明白である。
典型的な洗浄液の濃度は経験的に決定される。例えば、米国では、典型的な洗濯機の洗浄液容量は約６４．４Ｌである。したがって、洗浄溶液中に約９７５ｐｐｍの洗剤濃度得るためには、６４．４Ｌの洗浄液に約６２．７９ｇの洗剤組成物を添加しなくてはならない。この量は、消費者が、洗剤に付属された計量カップを用いて洗浄水に量り入れる典型的な量である。
更なる例として、異なる地域では異なる洗浄温度が使用される。日本で使用されている洗浄水の温度は、一般的に、欧州で使用される温度よりも低い。例えば、北アメリカ及び日本の洗浄水の温度は、典型的には約１０〜約３０℃（例えば、約２０℃）であるが、欧州の洗浄水の温度は、典型的には約３０〜約６０℃（例えば、約４０℃）である。しかしながら、エネルギーの節約の観点から、多くの消費者は冷水洗浄の使用に切り替えている。加えて、一部の更なる地域では、典型的に洗濯だけでなく食器洗浄用途にも冷水が使用されている。一部の実施形態では、本発明の「冷水洗浄」では、約１０℃〜約４０℃、又は約２０℃〜約３０℃、又は約１５℃〜約２５℃、並びに約１５℃〜約３５℃の範囲内のすべてのその他の組み合わせ、並びに１０℃〜４０℃のすべての範囲の洗浄温度に好適な「冷水用洗剤」を用いる。
更なる例として、異なる地域では、典型的にに、異なる硬度の水が用いられている。水の硬度は、通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋合計のグレイン／ガロン単位で記述される。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の尺度である。米国ではほとんどの水は硬水であるが、硬度の程度は様々である。中硬水（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬水（１２１〜１８１ｐｐｍ）は、６０〜１８１ｐｐｍ（ｐｐｍをグレイン／ＵＳガロン単位に変換する場合、ｐｐｍ数を１７．１で除したものがグレイン／ガロンに相当する）の鉱物を含有する。
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欧州の水硬度は、一般的には約０．１８０（１０．５）（例えば、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の合計が約０．１８０〜約０．３４（１０．５〜約２０．０））グラム／リットル（括弧内はグレイン／ガロン単位）を上回る（例えば、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の合計が約０．２６グラム／リットル（１５グレイン／ガロン））。北アメリカの水硬度は、一般的には日本の水硬度よりも高いものの、欧州の水硬度より低い。例えば、北アメリカの水硬度は、約０．２〜約０．７グラム（grams）（３〜約１０グレイン（grains））、約０．２〜約０．５グラム（grams）又は約０．４グラム（３〜約８グレイン又は約６グレイン（grains））であり得る。日本の水硬度は、一般的には北アメリカの水硬度よりも低く、通常Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の合計が約０．０７（４）未満、例えば約０．０５グラム／リットル（３グレイン／ガロン）である。
したがって、一部の実施形態では、本発明は少なくとも１組の洗浄条件（例えば、水温、水の硬度、及び／又は洗剤濃度）において驚くべき洗浄性能を示すプロテアーゼ変異体を提供する。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体の洗浄性能は、他のサーモリシンプロテアーゼの洗浄性能と同程度である。したがって、本発明の一部の実施形態では、本明細書に提供されるプロテアーゼ変異体は、強化された酸化安定性、強化された熱安定性、様々な条件下での強化されたクリーニング性能、及び／又は強化されたキレート剤中の安定性を示す。加えて、本発明のプロテアーゼ変異体は、単独でも又はビルダー及び安定化剤との組み合わせとしても、洗剤を含まないクリーニング組成物において有用である。
本発明の一部の実施形態では、クリーニング組成物は、組成物の重量に基づき、少なくとも約０．００００１重量％〜約１０重量％のレベルの少なくとも１種の本発明の変異型プロテアーゼと、クリーニング助剤を含む残部（例えば、組成物の約９９．９９９重量％〜約９０．０重量％）と、を含む。本発明の他の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％のレベルの少なくとも１種の変異型プロテアーゼと、クリーニング助剤を含むクリーニング組成物の残部（例えば、約９９．９９９９重量％〜約９０．０重量％、約９９．９９９重量％〜約９８重量％、約９９．９９５重量％〜約９９．５重量％）と、を含む。
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、クリーニング性能及び／又は布地ケア及び／又は食器洗浄効果を提供する追加の洗剤用酵素を１種以上含む。好適な酵素の例としては、限定するものではないが、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、或いはこれらの任意の組み合わせ又はこれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び／又はセルラーゼなどの一般的に適用可能な酵素をアミラーゼと共に含む酵素混合物（すなわち、「カクテル」）が使用される。
本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体に加えて、任意の他の好適なプロテアーゼが本発明の組成物において有用である。適当なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。一部の実施形態では、微生物由来のプロテアーゼが使用される。一部の実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。一部の実施形態では、プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ性の微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。アルカリ性プロテアーゼの例としては、サブチリシン、特にバチルス属由来のサブチリシンが挙げられる（例えば、サブチリシン、レンタス、アミロリケファシエンス、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８）。更なる例としては、米国再発行特許第３４，６０６号、米国特許第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８号に記載されているプロテアーゼ変異体が挙げられる（これら公報はいずれも参照により本明細書に組み込まれる）。追加のプロテアーゼ例としては、例えば、限定するものではないが、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来）、及びＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ８９／０６２７０号に記載のフサリウムプロテアーゼが挙げられる。一部の実施形態では、本発明に使用できる市販のプロテアーゼ酵素としては、限定するものではないが、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰ（商標）及びＢＬＡＰ（商標）変異体（Ｈｅｎｋｅｌ Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ａｕｆ Ａｋｔｉｅｎ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、並びにＫＡＰ（バチルス・アルカロフィルスサブチリシン；花王株式会社、日本国東京）が挙げられる。ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ９５／２３２２１号、同第ＷＯ ９２／２１７６０号、米国特許出願公報第２００８／００９０７４７、及び米国特許第５，８０１，０３９号、同第５，３４０，７３５号、同第５，５００，３６４号、同第５，８５５，６２５号、米国債発行特許第３４，６０６号、米国特許第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８、並びに様々な他の特許にも様々なプロテアーゼが記載されている。一部の更なる実施形態では、本発明において有用であるメタロプロテアーゼとしては、限定するものではないが、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ０７／０４４９９３号に記載の中性のメタロプロテアーゼが挙げられる。
加えて、任意の好適なリパーゼが本発明において有用である。好適なリパーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体は本発明に包含される。有用なリパーゼの例としては、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）のリパーゼ（例えば、欧州特許第２５８ ０６８号及び同第３０５ ２１６号参照）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼ（例えば、欧州特許第２３８ ０２３号参照）、カンジダ属のリパーゼ、例えば、カンジダ・アンタルクチカ（C. antarctica）のリパーゼ（例えば、カンジダ・アンタルクチカ（C. antarctica）のリパーゼＡ又はＢ；例えば、欧州特許第２１４ ７６１号参照）、シュードモナス属のリパーゼ、例えば、シュードモナス・アルカリゲネスのリパーゼ及びシュードモナス・シュードアルカリゲネスのリパーゼ（例えば、欧州特許第２１８ ２７２号参照）、シュードモナス・セパシアのリパーゼ（例えば、欧州特許第３３１ ３７６号参照）、シュードモナス・スタッツェリ（P. stutzeri）のリパーゼ（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号参照）、シュードモナス・フルオレッセンスのリパーゼ、バチルス属のリパーゼ（例えば、枯草菌のリパーゼ［Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３〜２６０頁［１９９３年］）、バチルス・ステアロサーモフィルスのリパーゼ（例えば、特願昭６４／７４４９９２号参照）、並びにバチルス・プミルスのリパーゼ（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ９１／１６４２２参照）が挙げられる。
さらに、クローニングされた多数のリパーゼが、本発明の一部の実施形態において有用であり、限定するものではないが、ペニシリウム・カマンベルティ（Penicillium camembertii）のリパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０３：６１〜６７頁［１９９１年］参照）、ゲオトリクム・カンジズム（Geotricum candidum）のリパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３〜３８８頁［１９８９年］参照）、及び様々なクモノスカビ属のリパーゼ、例えばリゾプス・デレマ（R. delemar）のリパーゼ（Ｈａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０９：１１７〜１１３頁［１９９１年］参照）、リゾプス・ニベウス（R. niveus）のリパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６〜７１９頁［１９９２年］）及びリゾプス・オリーゼ（R. oryzae）のリパーゼが挙げられる。
クチナーゼなどの他の種類のサーモリシンも本発明の一部の実施形態において有用であり、限定するものではないが、例えば、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）由来のクチナーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ８８／０９３６７号参照）、及びフザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）由来のクチナーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ９０／０９４４６号参照）が挙げられる。
その他の好適なリパーゼとしては、Ｍ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；及びＬＩＰＡＳＥ Ｐ（商標）「アマノ」（天野エンザイム，日本）などの市販のリパーゼが挙げられる。
本発明の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のリパーゼのレベルのリパーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にリパーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％リパーゼのレベルで含む。
本発明の一部の実施形態では、任意の好適なアミラーゼが、本発明において有用である。一部の実施形態では、アルカリ性溶液に使用するのに好適である任意のアミラーゼ（例えば、α及び／又はβ）も有用である。好適なアミラーゼとしては、限定するものではないが、細菌由来のもの又は真菌由来のものが挙げられる。一部の実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。本発明において有用なアミラーゼとしては、限定するものではないが、バチルス・リケニフォルミスから得られるα−アミラーゼが挙げられる（例えば、英国特許第１，２９６，８３９号を参照されたい）。本発明において有用な市販のアミラーゼとしては、限定するものではないが、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、並びにＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）及びＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が挙げられる。
本発明の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のアミラーゼのレベルのアミラーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。同様に、本発明の一部の他の実施例では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にアミラーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％アミラーゼのレベルで含む。
一部の更なる実施形態では、任意の好適なセルラーゼが、本発明のクリーニング組成物において有用である。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。一部の実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）のセルラーゼが挙げられる（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号を参照されたい）。特に好適なセルラーゼは、色ケア効果を有するセルラーゼである（例えば、欧州特許第０ ４９５ ２５７号を参照されたい）。本発明において有用である市販のセルラーゼとしては、限定するものではないが、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。一部の実施形態では、セルラーゼは、Ｎ末端の一部が欠失している、成熟型の野生型又は変異型セルラーゼの一部又は断片として組み込まれる（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号を参照されたい）。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のセルラーゼのレベルのセルラーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にセルラーゼを、組成物の重量に基づいて約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％セルラーゼのレベルで含む。
洗剤組成物で使用するのに好適な任意のマンナナーゼも同様に本発明において有用である。好適なマンナナーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。一部の実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。本発明において有用な様々なマンナナーゼが既知である（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号、同第６，６０２，８４２号、及び同第６，４４０，９９１号を参照し、これら公報はいずれも参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のマンナナーゼのレベルのマンナナーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にマンナナーゼを、組成物の重量に基いて約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％マンナナーゼのレベルで含む。
一部の実施形態では、ペルオキシダーゼは過酸化水素又は過酸化水素供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩又は過硫酸塩）と組み合わせて本発明の組成物に使用される。一部の代替的な実施形態では、オキシダーゼは酸素と組み合わせて使用される。いずれのタイプの酵素も「溶液を漂白する」（すなわち、布地を一緒に洗浄液で洗浄する場合に、繊維製品の染料が、その染料で染色されている布から他の布へと色移りするするのを予防する）ために、好ましくは増感剤と共に使用される（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ９４／１２６２１号及び同第ＷＯ ９５／０１４２６号を参照されたい）。好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、限定するものではないが、植物、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。一部の実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼのレベルのペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼのレベルで含む。
一部の実施形態では、有用である追加の酵素としては、限定するものではないがペルヒドロラーゼが挙げられる（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ０５／０５６７８２号を参照されたい）。加えて、一部の実施形態では、上述の酵素の混合物、特に、１種以上の追加のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なくとも１種のセルラーゼなどの酵素の混合物が、本発明に包含される。実際に、これらの酵素の多様な混合物が本発明において有用であることは想到される。変異型プロテアーゼ及び１種以上の追加の酵素のレベルは、いずれも独立して約１０％までの範囲で変化し、クリーニング組成物の残部はクリーニング助剤からなることも想到される。具体的なクリーニング助剤の選別は、クリーニングされる表面、物品、又は布地、並びに使用時（例えば、洗剤を用いた洗浄中）のクリーニング条件に所望される組成物の形態を考慮することで容易になされる。
好適なクリーニング助剤の例としては、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ剥離ポリマー、移染剤、移染防止剤、触媒材料、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成された過酸、ポリマー型分散剤、泥汚れ除去剤、構造弾性化剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、フィラー塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光剤、布地コンディショナー、布地柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤、溶媒、色素、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、収縮防止剤、防皺剤、殺菌剤、防カビ剤、色スペックル、銀製品ケア剤、変色防止剤及び／又は防食剤、アルカリ供給源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、色素、及びｐＨ調整剤が挙げられる（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号及び同第５，６４６，１０１号を参照されたい、これら公報はいずれも参照により本明細書に組み込まれる）。クリーニング組成物材料の具体例は以下に詳細に例示する。クリーニング助剤が、クリーニング組成物中で本発明のプロテアーゼ変異体と適合性でない実施形態では、２つの成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤及びプロテアーゼを分離した（すなわち、互いに接触させない）ままにしておくという好ましい手段が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離など）。
一部の実施形態では、本明細書で提供される１種以上のプロテアーゼ変異体の有効量は、タンパク質性の染みを除去する必要のある各種表面をクリーニングするのに有用な組成物中に含まれる。このようなクリーニング組成物としては、硬質表面、布地、及び皿のクリーニングなどの用途向けのクリーニング組成物が挙げられる。実際に、一部の実施形態では、本発明は布地クリーニング組成物を提供するが、他の実施形態では、本発明は非布地用クリーニング組成物を提供する。特に、本発明は、口腔ケア組成物（歯磨剤、歯磨き粉、マウスウォッシュなど、並びに義歯洗浄用組成物を包含する）、皮膚クリーニング組成物及び毛髪クリーニング組成物などのパーソナルケアに好適なクリーニング組成物も提供する。本発明は、任意の形態（すなわち、液体、粒状、バー状、半固形、ゲル、乳濁液、錠剤、カプセル剤など）の洗剤組成物を包含することを意図する。
例として、本発明のプロテアーゼ変異体が有用である数種類のクリーニング組成物について、以降に更に詳細に説明する。本発明のクリーニング組成物が、洗濯機を用いる洗浄方法で使用するのに好適な組成物として配合される一部の実施形態では、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１種の界面活性剤と、少なくとも１種のビルダー化合物と、並びに好ましくは、有機高分子化合物、漂白剤、追加の酵素、抑泡剤、分散剤、石鹸カス分散剤、汚れ懸濁剤及び再付着防止剤、及び防食剤から選択される１種以上のクリーニング助剤と、を含有する。一部の実施形態では、洗濯用組成物は柔軟剤も含有する（すなわち、追加のクリーニング助剤として）。本発明の組成物は、固形又は液体形態の洗剤添加剤としても有用である。このような添加剤は、従来の洗剤組成物の性能を補う及び／又は強化することが意図されるものであり、クリーニングプロセスの任意の段階で添加できる。一部の実施形態では、２０℃で測定した場合、本発明の洗濯洗剤組成物の密度は約４００〜約１２００ｇ／リットルの範囲であり、一方で他の実施形態では約５００〜約９５０ｇ／リットルの範囲である。
食器手洗い方式で使用する組成物として配合される実施形態では、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１種の界面活性剤と、好ましくは有機高分子化合物、起泡剤、第２族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ、及び追加の酵素から選択される少なくとも１種の追加のクリーニング助剤と、を含有する。
一部の実施形態では、米国特許第６，６０５，４５８号に提供されるものなどの様々なクリーニング組成物は、本発明のプロテアーゼ変異体と共に使用される。したがって、一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含有する組成物は、コンパクトな粒状布地クリーニング組成物である一方、他の実施形態では、組成物は、着色された布地を洗濯するのに有用な粒状布地洗浄組成物であり、他の実施形態では、組成物は、洗浄能を通して柔軟効果を提供する粒状布地クリーニング組成物であり、更なる実施形態では、組成物は、強力液体布地クリーニング組成物である。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に記載されるものなどの布地クリーニング組成物である。加えて、本発明のプロテアーゼ変異体は、欧州又は日本の洗浄条件下で特定の実用性を有する粒状洗濯洗剤組成物において有用である（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号を参照されたい）。
一部の代替的な実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む硬質表面クリーニング組成物を提供する。したがって、一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，３７６，４５０号及び同第６，３７６，４５０号に記載されるものなどの硬質表面クリーニング組成物である。
更に他の実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む食器洗浄用組成物を提供する。したがって、一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号、及び同第６，３７６，４５０号に記載されるものなどの硬質表面クリーニング組成物である。更に他の一部の実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む食器洗浄用組成物を提供する。一部の更なる実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む組成物は、米国特許第６，３７６，４５０号及び同第６，３７６，４５０号に記載のものなどの口腔ケア組成物を含む。化合物及びクリーニング助剤の配合及び説明は、上記の米国特許第６，３７６，４５０号、同第６，６０５，４５８号、同第６，６０５，４５８号、及び同第６，６１０，６４２号に包含され、本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体と共に使用される。
本発明のクリーニング組成物は、任意の好適な形態に調合されて、好ましくは配合者により選択される任意のプロセス、例えば、限定するものではないが米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、及び同第５，４８６，３０３号に記載のものなどの任意のプロセスにより調製される。これら公報はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。低ｐＨのクリーニング組成物が所望される場合、かかる組成物のｐＨは、モノエタノールアミン又は酸性材料（例えば、ＨＣｌ）などの追加の材料により調整される。
本発明の目的には必須でないが、以下に例示される助剤の非限定的な一覧は、本発明のクリーニング組成物での使用に好適である。一部の実施形態では、これらの助剤は、例えば、クリーニング性能を補助又は強化させるために、クリーニングされる基材を処理するために、あるいは香料、着色剤、又は染料などの場合にはクリーニング組成物の美観を改善するために組み込まれる。これらの助剤が本発明のプロテアーゼ変異体に添加されることは理解されたい。このような追加的成分の正確な性質及びその添加レベルは、組成物の物理的形態、及び組成物が使用される洗浄操作の性質によって決まる。好適な補助剤としては、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、付着助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定化剤、触媒材料、漂白活性化剤、漂白増進剤、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成された過酸、高分子分散剤、泥汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、構造弾性化剤、布地柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤及び／又は色素が挙げられる。以下の開示に加え、このような他の補助剤の好適な例及び使用レベルは、米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号、及び同第６，３２６，３４８号に記載されており、これら公報は参照により組み込まれる。上述の補助成分は、本発明のクリーニング組成物の残部を構成し得る。
一部の実施形態では、本発明に従うクリーニング組成物は、少なくとも１種の界面活性剤及び／又は界面活性剤系を含み、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤及びこれらの混合物から選択される。一部の低ｐＨクリーニング組成物の実施形態（例えば、原液ｐＨが約３〜約５の組成物の場合）では、界面活性剤がこのような組成物の酸性成分により加水分解される恐れがあると考えられることから、典型的には当該組成物はエトキシル化アルキル硫酸塩を含まない。一部の実施形態では、界面活性剤は、クリーニング組成物の重量に基づいて、約０．１重量％〜約６０重量％のレベルで存在する一方、代替的な実施形態では約１重量％〜約５０重量％のレベルで、あるいは更に他の実施形態では約５重量％〜約４０重量％のレベルで存在する。
一部の実施形態では、本発明の洗剤組成物は、１種以上の洗剤ビルダー又はビルダー系を含む。少なくとも１種のビルダーを組み込む一部の実施形態では、クリーニング組成物は、クリーニング組成物の重量に基づいて、少なくとも約１重量％、約３重量％〜約６０重量％又は更には約５重量％〜約４０重量％のビルダーを含む。ビルダーとしては、限定するものではないが、例えば、ポリリン酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びアルカノールアンモニウム塩、ケイ酸アルカリ金属塩、炭酸のアルカリ土類金属塩及びアルカリ金属塩、アルミノケイ酸塩、ポリカルボン酸塩化合物、エーテルヒドロキシポリカルボン酸塩、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、ポリ酢酸の様々なアルカリ金属塩、アンモニウム塩及び置換アンモニウム塩（例えば、エチレンジアミン四酢酸及びニトリロ三酢酸）、並びにメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びこれらの可溶性塩などのポリカルボン酸類が挙げられる。実際に、本発明の様々な実施形態では任意の好適なビルダーが有用であることが想到される。
一部の実施形態では、ビルダーは水溶性の硬度イオン錯体（例えば、金属イオン封鎖ビルダー）、例えば、クエン酸塩及びポリリン酸塩など（例えば、トリポリリン酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウム、並びにトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとの混合物など）を形成する。当該技術分野において既知のものが挙げられる（例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号参照）、任意の好適なビルダーが、本発明において有用であることが想到される。
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は少なくとも１種のキレート剤を含有する。好適なキレート剤としては、銅、鉄及び／又はマンガンキレート剤及びこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。少なくとも１種のキレート剤を使用する実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、対象とするクリーニング組成物の重量に基づいて、約０．１重量％〜約１５重量％又は更には約３．０重量％〜約１０重量％のキレート剤を含む。
一部の更なる実施形態では、本明細書で提供されるクリーニング組成物は、少なくとも１種の付着助剤を含有する。好適な付着助剤としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸塩、ポリテレフタル酸などの汚れ剥離ポリマー、カオリナイトなどのクレイ、モンモリロナイト、アタパルジャイト（atapulgite）、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物が挙げられる。
本明細書に記載されるように、再付着防止剤は、本発明の一部の実施形態において有用である。一部の実施形態では、非イオン性界面活性剤は有用である。例えば、自動食器洗浄機の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、表面改質の目的で、特にシーチングのために、フィルミングとスポッティングを防止するため、及び光沢を改善するために有用である。これらの非イオンの界面活性剤は、また、汚れの再付着の防止にも有用である。一部の実施形態では、再付着防止剤は、当該技術分野において既知の非イオン性界面活性剤である（例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号を参照されたい）。
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の移染防止剤を包含する。適当なポリマー移染防止剤としては、これらに限定されるものではないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、及びポリビニルイミダゾール、又はこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１種の移染防止剤が使用される実施形態では、本発明のクリーニング組成物において、クリーニング組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、又は更には約０．１重量％〜約３重量％を構成する。
一部の実施形態では、ケイ酸塩が本発明の組成物に含まれる。このような一部の実施形態では、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶質フィロケイ酸塩）は有用である。一部の実施形態では、ケイ酸塩は約１％〜約２０％のレベルで存在する。一部の実施形態では、ケイ酸塩は組成物の約５重量％〜約１５重量％のレベルで存在する。
一部の更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は分散剤も含有する。好適な水溶性有機材料には、ホモポリマー型若しくはコポリマー型の酸又はそれらの塩が挙げられるが、これらに限定されず、このうち、ポリカルボン酸は、炭素原子２個以内の程度で互いに離れている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。
一部の更なる実施形態では、クリーニング組成物に使用される酵素は任意の好適な技術により安定化されている。一部の実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中にカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンの水溶性供給源を存在させて、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを酵素に供給することで安定化する。一部の実施形態では、酵素安定化剤としては、オリゴ糖類、多糖類、及び二価の無機金属塩、例えばアルカリ土類金属塩（カルシウム塩など）が挙げられる。酵素安定化に関する様々な技術が本発明において有用であると想到される。例えば、一部の実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中に、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオンの水溶性供給源、並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ）イオン）の水溶性供給源を存在させて当該イオンを酵素に供給することで安定化される。塩化物及び硫酸塩もまた、本発明の一部の実施形態において有用である。好適なオリゴ糖類及び多糖類（例えば、デキストリン）の例は、当該技術分野において既知である（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ０７／１４５９６４号を参照されたい）。一部の実施形態では、例えば、ホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸）及び／又はトリペプチドアルデヒドなどの可逆的プロテアーゼ阻害剤もまた、所望により更に安定性を改善させるために有用である。
一部の実施形態では、漂白剤、漂白活性化剤及び／又は漂白触媒が、本発明の組成物中に存在する。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、無機及び／又は有機漂白化合物を含む。無機漂白剤としては、限定するものではないが、ペルハイドレート塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）が挙げられる。一部の実施形態では、無機ペルハイドレート塩はアルカリ金属塩である。一部の実施形態では、無機ペルハイドレート塩が、更なる保護はされずに結晶質の固体として含まれるが、他の一部の実施形態では、この塩はコーティングされる。当該技術分野において既知な任意の好適な塩が、本発明において有用である（例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号を参照されたい）。
一部の実施形態では、漂白活性化剤を本発明の組成物に使用する。漂白活性化剤は、典型的には、６０℃以下の温度にてクリーニング過程で漂白作用を増強させる有機過酸前駆体である。本明細書に用いるのに好適な漂白活性化剤としては、過加水分解条件下で好ましくは約１〜約１０個の炭素原子、特に約２〜約４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸及び／又は任意に置換された過安息香酸を生じる化合物が挙げられる。更なる漂白活性化剤も当該技術分野において既知であり、本発明において有用である（例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号を参照されたい）。
加えて、一部の実施形態において及び本明細書に更に記載されるように、本発明のクリーニング組成物は、少なくとも１種の漂白触媒を更に含む。一部の実施形態では、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、並びにコバルト錯体、銅錯体、マンガン錯体、及び鉄錯体も有用である。その他の漂白触媒も本発明において有用である（例えば、米国特許第４，２４６，６１２号、同第５，２２７，０８４号、及び同第４，８１０，４１０号；ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ９９／０６５２１号；及び欧州特許第２ １００ ９４９号を参照されたい）。
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は１種以上の触媒型金属錯体を含有する。一部の実施形態では、金属系漂白触媒は有用である。一部の実施形態では、金属系漂白触媒には、所定の漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン又はマンガンカチオン）、漂白触媒活性をわずかしか有さない又は全く有さない補助金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムカチオン）、及び触媒型及び補助金属カチオンに関して所定の安定性定数を有する金属イオン封鎖剤、具体的には、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）及びこれらの水溶性塩を含む触媒系が含まれる（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号を参照されたい）。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物はマンガン化合物により触媒される。このような化合物及び使用レベルは当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，５７６，２８２号を参照されたい）。追加の実施形態では、コバルト漂白触媒は、本発明のクリーニング組成物において有用である。様々なコバルト漂白触媒が当該技術分野において既知であり（例えば、米国特許第５，５９７，９３６号及び同第５，５９５，９６７号を参照されたい）、既知の手順により容易に調製される。
一部の更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、マクロ多環式剛性配位子（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含有する。実際問題として、制限を目的とするものではないが、一部の実施形態では、本発明により提供される組成物及びクリーニング方法は、水性洗浄媒質中に少なくとも１ｐｐｈｍの次数で活性ＭＲＬ種を供給するように調整され、及び一部の実施形態では約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、より好ましくは約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、及び最も好ましくは約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬが洗浄液中に供給される。
一部の実施形態では、本発明の遷移金属漂白触媒の遷移金属としては、限定するものではないが、例えば、マンガン、鉄及びクロムが挙げられる。同様に、ＭＲＬとしては、限定するものではないが、例えば、特定の架橋型超剛性配位子（例えば、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ（６．６．２）ヘキサデカン）が挙げられる。好適な遷移金属ＭＲＬは、既知の手順により容易に調製される（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ第２０００／３２６０１号及び米国特許第６，２２５，４６４号を参照されたい）。
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、金属製品ケア剤を含有する。金属製品ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、及び非鉄金属（例えば、銀及び銅）を包含する金属の、変色、腐食、及び／又は酸化の予防及び／又は軽減に有用である。好適な金属製品ケア剤としては、米国特許第２ １００ ９４９号、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ９４／２６８６０号、及び同第ＷＯ ９４／２６８５９号に記載のものが挙げられる。一部の実施形態では、金属製品ケア剤は亜鉛塩である。一部の更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の金属製品ケア剤を約０．１重量％〜約５重量％含む。
一部の実施形態では、クリーニング組成物は、サーモリシン変異体プロテアーゼを有する高密度液体（ＨＤＬ）組成物である。ＨＤＬ洗濯洗剤は、アニオン性洗浄用界面活性剤（直鎖状又は分岐鎖状又はランダム鎖状の、置換又は非置換のアルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はそれらの混合物からなる群から選択されるもの）、及び場合により非イオン性界面活性剤（直鎖状又は分岐鎖状又はランダム鎖状の、置換又は非置換のアルキルアルコキシル化アルコール、例えば、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシル化アルコール、及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシラートからなる群から選択されるもの）を包含する洗浄用界面活性剤（１０％〜４０％）を含んでいてよく、場合により、アニオン性洗浄用界面活性剤（６．０〜９の親水性指標（ＨＩｃ）を有する）と非イオン性洗浄用界面活性剤との重量比は、１：１超である。
組成物には、場合により、両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー（アルコキシル化ポリアルキレンイミンなどの、分枝鎖状で親水性及び疎水性特性を有するアルコキシル化ポリマーからなる群から０．０５重量％〜１０重量％の範囲で選択される）、及び／又はランダムグラフトポリマー（典型的には、不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、マレイン酸無水物、グリセロールなどの飽和多価アルコール、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む、親水性主鎖と、Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖（１種又は複数種）とを含む）からなる、界面活剤の効果を増進するポリマーを含めることもできる。
組成物には、追加ポリマー、例えば汚れ剥離ポリマー（アニオン性末端保護ポリエステル、例えば、ＳＲＰ１、ランダム又はブロック構成で、単糖類、ジカルボン酸、ポリオール及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１種のモノマー単位を含むポリマー、ランダム又はブロック構成のエチレンテレフタレート系ポリマー及びそれらのコポリマーであって、例えば、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ ＳＦ、ＳＦ−２及びＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００及びＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ ＳＬを含む）、再付着防止ポリマー（分子量５００〜１００，０００Ｄａの範囲の、アクリル酸、マイレン酸（若しくはマレイン酸無水物）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸、及びこれらの任意の混合物から選択される少なくとも１種のモノマーを含むポリマー、ビニルピロリドンホモポリマー、並びに／又はポリエチレングリコールなどのカルボキシレートポリマーを０．１重量％〜１０重量％含む）、セルロースポリマー（アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロースであって、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、及びこれらの混合物などから選択されるものを含む）、並びに高分子カルボキシレート（マレイン酸／アクリル酸ランダムコポリマー又はポリアクリル酸ホモポリマーなど）などを含めることもできる。
組成物は、飽和又は不飽和脂肪酸、好ましくは飽和又は不飽和Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）、及び付着補助剤を含んでもよく、付着補助剤の例としては、多糖類、好ましくはセルロース系ポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムハロゲン化物（ＤＡＤＭＡＣ）、及びＤＡＤＭＡＣと、ビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、ハロゲン化イミダゾリニウム、及びそれらの混合物との、ランダム又はブロック構成のコポリマー、カチオン性グアーガム、カチオン性セルロース（例えば、カチオン性ヒドロキシエチル（hydoxyethyl）セルロースなど）、カチオン性デンプン、カチオン性ポリアシルアミド、並びにそれらの混合物が挙げられる。
組成物には、更に、移染防止剤を含ませることもでき、移染防止剤としては、例えば、マンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール、並びに／又はこれらの混合物、キレート剤（例えば、エチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシ−エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−二コハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）が挙げられる）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリム塩（ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸、クエン酸及びその任意の塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
組成物は、更に、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ，リゾホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びこれらの任意の混合物から選択される酵素（約０．０１重量％活性酵素〜０．０３重量％活性酵素）を含ませることもできる。組成物は、酵素安定化剤（例としては、プロピレングリコール若しくはグリセロールなどのポリオール類、糖若しくは糖アルコール、乳酸、可逆的プロテアーゼ阻害剤、ホウ酸、若しくは芳香族ホウ酸エステルなどのホウ酸誘導体、又は４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体が挙げられる）を含んでもよい。
組成物は、更に、シリコーン又は脂肪酸系抑泡剤、色調染料、カルシウムカチオン及びマグネシウムカチオン、視覚に訴える成分（visual signaling ingredients）、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）、及び／又は構造化剤／増粘剤（０．０１重量％〜５重量％、ジグセリド及びトリグリセリド、ジステアリン酸エチレングリコール、結晶セルロース、セルロース系材料、微小繊維状セルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、及びこれらの混合物からなる群から選択されるもの）を含ませることもできる。
好適な洗浄用界面活性剤には、更に、カチオン性洗浄用界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）、双性イオン性及び／又は両性洗浄用界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインからなる群から選択される）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、並びにこれらの混合物も含まれる。
組成物は任意の液体形態であってよく、例えば、液体又はジェル形態、あるいはこれらの組み合わせてあってよい。組成物は、任意の一回用量形状、例えば、パウチに入れられてもよい。
一部の実施形態では、クリーニング組成物は、サーモリシン変異体プロテアーゼを有する高密度粉末（ＨＤＤ）組成物である。ＨＤＤ粉末洗濯洗剤は、洗浄用界面活性剤、例えば、アニオン性洗浄用界面活性剤（例えば、直鎖状又は分岐鎖状又はランダム鎖状の、置換又は非置換のアルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はそれらの混合物からなる群から選択される）、非イオン性洗浄用界面活性剤（例えば、直鎖状又は分岐鎖状又はランダム鎖状の、置換又は非置換のＣ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレート、及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートからなる群から選択される）、カチオン性洗浄用界面活性剤（例えば、アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及びそれらの混合物からなる群から選択される）、双性イオン性及び／又は両性洗浄用界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインからなる群から選択される）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びそれらの混合物など；ビルダー、例えば、リン酸塩を含まないビルダー（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲の、ゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰ及びゼオライトＭＡＰなどのゼオライトビルダー）、リン酸塩ビルダー（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲の、トリポリリン酸ナトリウムを包含する）、１５重量％未満の範囲のクエン酸、クエン酸塩、及びニトリロ三酢酸又はその塩、ケイ酸塩（０重量％〜１０重量％未満の範囲のケイ酸ナトリウム若しくはケイ酸カリウム又はメタケイ酸ナトリウム、或いは層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））、炭酸塩（０重量％〜１０重量％未満の範囲の、炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウム）；並びに漂白剤（すなわち、フォトブリーチであって、例としては、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料、及びそれらの混合物が含まれる）、疎水性若しくは親水性の漂白活性剤（例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシ安息香酸若しくはその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、及びノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）、ニトリル四級アンモニウム塩、並びにこれらの混合物を含む）、過酸化水素、過酸化水素供給源（無機ペルハイドレート塩、例えば、過ホウ酸、過炭酸、過硫酸、過リン酸又は過ケイ酸のナトリウム塩一水和物又は四水和物を含む）、予形成された親水性及び／又は疎水性の過酸（過カルボン酸及びその塩、過炭酸及びその塩、ペルイミド酸及びその塩、ペルオキシ一硫酸及びその塩からなる群から選択される）、並びにこれらの混合物及び／又は漂白触媒（例えば、イミニウムカチオン及びポリイオンを含むイミン漂白増進剤など、イミニウム双性イオン、変性アミン、変性アミンオキシド、Ｎ−スルホニルイミン、Ｎ−ホスホニルイミン、Ｎ−アシルイミン、チアジアゾールジオキシド、ペルフルオロイミン、環状糖ケトン及びこれらの混合物、並びに金属含有漂白触媒（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン又はマンガンカチオンと、亜鉛又はアルミニウムなどの補助金属カチオン）が挙げられる）、並びにエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）及びそれらの水溶性塩などの金属イオン封鎖剤を含ませることができる。
組成物は、更に、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される酵素を含めることもできる。
組成物は、更に、香料マイクロカプセル、デンプン封入香料アコード、色調剤、布地統合剤及びカチオン性ポリマーなどの追加のポリマー、染料固定成分（dye lock ingredient）、布地柔軟剤、増白剤（例えば、カラーインデックス（Ｃ．Ｉ．）蛍光増白剤）、凝集剤、キレート剤、アルコキシル化ポリアミン、布地付着助剤、及び／又はシクロデキストリンを包含する追加の洗浄成分を含めてもよい。
一部の実施形態では、クリーニング組成物は、サーモリシン変異体プロテアーゼを有する自動食器洗い機用（ＡＤＷ）洗剤組成物である。ＡＤＷ洗剤組成物は、０〜１０重量％の量で存在する２種以上の非イオン性界面活性剤であって、エトキシル化非イオン性界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシキャップされたポリ（オキシアルキル化）アルコール、又はアミンオキシド界面活性剤から選択されるもの；５〜６０％の範囲のビルダーであって、リン酸塩ビルダー（一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩又はオリゴマー化ポリリン酸塩、好ましくはトリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ））又はリン酸を含まないビルダー［アミノ酸系化合物、例えばＭＧＤＡ（メチルグリシン二酢酸）及びその塩並びにそれらの誘導体、ＧＬＤＡ（グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸）及びその塩並びにそれらの誘導体、ＩＤＳ（イミノ二コハク酸）及びその塩並びにそれらの誘導体、カルボキシメチルイヌリン及びその塩及びそれらの誘導体並びにこれらの混合物、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｂ−アラニン二酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）及びその塩を含む］のうちいずれかを含むビルダー；約０．５重量％〜約５０重量％の範囲の、ポリカルボン酸のホモポリマー及びコポリマー並びにそれらの部分中和した又は完全中和した塩、カルボン酸モノマー及びポリカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸並びにそれらの塩；約０．１重量％〜約５０重量％の範囲の、スルホン化／カルボキシル化ポリマー（製品に寸法安定性を付与するためのもの）；約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の、乾燥補助剤（ポリエステルから選択され、特にアニオン性ポリエステルであって、場合により、重縮合を促す３〜６個の官能基、具体的には酸、アルコール又はエステル官能基を有する更なるモノマーを併せ持つもの、ポリカーボネート−、ポリウレタン−及び／若しくはポリ尿素−ポリオルガノシロキサン化合物又はその反応性環状炭酸エステル及び尿素型の前駆体化合物）；約１重量％〜約２０重量％の範囲のケイ酸塩（ケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム、例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム及び結晶質フィロケイ酸塩など）；無機漂白剤（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩及び過ケイ酸塩などのペルハイドレート塩）及び有機漂白剤（例えば、過酸化ジアシル及びテトラアシル、特に、ジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸（diperoxytetradecanedioc acid）、及びジペルオキシヘキサデカン二酸（diperoxyhexadecanedioc acid）などの有機ペルオキシ酸）；漂白活性剤（即ち、約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の有機過酸前駆物質）；漂白触媒（マンガン−トリアザシクロノナン及び関連する錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ及びＦｅビスピリジルアミン及び関連する錯体、並びにペンタミン酢酸コバルト（ＩＩＩ）及び関連する錯体から選択されるもの）；約０．１重量％〜５重量％の範囲の金属製品ケア剤（ベンゾトリアゾール（benzatriazole）、金属塩及び錯体、及び／又はケイ酸塩）；自動食器洗浄用洗剤組成物１グラム当たり活性酵素約０．０１〜５．０ｍｇの範囲の酵素（プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びそれらの任意の混合物などから選択されるもの）；並びに酵素安定化剤成分；（オリゴ糖、多糖類、及び二価の無機金属塩から選択されるもの）を含ませることができる。
以下の表に、本発明の変異型サーモリシン変異体（variant thermolysin variant）を有する組成物として有用な代表的な洗剤組成を示す。
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 １次の成分を含むコポリマー。
ｉ）モノ不飽和又はポリ不飽和カルボン酸からなる群から選択されるモノマー、
ｉｉ）一般式：Ｒ１（Ｒ２）Ｃ＝Ｃ（Ｒ３）−Ｘ−Ｒ４で表されるモノマー（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、互いに独立して、−Ｈ、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を表し、Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−及び−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−からなる群から選択される任意に含まれるスペーサー基を表し、そしてＲ４は、炭素原子数２〜２２の直鎖又は分枝鎖飽和又は不飽和アルキル残基、好ましくは炭素原子数６〜２２の芳香族残基を表す。）、
ｉｉｉ）場合により、追加モノマー。
２次の一般式で表される非イオン性界面活性剤：Ｒｌ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２０−（ＡＯ）ｗ−（Ａ’０）ｘ−（Ａ’’０）ｙ−（Ａ’’’０）ｚ−Ｒ２（式中、Ｒｌは直鎖又は分枝鎖の飽和又はモノ不飽和若しくはポリ不飽和Ｃ６〜２４アルキル又はアルケニル残基を表し、Ｒ２は炭素原子数２〜２６の直鎖又は分枝鎖炭化水素残基を表し、Ａ、Ａ’、Ａ’’及びＡ’’’は、互いに独立して、−−−ＣＨ２ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２−−−ＣＨ２、−−−ＣＨ２ＣＨ２−−ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ−（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ３）からなる群から選択される残基を表し、そしてｗ、ｘ、ｙ及びｚは０．５〜１２０の範囲の値を表し、更にｘ、ｙ及び／又はｚは０であってもよい。）
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脂肪酸系基剤１は、ヤシ油脂肪酸のナトリウム塩２０重量％、非高分子系のポリオール（ソルビトール、グリセリン、プロピレングリコール、サッカロース及びグルコース）５０重量％、アニオン性及び非イオン性界面活性剤１５重量％、並びに水１５重量％から構成される。
脂肪酸系基剤２は、ステアリン酸のナトリウム塩２０重量％、ラウリン酸のナトリウム塩３重量％、ミリスチン酸のナトリウム塩３重量％、非高分子系のポリオール（ソルビトール、グリセリン、及びプロピレングリコール）５０重量％、ラウリン酸２重量％、ステアリン酸２重量％、アニオン性界面活性剤１０重量％、及び水１０重量％から構成される。
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上記のように、本発明のクリーニング組成物は、任意の好適な形態に配合されて、配合者により選択された任意のプロセスで調製される（非限定的な例については、米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、及び同第５，４８６，３０３号に記載されており、そしてこれら公報はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。低ｐＨのクリーニング組成物が所望される他の一部の実施形態では、このような組成物のｐＨは、ＨＣｌなどの酸性材料を添加することで調整される。
本明細書で開示されるクリーニング組成物は、部位のクリーニングにおいて有用である（例えば、表面、物品、食器類又は布地）。典型的には、このような部位の少なくとも一部を、原液又は洗浄液で希釈した本発明のクリーニング組成物と接触させ、そしてその後、場合により、その部位を洗浄及び／又はすすぎ洗いする。本発明の目的に関し、「洗浄」には、擦ること及び機械的撹拌が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、典型的には溶液中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は、典型的には、約５℃〜約９０℃の範囲であり、部位が布地を含む場合、水と布地との質量比は、典型的には、約１：１〜約３０：１である。
クリーニング組成物の製造及び使用方法
本発明のクリーニング組成物は、任意の好適な形態に組成配合されて、配合者により選択された任意の好適なプロセスにより調製される（例えば、米国特許第同第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、同第５，４８６，３０３号、同第４，５１５，７０５号、同第４，５３７，７０６号、同第４，５１５，７０７号、同第４，５５０，８６２号、同第４，５６１，９９８号、同第４，５９７，８９８号、同第４，９６８，４５１号、同第５，５６５，１４５号、同第５，９２９，０２２号、同第６，２９４，５１４号及び同第６，３７６，４４５号を参照されたい）。
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、錠剤、カプセル、分包剤、パウチ、及び多区画パウチなどの一回用量形状で提供される。一部の実施形態では、一回用量形式は、多区画パウチ（又は他の一回用量形式）内の成分を制御放出するよう設計される。好適な一回用量形式及び制御放出形式は、当該技術分野において既知である（単位容量及び制御放出形式での使用に好適な材料に関しては、例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ０２／１０２９５５号、米国特許第４，７６５，９１６号及び同第４，９７２，０１７号、並びにＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ０４／１１１１７８号を参照されたい）。一部の実施形態では、一回用量形状は、水溶性フィルムで包装された錠剤又は水溶性パウチとして提供される。様々な一回用量形式が欧州特許第２ １００ ９４７号に提示されており、当該技術分野においても既知である。
使用方法
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、表面（例えば、食器）、洗濯物、硬質表面、コンタクトレンズなどのクリーニングにおいて有用である。一部の実施形態では、表面の少なくとも一部を、原液又は洗浄液で希釈した本発明のクリーニング組成物の少なくとも一実施形態と接触させ、そしてその後、場合により、表面を洗浄及び／又はすすぎ洗いする。本発明の目的に関し、「洗浄」には、擦ること及び機械的洗浄が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、溶液中約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である一部の実施形態では、水温は、典型的には約５℃〜約９０℃の範囲である。
本発明は、クリーニングの必要がある物品又は表面（例えば、硬質表面）をクリーニング又は洗浄する方法を提供し、こうした方法としては、これらに限定するものではないが、食器類、食卓用食器類、布地物品、洗濯物物品、パーソナルケア物品等のクリーニング又は洗浄方法、及び硬質若しくは軟質表面（例えば、物品の硬質表面）のクリーニング又は洗浄方法が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明は、クリーニングする必要のある物品、対象物、又は表面をクリーニングするための方法を提供し、方法は、物品又は表面（又はクリーニングされることが所望される物品又は表面の一部）を本発明の少なくとも１種のサーモリシン変異体プロテアーゼ又は本発明の組成物と、物品、対象物若しくは表面を所望される程度まで洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又はそうするのに好適な及び／又は有効な条件下で接触させることを含む。このような方法の一部は、物品、物体、又は表面を水ですすぐ工程を更に含む。このような方法の一部では、クリーニング組成物は食器洗剤組成物であり、クリーニングされる物品又は物体は食器類又は食卓用食器類である。本明細書で使用するとき、「食器類」は、食品を給仕する際又は食べる際に一般的に使用される物品である。食器類は、これらに限定するものではないが、例えば深皿、平皿、カップ、椀等のようなものであり得る。本明細書で使用するとき、「食卓用食器類」はより広義の用語であり、これらに限定するものではないが、例として深皿、金属食器、ナイフ、フォーク、スプーン、箸、ガラス食器、水差し、ソース入れ、飲用容器、給仕用具等が挙げられる。「食卓用食器類」は食品を給仕する又は食べるための上記又は類似物品のいかなるものも包含することを意図する。このような方法の一部では、クリーニング組成物は、自動食器洗浄用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品又は物体は、食器又は食卓用食器類である。このような方法の一部では、クリーニング組成物は、洗濯洗剤組成物（例えば、粉末洗濯洗剤組成物又は液体洗濯洗剤組成物）であり、クリーニングされる物品は布地物品である。その他の一部の実施形態では、クリーニング組成物は洗濯物前処理用組成物である。
一部の実施形態では、本発明は、それぞれ所望によりクリーニング又は洗浄が必要な布地物品をクリーニング又は洗浄する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、布地又は洗濯物洗浄組成物を包含する、プロテアーゼ変異体を含む組成物、及びクリーニングが必要な布地物品又は洗濯物物品を準備する工程と、この布地物品又は洗濯物物品（又はクリーニングが望ましい物品の一部）を、組成物に、布地又は洗濯物物品を望ましい程度までクリーニング又は洗浄するのに十分な又は有効な条件下で接触させる工程と、を含む。
一部の実施形態では、本発明は、所望によりクリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、硬質表面）をクリーニング又は洗浄するための方法を提供し、方法は、クリーニング又は洗浄される物品又は表面を準備する工程、並びに物品又は表面（又はクリーニング又は洗浄することが所望される物品又は表面の一部）を、本発明の少なくとも１種のサーモリシン変異体又はこのようなサーモリシン変異体を少なくとも１種含有する本発明の組成物に、所望される程度まで物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又はそうするのに十分又は有効な条件下で接触させる工程を含む。このような組成物としては、これらに限定するものではないが、例えば、本発明のクリーニング組成物又は洗剤組成物（例えば、食器手洗い用洗剤組成物、食器手洗い用クリーニング組成物、洗濯洗剤又は布地洗剤又は洗濯物若しくは布地クリーニング組成物、液体洗濯洗剤、液体洗濯物クリーニング組成物、粉末洗濯洗剤組成物、粉末洗濯物クリーニング組成物、自動食器洗浄用洗剤組成物、洗濯用補助クリーニング又は洗剤組成物、洗濯物クリーニング添加剤、及び洗濯物シミ抜き前処理用組成物（laundry pre-spotter composition）等）が挙げられる。一部の実施形態では、本方法は、特に追加のクリーニング又は洗浄が望ましい場合に、１回以上繰り返される。例えば、場合によっては、本方法は任意で、その物品又は表面を望ましい程度までクリーニング又は洗浄するのに十分な又は有効な時間にわたって、物品又は表面を少なくとも１種のプロテアーゼ変異体又は組成物に接触させ続ける工程を更に含む。一部の実施形態では、本方法は、物品又は表面を水及び／又は別の液体ですすぐ工程を更に含む。一部の実施形態では、本方法は、物品又は表面を少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体又は本発明の組成物と再度接触させる工程と、その物品又は表面を望ましい程度までクリーニング又は洗浄するのに十分な又は有効な時間にわたって、物品又は表面を少なくとも１種のプロテアーゼ変異体又は組成物に接触させ続ける工程と、を更に含む。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、食器洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は食器又は食卓用食器類である。本方法の一部の実施形態では、クリーニング組成物は、自動食器洗浄用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は食器又は食卓用食器類である。本方法の一部の実施形態では、クリーニング組成物は洗濯洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は布地物品である。
本発明はまた、自動食器洗浄機で食卓用食器類又は食器類をクリーニングする方法を提供し、この方法は、自動食器洗浄機を準備する工程、食卓用食器類又は食器類をクリーニングするのに十分な量の、本発明のサーモリシン変異体を少なくとも１種含有している自動食器洗浄機用組成物又は本発明の組成物を自動食器洗浄機内に（例えば、組成物を適切な又は食器洗浄機内に装備された洗剤区画若しくはディスペンサーに入れることにより）入れる工程と、自動食器洗浄機内に食器類又は食卓用食器類を入れる工程と、食卓用食器類又は食器類がクリーニングされるよう自動食器洗浄機を操作する工程（例えば、製造元による取り扱い説明書に従って）と、を含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の任意の自動食器洗浄機用組成物を包含し、組成物は、限定するものではないが本明細書で提供されるサーモリシン変異体を少なくとも１種含む。自動食器洗浄用組成物の使用量は、製造元による取り扱い説明書又は提案に従って容易に決定することができ、本明細書に記載のものを含めて、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含むいかなる形態の自動食器洗浄用組成物（例えば、液体、粉末、固体、ゲル、錠剤等）も使用できる。
本発明は、所望によりクリーニングする必要のある表面、物品又は対象物をクリーニングするための方法も提供し、本方法は、所望される程度まで物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又はそうするのに十分な若しくは有効な条件下で、物品又は表面（又はクリーニングすることが所望される物品又は表面の一部）を、原液若しくは洗浄溶液に希釈した本発明の少なくとも１種のサーモリシン変異体又は本発明のクリーニング組成物と接触させる工程を含む。必要に応じて、その後、表面、物品、又は対象物を（任意に）洗浄し及び／又はすすいでもよい。本発明の目的に関し、「洗浄」には、例えば擦ること及び機械的撹拌が包含されるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、溶液（例えば水溶液）中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は、典型的には、約５℃〜約９０℃の範囲であり、表面、物品又は対象物が布地を含む場合、水と布地との質量比は、典型的には約１：１〜約３０：１である。
本発明は、洗濯物又は布地物品を洗濯機でクリーニングする方法も提供し、方法は、洗濯機を準備する工程と、洗濯物又は布地物品をクリーニングするのに十分な量の、本発明のサーモリシン変異体を少なくとも１種含む洗濯洗剤組成物を（例えば、組成物を洗濯機内の適切な又は備え付けの洗剤区画又はディスペンサーに入れることにより）洗濯機内に入れる工程と、洗濯機内に洗濯物又は布地物品を入れる工程と、及び洗濯物又は布地物品がクリーニングされるように洗濯機を（例えば、製造元の取扱説明書に従って）操作する工程と、を包含する。本発明の方法は、限定するものではないが、本明細書で提供される少なくとも１種の任意のサーモリシン変異体を含む、本明細書に記載の任意の洗濯物洗浄用洗剤組成物を包含する。洗濯洗剤組成物の使用量は、製造元の取扱説明書又は提案に従って容易に決定することができ、本明細書に記載のものを含めて、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含むいかなる形態の洗濯洗剤組成物（例えば、固体、粉末、液体、錠剤、ゲル等）も使用できる。
実験
（実施例１）
アッセイ
以下のアッセイは、以下に記載の実施例に使用した標準アッセイ法である。場合により、特定のプロトコルは、これらの標準アッセイにあてはまらないこともある。この場合、以下のこれらの標準アッセイプロトコルから外れた部分については、実施例中で規定する。
Ａ．性能指数
性能指数（ＰＩ）は、同一タンパク質濃度下での変異体の性能（実測値）と標準酵素の性能（理論値）とを比較するものである。加えて、標準酵素のラングミュア等式のパラメータを用いることで、理論値が算出できる。
１を超える性能指数（ＰＩ）（ＰＩ＞１）は、標準（例えば、サーモリシン）に比べて改善された変異体による性能を示し、一方、ＰＩが１の場合（ＰＩ＝１）は、変異体の性能が標準と同じであることを示し、ＰＩが１未満である場合（ＰＩ＜１）は、変異体の性能が標準よりも劣ることを示す。
Ｂ．９６穴マイクロタイタープレートにおけるＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａプロテーゼアッセイ
サーモリシンメタロプロテアーゼ及びサーモリシンメタロプロテアーゼ変異体のプロテアーゼ活性を決定するために、２−アミノベンゾイル−Ｌ−アラニルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニノ−４−ニトロベンジルアミド（Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａ）の加水分解を測定する。
使用する試薬溶液は次の通りである。
ｉ）ＭＥＳ緩衝液（ＮａＯＨでｐＨ ６．５に調整した５２．６ｍＭ ＭＥＳであって、２．６ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．００５２６％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有するもの）
ｉｉ）Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａ保存液（ＤＭＦ中、４８ｍＭ Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａ）（室温において遮光保存）
ｉｉｉ）プロピレングリコールを含む酵素希釈用緩衝液（１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．００５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０、１０％プロピレングルコール）
２．４ｍＭ Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａ実験溶液を調製するために、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａ保存液１ｍＬをＭＥＳ緩衝液１９ｍＬに添加して、少なくとも１０秒間にわたって十分に混合する。この溶液は室温において遮光保存しておく。
プロテアーゼ溶液を調製するために。サーモリシン変異体の濾別した培養上清を、酵素希釈用緩衝液で５０倍に希釈する。
アッセイは、蛍光発光の読みに適した使い捨て用黒色ポリスチレン製平底９６穴マイクロプレート（例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ ６５５０７６）において行う。先ず、２．４ｍＭ Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａ実験溶液１９５μＬを９６穴マイクロアッセイプレートの穴にそれぞれ加えた後、希釈したプロテアーゼ試料５μＬを添加する、この溶液を５秒間混合し、動態測定モードにおいて２５℃でマイクロプレート分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて蛍光発光の変化を測定する（１８０秒間に９回読み取る。励起波長３５０ｎｍ、発光波長４１５ｎｍ、カットオフフィルターは使用せず）。蛍光発光の変化度（ＲＦＵ／秒）（ＲＦＵ＝相対的蛍光度単位）により、プロテアーゼ活性の測定が得られる。
Ｃ．安定性試験
配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型サーモリシン酵素に対するサーモリシン変異体の熱安定性は、プロテアーゼ試料をＨＥＰＥＳ緩衝液又は洗剤溶液のいずれかにおいて定義された条件下でインキュベートすることにより決定される。インキュベーション温度は、インキュベーション後の野生型サーモリシンの残留活性が初期活性の約３０％となるにように選択する。初期活性及び残留サーモリシン活性は、上記Ｂ欄で説明したＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａアッセイを利用して決定する。
使用する試薬溶液は次の通りである。
１．２．４ｍＭ Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａ実験溶液（上記Ｂ参照）
２．希釈用緩衝液：１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０
３．ＨＥＰＥＳ緩衝液：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０、ｐＨ ７．１５
４．ＡＴ処方洗剤（ｐＨ ８）（２１°ＧＨ（総硬度）の水中、２．５ｇ／Ｌ）
５．Ｓｕｎ Ａｌｌ−ｉｎ−１ Ｔｕｒｂｏ Ｇｅｌ洗剤（ｐＨ ６．３）（２１°ＧＨ（総硬度）の水中、３ｇ／Ｌ）
６．サーモリシン変異体の濾別した培養上清
上記一連のアッセイで使用する装置は、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭマイクロプレート蛍光分光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）及びＴｅｔｒａｄ２ Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を備えている。
緩衝液中での熱安定性アッセイ：
サーモリシン変異体の培養上清をＨＥＰＥＳ緩衝液に約１μｇ／ｍｌまで希釈して、希釈酵素試料を５０μｌ／穴で９６穴ＰＣＲプレートへ移す。酵素試料５μＬを、２．４ｍＭ Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａ基質溶液１９５μＬを入れた黒色９６穴アッセイマイクロプレート（例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ ６５５０７６）に移すことにより、上記Ｂ欄で説明した通りにＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａアッセイを利用して酵素試料の初期活性を測定する。残りの４５μｌ／穴の酵素試料を含むＰＣＲプレートを接着剤箔シール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｂ−シール）で密封し、Ｔｅｔｒａｄ２サーマルサイクラーに入れて、８３℃で１５分間インキュベートする。インキュベーション後、試料を含むＰＣＲプレートを室温まで冷却させ、酵素試料５μＬを、２．４ｍＭ Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａ基質溶液１９５μＬを入れた黒色９６穴アッセイマイクロプレート（例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ ６５５０７６）に移すことにより、上記Ｂ欄で説明した通りにＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａアッセイを利用して酵素試料の残留活性を測定する。
熱安定性活性は、加熱インキュベーション後の酵素活性を加熱インキュベーション前の酵素活性で除したものに基づいて算出し、残留活性（％）として表す。熱安定性に関する性能指数は、変異体酵素の活性比を、配列番号３のアミノ酸配列を有する同様に処理した野生型サーモリシンの活性比と比較することで決定される。
洗剤安定性試験：
サーモリシン変異体の洗剤安定性は、変異体をストレス条件下、Ｓｕｎ Ａｌｌ−ｉｎ−１ Ｔｕｒｂｏ Ｇｅｌ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）として商業的に既知の自動食器洗浄用液体洗剤の０．３％（ｗ／ｖ）溶液中及ＡＴ処方洗剤（ｐＨ ８）（Ｅ欄に記載のもの）の０．２５％（ｗ／ｖ）の溶液中、高温でインキュベートすることによりモニターする。市販のＳｕｎ Ａｌｌ−ｉｎ−１ Ｔｕｒｂｏ Ｇｅｌ洗剤中の酵素を、１０％洗剤溶液を８０℃で２時間インキュベートすることで熱失活させる。インキュベーション終了時、測定されたｐＨ値は６．３である。
サーモリシン変異体の培養上清を洗剤溶液で約１μｇ／ｍｌまで希釈して、希釈された酵素試料を９６穴ＰＣＲプレートに５０μｌ／穴で移す。ＰＣＲプレートを接着剤箔シール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ−Ｂシール）で密封させ、Ｔｅｔｒａｄ２サーマルサイクラーに入れて１５分間にわたってインキュベートする。インキュベーション温度は、インキュベーション後の野生型サーモリシンの残留活性が初期活性の約３０％となるように選択する。熱失活させたＳｕｎ Ａｌｌ−ｉｎ−１ Ｔｕｒｂｏ Ｇｅｌ中の試料を８１℃で１５分間インキュベートし、また、ＡＴ処方洗剤（ｐＨ ８）中の試料を６９℃で１５分間インキュベートする。インキュベーション後、試料を含むＰＣＲプレートを室温まで冷却し、酵素試料５μＬを、２．４ｍＭ Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａ基質溶液１９５μＬを含む黒色９６穴アッセイマイクロプレート（例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ ６５５０７６）に移すことにより、Ｂ欄で説明した通りにＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａアッセイを利用して、酵素試料の残留活性を測定する。
洗剤活性比は、熱インキュベーション後の洗剤溶液の酵素活性を熱インキュベーション前のＨＥＰＥＳ緩衝液中での酵素活性によって除したものに基づいて算出し、残留活性（％）として表す。
洗剤安定性に関する性能指数は、変異体酵素の活性比を、配列番号３のアミノ酸配列を有する同様に処理された野生型サーモリシン酵素と比較することにより決定される。
Ｄ．ＰＡＳ−３８微小布見本アッセイ
サーモリシン変異体の洗浄性能を、予め卵黄と色素でシミをつけたポリアクリル織物片上での微小布見本アッセイ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ、ＣＦＴ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を利用して９６穴マイクロプレート形式で試験する。プロテアーゼ洗浄性能アッセイの原理は、微小布見本に付けられた卵黄の加水分解に基づく卵黄粒子とカーボンブラック染料との遊離に基づいている。洗浄液の４０５ｎｍでの吸光度を測定することで、分析試料中のプロテアーゼ活性の測定が得られる（ｐＨ、温度及び洗剤などの所望の条件下）。
使用した試薬及び溶液：
１．ＰＡＳ−３８微小布見本（卵黄が付いたポリアクリル布を、エージングしてカーボンブラック染料で着色したもの；ＣＦＴ−Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
２．ＰＡＰを含む及び含まないクエン酸系洗剤（ｐＨ８）（ＡＴ処方、Ｅ欄参照）
３．熱失活させた市販の液体洗剤Ｓｕｎ Ａｌｌ−ｉｎ−１ Ｔｕｒｂｏ Ｇｅｌ
４．１００ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ １０．２）（すすぎ用緩衝液）
５．ポリプロピレングリコールを含む希釈用緩衝液：１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０溶液、１０％プロピレングリコール
洗剤及び条件：
プロテアーゼ試料（ＭＴＰプレート中で成長させた細菌培養物から濾別した上清）を、いくつかの条件下において好適な濃度で試験する。
−ＡＴ処方洗剤（ｐＨ ６）、５０℃、アッセイ中でのプロテアーゼ最終濃度約０．３μｇ／ｍｌ
−ＡＴ処方洗剤（ｐＨ ８）、５０℃、アッセイ中でのプロテアーゼ最終濃度約０．２μｇ／ｍｌ
−ＡＴ処方洗剤（ｐＨ ８）＋ＰＡＰ、５０℃、アッセイ中でのプロテアーゼ最終濃度約０．１５μｇ／ｍｌ
−Ｓｕｎ Ａｌｌ−ｉｎ−１ Ｔｕｒｂｏ Ｇｅｌ洗剤（ｐＨ ６．３）、５０℃、アッセイ中でのプロテアーゼ最終濃度約０．５μｇ／ｍｌ
方法
ＰＡＳ−３８布見本を直径５ｍｍ片に切断して、９６穴マイクロプレートの各穴に入れる。培養上清試料を希釈緩衝液で約１０μｇ／ｍｌに希釈する。Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸピペッティングロボットを利用して洗剤溶液及び希釈酵素試料を、ＰＡＳ−３８微小布見本を入れた９６穴マイクロプレートに最終容量１８０μｌ／穴となるように加える。ＭＴＰを接着剤シールで密封し、ｉＥＭＳインキュベータ／シェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れて１１５０ＲＰＭで振とうさせながら５０℃ ３０分間インキュベートする。インキュベーション後、各穴から得た洗浄液１００μＬを新たなＭＴＰへ移し替えて、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸマイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用して４０５ｎｍでの吸光度を測定する。この吸光度値は「初期液体性能値」と呼ぶ。微小布見本プレートに残った洗浄液を破棄した後、微小布見本を水２００μＬで一回すすぐ。最後に、０．１Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液１８０μＬを各穴に加えて、ＭＴＰをｉＥＭＳインキュベータ／シェーカーにおいて１１５０ＲＰＭで振とうさせながら５０℃で更に１０分間インキュベートする。インキュベーション工程後、液体１００μＬを再度新たなＭＴＰに移し替えて、４０５ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭＡＸマイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用して測定する。この吸光度値は「すすぎ液値」と呼ぶ。２つの測定値（「初期液体性能値」及び「すすぎ液値」）を足して、「全体性能値」とする。
微小布見本と洗剤を含むが酵素を含まない対照用の穴も、バックグラウンド減算処理のために含める。
洗浄性能の算出
吸光度測定値をブランク値（酵素の非存在下での微小標本のインキュベート後に得られたもの）に対して補正すると、得られた吸光度値は加水分解活性の測定である。各試料の性能指数（ＰＩ）を算出する。洗浄性能指数に関するＰＩ計算では、野生型サーモリシンをベースとするラングミュアカーブフィットを利用する。変異体のタンパク質濃度を用い、カーブフィットに基づいて性能期待値を算出する。性能実測値を性能計算値で除して、次いで、この値を、配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型サーモリシン酵素の性能値で除する。
Ｅ．洗剤：
次の２種類の洗剤を使用する。
１．Ｓｕｎ ＡＬＬ−ｉｎ−１ Ｔｕｒｂｏ Ｇｅｌ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）（２０１０年に市販されていたものを購入）
２．以下の表１．１に示す成分の、ＡＴ処方洗剤
Figure 2015534820
 ＊ＰＡＰは、ＡＴ処方にのみ添加して、ＡＴ処方洗剤（ｐＨ ８）＋ＰＡＰを調製した。
＊＊ＡＴ処方洗剤のｐＨは、クエン酸によって所望の値に調節する。安定性試験及び洗浄性能アッセイではいずれも、２１°ＧＨ水中で０．２５％の溶液を用いる。
Ｆ．タンパク質定量
培養上清からのサーモリシン変異体のタンパク質定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを用いて行う。希釈用緩衝液（１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０溶液、１０％プロピレングリコール）中において、精製野生型サーモリシンタンパク質（濃度はＡ２２２における吸光度を用いて求めた）を用いて検量線（１８ｐｐｍ〜４００ｐｐｍ）を作成する。試料を全て９６穴マイクロプレートに移し替えて、塩酸（０．３Ｍ最終濃度）で前処理して、４℃で５分間インキュベートする。オートサンプラーを用いて試料をサイズ排除クロマトグラフィーのカラムＢｉｏＳｕｉｔｅ ２５０（４μｍ ＵＨＲ、４．６×３００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））に充填する前に、試料を最終濃度２％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）によって処理する。２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ６、２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ含有）を用いて、試料をカラムから溶出させる。流速は、１４分間の測定中、０．４ｍＬ／分とする。試料の吸光度を、ＵＶ検出器を用いて２２２ｎｍで測定し、タンパク質濃度を検量線に基づいて決定する。
酵素変異体の発現を、配列番号３のアミノ酸配列を有するバチルス・サーモプロテオリティカスのサーモリシン酵素の発現と比較することにより、性能指数を判定する。
（実施例２）
バチルス・サーモプロテオリティカスサーモリシン部位評価ライブラリ（「ＳＥＬ」）の作製
サーモリシン様プロテアーゼ（ＴＬＰ）は、ペプチダーゼファミリーＭ４のファミリーメンバーであって、そのプロトタイプがサーモリシン（ＴＬＮ；ＥＣ ３．４．２４．２７）である。バチルス・サーモプロテオリティカスから分泌された中性メタロエンドペプチダーゼであるサーモリシン（ＥＣ ３．４．２４．２７）のアミノ酸配列は、Ｔｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌによって最初に報告された（Ｔｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２３８：３５〜３７頁（１９７２年））。その後、この酵素に関する遺伝子はＯ’Ｄｏｎｏｈｕｅ ｅｔ ａｌによってクローニングされて（Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅ，Ｍ．Ｊ著、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｐｒ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ Ｒｏｋｋｏ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３００：５９９〜６０３頁（１９９４年））、配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの受託番号Ｐ００８００（配列番号４）として示された。Ｔｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌとＯ’Ｄｏｎｏｈｕｅ ｅｔ ａｌにより報告されたタンパク質配列は、３７位のＡｓｎ（Ａｓｐの代わりとして）及び１１９位のＧｌｎ（Ｇｌｕの代わりとして）のみが相違することが確認されている。
バチルス・サーモプロテオリティカスのサーモリシンの完全長タンパク質（Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅ，Ｍ．Ｊ著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３００：５９９〜６０３頁（１９９４年））（配列番号４で表されるもの）は、ゲオバチルス・カルドプロテオリティカスのサーモリシン（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ ８：４８９〜４９８頁（２００４）、及びＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０５８３０３に記載されているもの）、バチルス・ステアロサーモフィルスのｎｐｒＳ遺伝子の産物（Ｎｉｓｈｉｙａ，Ｙ．及びＩｍａｎａｋａ，Ｔ．、（１９９０年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：４８６１〜４８６９頁）、及びバチルス・ステアロサーモフィルスのｎｐｒＭ遺伝子（Ｍ．Ｋｕｂｏ及びＴ．Ｉｍａｎａｋａ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４：１８８３〜１８９２頁、１９８８年）と９９％超の同一性を示す。そのため、用語「サーモリシン」、「ステアロリシン」、「バシロリシン」、「プロテイナーゼＴ」、「ＰｒＴ」、「サーモリシン様プロテアーゼ」及び「ＴＬＰ」は本明細書ではほぼ同じ意味で使用され、いずれもバチルス・サーモプロテオリティカスの中性メタロプロテアーゼ酵素を表す。
バチルス・サーモプロテオリティカスのサーモリシンの完全長タンパク質（配列番号４）に係る配列とゲオバチルス・カルドプロテオリティカス（配列番号５）に係る配列とは、１１５位におけるＳｅｒの代わりとしてのＡｌａの存在（プロ領域内）のみが相違し、これはその位置におけるコドン中の１ヌクレオチドの変化に起因する（ＴＣＧからＧＣＧ）。
部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）を作製するために、ｐＨＰＬＴ−プロテイナーゼＴプラスミドをＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）社に提供した。このプラスミドは、ゲオバチルス・カルドプロテオリティカスのサーモリシンタンパク質コード配列をコードする。完全長タンパク質アミノ酸配列（配列番号２）は、当初クローニングされた分子のプロ領域内のアミノ酸が１つ異なるものである（配列番号５）が、どちらもアミノ酸３１６個の同一の成熟タンパク質を産生する。サーモリシン成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３で表される。サーモリシンの成熟タンパク質の各部位におけるポジショナルライブラリは、ＢａｓｅＣｌｅａｒ社により作製された。
この枯草菌の発現プラスミドであるｐＨＰＬＴ−プロテイナーゼＴは、以下に示すサーモリシン発現カセット、すなわちバチルス・リケニフォルミスＬＡＴプロモーター（Ｐｌａｔ）と、レプリカーゼ遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）を包含するｐＵＢ１１０の追加のエレメント（ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１５：９３〜１０３頁、１９８６年）と、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びブレオマイシン耐性マーカー（ｂｌｅｏ）と、を含んでいる（米国特許第６，５６６，１１２号、図４を参照）。ｐＨＰＬＴ−プロテイナーゼＴのプラスミドマップを図１に示す。サーモリシン発現カセットの配列を、以下の配列番号１で表す。
配列番号１は、発現プラスミドｐＨＰＬＴ−プロテイナーゼＴ由来のサーモリシン遺伝子のヌクレオチド配列を示している（ネイティブシグナル配列は小文字で、ネイティブプロペプチドは下線を付した小文字で、そして成熟配列は大文字でそれぞれ表す）。
Figure 2015534820
配列番号２は、発現プラスミドｐＨＰＬＴ−プロテイナーゼＴ由来のサーモリシン遺伝子のアミノ酸配列を示している（ネイティブシグナル配列は小文字で、ネイティブプロペプチドは下線を付した小文字で、そして成熟配列は大文字でそれぞれ表す）。
Figure 2015534820
配列番号３は、ＰＨＰＬＴ−プロテイナーゼＴプラスミドによって産生されたサーモリシン成熟タンパク質アミノ酸配列を示している（残基数３１６）。
Figure 2015534820
配列番号４は、バチルス・サーモプロテオリティカスＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（受託番号Ｐ００８００）由来のサーモリシンの完全長アミノ酸配列を示している。
Figure 2015534820
配列番号５は、ゲオバチルス・カルドプロテオリティカス由来のサーモリシンの完全長アミノ酸配列を示している（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４年）、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ ８：４８９〜４９８頁、及びＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０５８３０３号に記載されている）。
Figure 2015534820
サーモリシン変異体の産生
３１６個の残基それぞれのポジショナルライブラリは、ＢａｓｅＣｌｅａｒ ＢＶ（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって作製された。このライブラリは、成熟タンパク質の３１６個の位置でサーモリシン変異体配列コードする発現プラスミドを含む形質転換枯草菌細胞から構成された。各変異体を、ＤＮＡシークエンシング分析によって確認した後、タンパク質活性を評価した。個々のクローンを、以下の説明通りに培養して、機能的特徴付けのために異なるサーモリシン変異体を得た。
タンパク質の発現
サーモリシン変異体を含む枯草菌形質転換体を９６穴プレートにおいてネオマイシン１０μｇ／ｍｌを含むＭＴＰトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）中で１６時間培養し、この予備培養物１０μｌを、ネオマイシン１０μｇ／ｍｌを含む培養培地（以下に説明するもの）１９０μｌを満たしたＣｏｒｎｉｎｇ ３５９９ ＭＴＰに添加した。このプレートを３７℃、湿度８０％で、３００ｒｐｍの定速回転で混合させながら２２〜２６時間インキュベートした。２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって細胞を回収し、それを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ減圧システムを利用してＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレートで濾過した。回収後、培養上清にプロピレングリコールを最終濃度が１０％となるように加えて、これらの試料をアッセイに用いた。培養培地は、リン酸緩衝液ベースで、主要炭素源としてグルコース及びマルトデキストリンを含む、半合成強化培地であり、ロバストな細胞成長のために０．２％ソイトン及び０．１４％酵母エキスを追加した。
（実施例３）
組み合わせ可能な変異の同定
生産的位置は、改善された特徴を示すコンビナトリアル変異体を製造するのに最も有用な分子内位置として記載され、この位置では、少なくとも１種の組み合わせ可能な変異が生じ得る。組み合わせ可能な変異は、コンビナトリアルな変異体を作製するのに使用することのできる、これらの分子内の置換として記載され得る。組み合わせ可能な変異は、コンビナトリアル変異体を作製するのに使用することのできる分子内の置換として記載され得る。
組み合わせ可能な変異は、この分子の所望の特性のうち少なくとも１種を改善するが、発現、活性、又は安定性のいずれかを有意に低下させないものである。サーモリシンにおける組み合わせ可能な変異は、実施例１で説明したアッセイ（Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａプロテアーゼアッセイ（活性）、ＰＡＳ−３８微小布見本アッセイ（活性）、洗剤安定性及び熱安定性アッセイ、並びにタンパク質定量（発現））で得られた性能指数（ＰＩ）値を用いて決定した。
組み合わせ可能な変異の他に、サーモリシンにおける第二の群の変異は、組み合わせ可能な活性を有する変異である。組み合わせ可能な活性を有する変異は、この分子の活性特性のうち少なくとも１種を改善し、性能指数が１．５以上であるが、発現又は安定性のＰＩ値を０．５より下に低下させないものである。
組み合わせ可能な変異は、次の基準に従って分類されている（表３．１に要約する）。
親酵素サーモリシンと比較して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更にこれらの試験のうちいずれか一つのＰＩが１．０以上である変異体（グループＡ）
親酵素サーモリシンと比較して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更にこれらの試験のうちいずれか一つのＰＩが１．２以上である変異体（グループＢ）
親酵素サーモリシンと比較して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更にこれらの試験のうちいずれか一つのＰＩが１．５以上である変異体（グループＣ）
Figure 2015534820
グループＡ、Ｂ及びＣには、更に、複数の置換に関する寛容度が異なるアミノ酸位置が含まれている。生産的位置を同定するために、各位置で許容される置換の程度を測定して、各位置に生産性スコアを割り当てた。生産性スコアは、以下に示す基準の組を用いて、グループＡ、Ｂ、又はＣに該当するそれぞれの位置での置換の百分率（試験した全変異体に基づいて算出）に照らして割り当てた。
生産的位置は、複数の置換に対してある程度の寛容度を示し、なおかつ以降に示す通りの組み合わせ可能性に関する基準の組を満たす位置と定義される。
生産的位置の生産性スコアを決定するための基準は次の通りである。
・所定の位置での置換の１５％未満がグループＡ、Ｂ又はＣに当てはまる位置に、生産性スコア「１」を与える。
・所定の位置での置換の１５％以上４０％未満がＡ、Ｂ又はＣに当てはまる位置に、生産性スコア「２」を与える。
・所定の位置での置換の４０％以上７５％未満がＡ、Ｂ又はＣに当てはまる位置に、生産性スコア「３」を与える。
・所定の位置での置換の７５％以上がＡ、Ｂ又はＣに当てはまる位置に、生産性スコア「４」を与える。
これらアミノ酸置換は、更に、置換が出現するグループ（グループＡ、Ｂ、Ｃ）に基づいて適性スコアが割り当てられるが、適性スコアは大きいほど、コンビナトリアル変異体の作製に使用するのにより適した置換を表す。適性スコアを表３．２に規定する。
Figure 2015534820
表３．３に、前述の生産性スコア「４」に該当するサーモリシンにおける生産的位置と、その位置において組み合わせ可能な置換とを示す。位置のナンバリングは、配列番号３に記載された成熟サーモリシンタンパク質に基づくものである。
Figure 2015534820
表３．４に、前述の生産性スコア「３」に該当するサーモリシンにおける生産的位置と、その位置において組み合わせ可能な置換とを示す。位置のナンバリングは、配列番号３に記載された成熟サーモリシンタンパク質に基づくものである。
Figure 2015534820
表３．５に、前述の生産性スコア「２」に該当するサーモリシンにおける生産的位置と、その位置において組み合わせ可能な置換とを示す。位置のナンバリングは、配列番号３に記載された成熟サーモリシンタンパク質に基づくものである。
Figure 2015534820
Figure 2015534820
表３．６に、前述の生産性スコア「１」に該当するサーモリシンにおける生産的位置と、その位置において組み合わせ可能な置換とを示す。位置のナンバリングは、配列番号３に記載された成熟サーモリシンタンパク質に基づくものである。
Figure 2015534820
（実施例４）
組み合わせ可能な変異及び適性スコア
実施例３に示した通り、サーモリシンにおける組み合わせ可能な変異を、実施例１で説明したアッセイで得た性能指数（ＰＩ）を用いて決定した。
組み合わせ可能な変異を、実施例３に記載の基準に照らしてグループＡ、Ｂ又はＣに割り当てた。これらの置換に、更に、置換が出現するグループ（グループＡ、Ｂ、Ｃ）に基づいて適性スコアを割り当てるが、適性スコアは大きいほど、コンビナトリアル変異体を製造する際の使用に一層適した置換を表す。適性スコアを表４．１に規定する。前記基準を満たすサーモリシンの個々の置換に関する適性スコアを以下に報告する。
Figure 2015534820
適性スコア＋＋＋＋＋の変異体：
Ｉ００１Ｌ，Ｔ００２Ａ，Ｔ００２Ｃ，Ｔ００２Ｉ，Ｔ００２Ｋ，Ｔ００２Ｍ，Ｔ００４Ｋ，Ｔ００４Ｌ，Ｔ００４Ｍ，Ｔ００４Ｙ，Ｑ０１７Ｌ，Ｎ０３７Ｋ，Ｆ０４０Ｋ，Ｆ０４０Ｌ，Ｋ０４５Ａ，Ｋ０４５Ｇ，Ｋ０４５Ｍ，Ｔ０４９Ｅ，Ｔ０４９Ｍ，Ｔ０４９Ｙ，Ｌ０５０Ｐ，Ｓ０５３Ｃ，Ｓ０５３Ｌ，Ａ０５６Ｍ，Ａ０５８Ｅ，Ａ０５８Ｌ，Ｑ０６１Ｌ，Ｆ０６３Ｃ，Ａ０６４Ｄ，Ａ０６４Ｅ，Ｓ０６５Ａ，Ｓ０６５Ｄ，Ｓ０６５Ｅ，Ｓ０６５Ｐ，Ｓ０６５Ｙ，Ｖ０８７Ｃ，Ｖ０８７Ｋ，Ｖ０８７Ｌ，Ｖ０８７Ｍ，Ｖ０８７Ｎ，Ｖ０８７Ｑ，Ｖ０８７Ｗ，Ｖ０８７Ｙ，Ｎ０９６Ｋ，Ｎ０９６Ｌ，Ｎ０９６Ｙ，Ｒ１０１Ｈ，Ｑ１０８Ｌ，Ｑ１０８Ｍ，Ｇ１０９Ｅ，Ｇ１０９Ｍ，Ｇ１０９Ｒ，Ｇ１０９Ｗ，Ｓ１１８Ａ，Ｓ１１８Ｄ，Ｓ１１８Ｍ，Ｓ１１８Ｑ，Ｓ１１８Ｒ，Ｓ１１８Ｔ，Ｓ１１８Ｖ，Ｑ１２８Ａ，Ｑ１２８Ｌ，Ｑ１２８Ｙ，Ｉ１３１Ｌ，Ｉ１３７Ｌ，Ｔ１４９Ｎ，Ｇ１５４Ａ，Ｇ１５４Ｈ，Ｇ１５４Ｋ，Ｇ１５４Ｍ，Ｇ１５４Ｙ，Ｌ１５５Ｍ，Ｉ１６４Ａ，Ｎ１８１Ｓ，Ｇ１９６Ａ，Ｇ１９６Ｗ，Ｉ１９７Ｃ，Ｓ１９８Ａ，Ｓ１９８Ｋ，Ｇ１９９Ａ，Ｇ１９９Ｙ，Ａ２０９Ｃ，Ａ２０９Ｍ，Ｈ２１６Ａ，Ｙ２１７Ｃ，Ｙ２１７Ｌ，Ｔ２２２Ｋ，Ｎ２２７Ａ，Ｉ２４４Ｌ，Ｑ２４６Ｄ，Ｖ２５６Ｎ，Ｌ２６３Ａ，Ｌ２６３Ｍ，Ｔ２７２Ｋ，Ｑ２７３Ｎ，Ｙ２７４Ｍ，Ｐ２７７Ａ，Ｐ２７７Ｄ，Ｐ２７７Ｙ，Ｌ２８４Ａ，Ｌ２８４Ｍ，Ｌ２８４Ｙ，Ａ２８６Ｋ，Ａ２８６Ｌ，Ａ２８６Ｍ，Ａ２８６Ｎ，Ａ２８６Ｙ，Ａ２８７Ｃ，Ａ２８８Ｌ，Ａ２８８Ｍ，Ｖ２８９Ａ，Ｓ２９１Ａ，Ｓ２９１Ｔ，Ｔ２９３Ａ，Ｔ２９３Ｉ，Ｔ２９３Ｋ，Ｔ２９３Ｌ，Ｔ２９３Ｍ，Ｔ２９３Ｙ，Ｌ２９５Ａ，Ｌ２９５Ｋ，Ｌ２９５Ｍ，Ｌ２９５Ｗ，Ｙ２９６Ｍ，Ｇ２９７Ｎ，Ｓ２９８Ａ，Ｓ２９８Ｇ，Ｓ２９８Ｋ，Ｓ２９８Ｍ，Ｓ２９８Ｒ，Ｔ２９９Ａ，Ｔ２９９Ｋ，Ｓ３００Ｄ，Ｓ３００Ｎ，Ｑ３０１Ｋ，Ｅ３０２Ａ，Ｖ３０３Ａ，Ｖ３０３Ｐ，Ｖ３０３Ｙ，Ａ３０４Ｅ，Ａ３０４Ｋ，Ａ３０４Ｙ，Ｓ３０５Ａ，Ｓ３０５Ｋ，Ｓ３０５Ｍ，Ｖ３０６Ｌ，Ｖ３０６Ｔ，Ａ３０９Ｃ，Ｆ３１０Ｍ，Ｄ３１１Ａ，Ｄ３１１Ｋ，Ｄ３１１Ｌ，Ｄ３１１Ｍ，Ｄ３１１Ｖ，Ｄ３１１Ｗ，Ｄ３１１Ｙ，およびＡ３１２Ｃ
適性スコア＋＋＋＋の変異体：
Ｔ００２Ｑ，Ｔ００４Ｖ，Ｖ００７Ｉ，Ｖ００９Ｉ，Ｒ０１１Ｋ，Ｉ０２０Ｌ，Ｉ０２０Ｖ，Ｓ０２５Ａ，Ｓ０２５Ｃ，Ｓ０２５Ｋ，Ｓ０２５Ｍ，Ｓ０２５Ｒ，Ｔ０２６Ｃ，Ｔ０２６Ｄ，Ｙ０２７Ｃ，Ｙ０２７Ｌ，Ｎ０３７Ｌ，Ｆ０４０Ａ，Ａ０４４Ｃ，Ｋ０４５Ｆ，Ｋ０４５Ｈ，Ｋ０４５Ｑ，Ｋ０４５Ｙ，Ｙ０４６Ｃ，Ｒ０４７Ｄ，Ｒ０４７Ｅ，Ｒ０４７Ｇ，Ｒ０４７Ｌ，Ｒ０４７Ｍ，Ｒ０４７Ｑ，Ｒ０４７Ｔ，Ｔ０４９Ｌ，Ｔ０４９Ｎ，Ｔ０４９Ｑ，Ｔ０４９Ｖ，Ｓ０５３Ａ，Ｓ０５３Ｎ，Ｓ０５３Ｖ，Ａ０５６Ｅ，Ｑ０６１Ｃ，Ｑ０６１Ｉ，Ａ０６４Ｔ，Ｓ０６５Ｌ，Ｓ０６５Ｔ，Ｓ０６５Ｗ，Ａ０７３Ｆ，Ａ０７３Ｌ，Ａ０７３Ｍ，Ａ０７３Ｗ，Ｈ０７４Ｃ，Ｈ０７４Ｆ，Ｈ０７４Ｍ，Ｈ０７４Ｎ，Ｈ０７４Ｑ，Ｈ０７４Ｗ，Ｔ０８０Ｌ，Ｔ０８０Ｎ，Ｋ０８５Ｓ，Ｎ０８６Ｄ，Ｖ０８７Ｒ，Ｖ０８７Ｔ，Ｌ０９１Ａ，Ｌ０９１Ｎ，Ｌ０９１Ｒ，Ｌ０９１Ｗ，Ｌ０９１Ｙ，Ｓ０９２Ｌ，Ｙ０９３Ｃ，Ｎ０９６Ｇ，Ｎ０９６Ｈ，Ｎ０９６Ｑ，Ｎ０９６Ｒ，Ｎ０９６Ｓ，Ｎ０９６Ｗ，Ｎ０９７Ｅ，Ｎ０９７Ｍ，Ａ０９９Ｒ，Ａ０９９Ｓ，Ｒ１０１Ｃ，Ｒ１０１Ｌ，Ｒ１０１Ｓ，Ｓ１０２Ｎ，Ｓ１０７Ｇ，Ｑ１０８Ｉ，Ｑ１０８Ｋ，Ｑ１０８Ｎ，Ｇ１０９Ｓ，Ｓ１１８Ｅ，Ｍ１２０Ｌ，Ｑ１２８Ｉ，Ｑ１２８Ｋ，Ｔ１２９Ｌ，Ｔ１２９Ｍ，Ｉ１３１Ｗ，Ｓ１３４Ｐ，Ｇ１３６Ｓ，Ｉ１３７Ｅ，Ｉ１３７Ｔ，Ｉ１３７Ｖ，Ｖ１４０Ｄ，Ｖ１４８Ａ，Ｖ１４８Ｑ，Ｔ１４９Ｄ，Ｔ１４９Ｓ，Ｔ１５２Ｇ，Ｇ１５４Ｃ，Ｇ１５４Ｎ，Ｌ１５５Ｉ，Ｎ１５９Ｓ，Ｎ１５９Ｙ，Ｉ１６４Ｃ，Ｉ１６８Ｌ，Ｉ１７１Ｇ，Ｙ１７９Ｆ，Ａ１８０Ｓ，Ｇ１８９Ａ，Ｙ１９３Ｆ，Ｇ１９６Ｈ，Ｇ１９６Ｌ，Ｇ１９６Ｙ，Ｉ１９７Ｆ，Ｓ１９８Ｍ，Ｓ１９８Ｎ，Ｓ１９８Ｒ，Ｓ１９８Ｗ，Ｓ２０１Ａ，Ａ２０９Ｇ，Ａ２０９Ｉ，Ａ２０９Ｋ，Ａ２０９Ｐ，Ａ２０９Ｒ，Ａ２０９Ｙ，Ｙ２１１Ｅ，Ｙ２１１Ｒ，Ｐ２１４Ａ，Ｐ２１４Ｒ，Ｙ２１７Ａ，Ｙ２１７Ｆ，Ｙ２１７Ｍ，Ｙ２１７Ｎ，Ｋ２１９Ａ，Ｋ２１９Ｅ，Ｋ２１９Ｒ，Ｋ２１９Ｓ，Ｒ２２０Ａ，Ｙ２２１Ａ，Ｙ２２１Ｆ，Ｙ２２１Ｇ，Ｙ２２１Ｍ，Ｔ２２２Ａ，Ｔ２２２Ｍ，Ｑ２２５Ｃ，Ｑ２２５Ｅ，Ｑ２２５Ｋ，Ｑ２２５Ｌ，Ｑ２２５Ｓ，Ｉ２３２Ｌ，Ｉ２３２Ｒ，Ｉ２３２Ｓ，Ｉ２３２Ｔ，Ｉ２３２Ｖ，Ｉ２３２Ｙ，Ｓ２３４Ａ，Ｓ２３４Ｃ，Ｇ２３５Ａ，Ｉ２３６Ｃ，Ｉ２４４Ａ，Ｉ２４４Ｍ，Ｑ２４６Ｃ，Ｖ２５６Ｓ，Ｇ２５７Ｋ，Ｇ２５７Ｒ，Ｉ２５８Ａ，Ｉ２５８Ｃ，Ｉ２５８Ｋ，Ｉ２５８Ｑ，Ｉ２５８Ｖ，Ｇ２５９Ｎ，Ｇ２５９Ｓ，Ｇ２５９Ｔ，Ｌ２６３Ｈ，Ｌ２６３Ｋ，Ｌ２６３Ｎ，Ｌ２６３Ｖ，Ｇ２６４Ａ，Ｇ２６４Ｎ，Ｇ２６４Ｐ，Ｇ２６４Ｑ，Ｇ２６４Ｓ，Ｇ２６４Ｔ，Ｋ２６５Ｎ，Ｉ２６６Ｃ，Ｉ２６６Ｍ，Ｉ２６６Ｔ，Ｉ２６６Ｖ，Ｆ２６７Ａ，Ｆ２６７Ｃ，Ｆ２６７Ｈ，Ｆ２６７Ｉ，Ｆ２６７Ｋ，Ｆ２６７Ｌ，Ｆ２６７Ｍ，Ｆ２６７Ｔ，Ｆ２６７Ｙ，Ｒ２６９Ｋ，Ａ２７０Ｇ，Ｌ２７１Ｈ，Ｔ２７２Ａ，Ｑ２７３Ｅ，Ｑ２７３Ｇ，Ｌ２７５Ｃ，Ｌ２７５Ｑ，Ｌ２７５Ｓ，Ｌ２７５Ｔ，Ｔ２７６Ａ，Ｔ２７６Ｌ，Ｔ２７６Ｖ，Ｔ２７６Ｙ，Ｐ２７７Ｅ，Ｐ２７７Ｆ，Ｐ２７７Ｇ，Ｐ２７７Ｈ，Ｐ２７７Ｎ，Ｐ２７７Ｒ，Ｐ２７７Ｖ，Ｐ２７７Ｗ，Ｓ２７９Ｇ，Ｒ２８５Ｙ，Ａ２８６Ｃ，Ａ２８６Ｑ，Ａ２８６Ｒ，Ａ２８６Ｔ，Ａ２８８Ｎ，Ｖ２８９Ｌ，Ｖ２８９Ｍ，Ｖ２８９Ｙ，Ｑ２９０Ａ，Ｑ２９０Ｈ，Ｑ２９０Ｎ，Ｓ２９１Ｖ，Ｔ２９３Ｎ，Ｔ２９３Ｖ，Ｔ２９３Ｗ，Ｄ２９４Ｎ，Ｌ２９５Ｆ，Ｌ２９５Ｇ，Ｙ２９６Ｗ，Ｇ２９７Ｄ，Ｓ２９８Ｅ，Ｓ２９８Ｎ，Ｓ２９８Ｐ，Ｔ２９９Ｎ，Ｓ３００Ａ，Ｓ３００Ｇ，Ｓ３００Ｔ，Ｑ３０１Ｍ，Ｑ３０１Ｓ，Ｑ３０１Ｔ，Ｑ３０１Ｖ，Ｅ３０２Ｄ，Ｅ３０２Ｑ，Ｖ３０３Ｇ，Ｖ３０３Ｋ，Ｖ３０３Ｌ，Ｖ３０３Ｒ，Ｖ３０３Ｗ，Ａ３０４Ｒ，Ａ３０４Ｓ，Ａ３０４Ｔ，Ａ３０４Ｗ，Ｓ３０５Ｈ，Ｓ３０５Ｔ，Ｓ３０５Ｖ，Ｖ３０６Ｉ，Ｑ３０８Ａ，Ｑ３０８Ｌ，Ｆ３１０Ｃ，Ｆ３１０Ｗ，Ｄ３１１Ｆ，Ｄ３１１Ｇ，Ｄ３１１Ｉ，Ｄ３１１Ｑ，Ｄ３１１Ｓ，Ｄ３１１Ｔ，Ｖ３１３Ｃ，Ｇ３１４Ｑ，Ｖ３１５Ｌ，Ｖ３１５Ｔ，Ｋ３１６Ａ，およびＫ３１６Ｍ
適性スコア＋＋＋の変異体：
Ｉ００１Ｋ，Ｉ００１Ｍ，Ｉ００１Ｖ，Ｔ００２Ｆ，Ｔ００２Ｌ，Ｔ００２Ｐ，Ｔ００２Ｓ，Ｔ００２Ｖ，Ｔ００２Ｗ，Ｔ００２Ｙ，Ｔ００４Ｅ，Ｓ００５Ｄ，Ｓ００５Ｎ，Ｓ００５Ｐ，Ｔ００６Ｃ，Ｒ０１１Ｉ，Ｑ０１７Ｉ，Ｑ０１７Ｗ，Ｑ０１７Ｙ，Ｓ０２５Ｄ，Ｓ０２５Ｆ，Ｔ０２６Ｋ，Ｔ０２６Ｌ，Ｔ０２６Ｒ，Ｔ０２６Ｖ，Ｔ０２６Ｙ，Ｙ０２７Ｗ，Ｑ０３１Ａ，Ｑ０３１Ｋ，Ｑ０３１Ｖ，Ｎ０３３Ｓ，Ｎ０３３Ｔ，Ｎ０３７Ｄ，Ｎ０３７Ｑ，Ｎ０３７Ｒ，Ｆ０４０Ｅ，Ｆ０４０Ｇ，Ｆ０４０Ｍ，Ｆ０４０Ｑ，Ｆ０４０Ｓ，Ｆ０４０Ｙ，Ｋ０４５Ｅ，Ｋ０４５Ｌ，Ｋ０４５Ｓ，Ｙ０４６Ｌ，Ｒ０４７Ａ，Ｒ０４７Ｃ，Ｒ０４７Ｈ，Ｒ０４７Ｋ，Ｒ０４７Ｎ，Ｔ０４８Ｅ，Ｔ０４９Ａ，Ｔ０４９Ｄ，Ｔ０４９Ｆ，Ｔ０４９Ｈ，Ｔ０４９Ｉ，Ｔ０４９Ｓ，Ｓ０５３Ｆ，Ｓ０５３Ｈ，Ｓ０５３Ｉ，Ｓ０５３Ｍ，Ｓ０５３Ｑ，Ｓ０５３Ｔ，Ｓ０５３Ｗ，Ａ０５６Ｋ，Ａ０５６Ｑ，Ａ０５６Ｖ，Ａ０５６Ｗ，Ｑ０６１Ｍ，Ｓ０６５Ｉ，Ｓ０６５Ｍ，Ｓ０６５Ｑ，Ｓ０６５Ｖ，Ｄ０７２Ｆ，Ｈ０７４Ｅ，Ｈ０７４Ｌ，Ｙ０７６Ｈ，Ｙ０７６Ｌ，Ｙ０７６Ｍ，Ｙ０７６Ｑ，Ｖ０７９Ｌ，Ｖ０７９Ｑ，Ｖ０７９Ｔ，Ｔ０８０Ｉ，Ｙ０８１Ｆ，Ｋ０８５Ｅ，Ｎ０８６Ｌ，Ｎ０８６Ｓ，Ｖ０８７Ｄ，Ｖ０８７Ｅ，Ｖ０８７Ｇ，Ｖ０８７Ｉ，Ｖ０８７Ｓ，Ｌ０９１Ｄ，Ｌ０９１Ｅ，Ｌ０９１Ｆ，Ｌ０９１Ｋ，Ｌ０９１Ｍ，Ｌ０９１Ｐ，Ｌ０９１Ｑ，Ｌ０９１Ｓ，Ｙ０９３Ｔ，Ｇ０９５Ａ，Ｇ０９５Ｄ，Ｇ０９５Ｈ，Ｇ０９５Ｍ，Ｇ０９５Ｎ，Ｇ０９５Ｓ，Ｎ０９６Ｃ，Ｎ０９６Ｄ，Ｎ０９６Ｉ，Ｎ０９６Ｖ，Ｎ０９７Ｋ，Ａ０９８Ｃ，Ａ０９８Ｅ，Ａ０９８Ｈ，Ａ０９８Ｒ，Ａ０９９Ｅ，Ａ０９９Ｋ，Ａ０９９Ｐ，Ｓ１０７Ｄ，Ｑ１０８Ｃ，Ｑ１０８Ｅ，Ｑ１０８Ｆ，Ｑ１０８Ｈ，Ｇ１２７Ｃ，Ｇ１２７Ｄ，Ｇ１２７Ｅ，Ｑ１２８Ｃ，Ｑ１２８Ｄ，Ｑ１２８Ｅ，Ｑ１２８Ｒ，Ｑ１２８Ｓ，Ｔ１２９Ｉ，Ｔ１２９Ｒ，Ｓ１３４Ａ，Ｉ１３７Ｐ，Ａ１４１Ｓ，Ｔ１４５Ａ，Ｔ１４５Ｃ，Ｔ１４５Ｅ，Ｔ１４５Ｇ，Ｔ１４５Ｍ，Ｔ１４５Ｎ，Ｔ１４５Ｑ，Ｖ１４８Ｌ，Ｖ１４８Ｎ，Ｖ１４８Ｙ，Ｔ１４９Ｍ，Ｔ１４９Ｖ，Ｙ１５１Ｋ，Ｔ１５２Ｓ，Ａ１５３Ｔ，Ｇ１５４Ｌ，Ｇ１５４Ｑ，Ｇ１５４Ｓ，Ｇ１５４Ｔ，Ｌ１５５Ｃ，Ｑ１５８Ａ，Ｑ１５８Ｋ，Ｑ１５８Ｍ，Ｑ１５８Ｎ，Ｎ１５９Ｒ，Ｎ１５９Ｗ，Ｓ１６１Ａ，Ｓ１６１Ｎ，Ｓ１６１Ｐ，Ｓ１６１Ｔ，Ｉ１６４Ｌ，Ｉ１６４Ｎ，Ｉ１６４Ｓ，Ｉ１６４Ｔ，Ｉ１６４Ｖ，Ｉ１７１Ｃ，Ｉ１７１Ｅ，Ｉ１７１Ｆ，Ｉ１７１Ｌ，Ｉ１７１Ｓ，Ｆ１７２Ｇ，Ｆ１７２Ｌ，Ｆ１７２Ｍ，Ｆ１７２Ｑ，Ｆ１７２Ｓ，Ｆ１７２Ｖ，Ｆ１７２Ｗ，Ｆ１７２Ｙ，Ｇ１７３Ａ，Ｇ１７３Ｃ，Ｔ１７４Ｃ，Ｖ１７６Ｌ，Ｖ１７６Ｎ，Ｎ１８１Ｌ，Ｇ１９６Ｄ，Ｇ１９６Ｅ，Ｇ１９６Ｔ，Ｉ１９７Ｄ，Ｉ１９７Ｋ，Ｉ１９７Ｌ，Ｉ１９７Ｔ，Ｉ１９７Ｖ，Ｉ１９７Ｗ，Ｉ１９７Ｙ，Ｓ１９８Ｃ，Ｓ１９８Ｅ，Ｓ１９８Ｆ，Ｓ１９８Ｇ，Ｓ１９８Ｈ，Ｓ１９８Ｉ，Ｓ１９８Ｐ，Ｓ１９８Ｑ，Ｓ１９８Ｔ，Ｓ１９８Ｖ，Ｇ１９９Ｃ，Ｇ１９９Ｅ，Ｇ１９９Ｆ，Ｇ１９９Ｈ，Ｇ１９９Ｑ，Ｇ１９９Ｓ，Ｇ１９９Ｔ，Ｇ１９９Ｗ，Ｍ２０５Ｌ，Ａ２０９Ｄ，Ａ２０９Ｅ，Ａ２０９Ｌ，Ａ２０９Ｓ，Ａ２０９Ｔ，Ａ２０９Ｖ，Ｙ２１１Ａ，Ｙ２１１Ｃ，Ｙ２１１Ｄ，Ｙ２１１Ｆ，Ｙ２１１Ｇ，Ｙ２１１Ｈ，Ｙ２１１Ｉ，Ｙ２１１Ｌ，Ｙ２１１Ｎ，Ｙ２１１Ｑ，Ｙ２１１Ｓ，Ｙ２１１Ｔ，Ｄ２１３Ｎ，Ｄ２１３Ｓ，Ｐ２１４Ｃ，Ｐ２１４Ｇ，Ｐ２１４Ｋ，Ｐ２１４Ｓ，Ｈ２１６Ｃ，Ｈ２１６Ｅ，Ｈ２１６Ｓ，Ｈ２１６Ｔ，Ｙ２１７Ｑ，Ｙ２１７Ｓ，Ｙ２１７Ｔ，Ｙ２１７Ｖ，Ｙ２１７Ｗ，Ｓ２１８Ｋ，Ｓ２１８Ｌ，Ｓ２１８Ｙ，Ｋ２１９Ｄ，Ｋ２１９Ｆ，Ｋ２１９Ｇ，Ｋ２１９Ｈ，Ｋ２１９Ｉ，Ｋ２１９Ｍ，Ｋ２１９Ｎ，Ｋ２１９Ｑ，Ｋ２１９Ｔ，Ｒ２２０Ｋ，Ｒ２２０Ｖ，Ｙ２２１Ｋ，Ｙ２２１Ｎ，Ｙ２２１Ｑ，Ｙ２２１Ｒ，Ｙ２２１Ｓ，Ｙ２２１Ｔ，Ｙ２２１Ｖ，Ｔ２２２Ｃ，Ｔ２２２Ｄ，Ｔ２２２Ｌ，Ｔ２２２Ｙ，Ｔ２２４Ｋ，Ｔ２２４Ｍ，Ｑ２２５Ｄ，Ｑ２２５Ｇ，Ｑ２２５Ｈ，Ｑ２２５Ｉ，Ｑ２２５Ｐ，Ｑ２２５Ｖ，Ｑ２２５Ｗ，Ｉ２３２Ｃ，Ｉ２３２Ｅ，Ｉ２３２Ｆ，Ｉ２３２Ｋ，Ｉ２３２Ｍ，Ｉ２３２Ｎ，Ｉ２３２Ｑ，Ｉ２３２Ｗ，Ｓ２３４Ｄ，Ｇ２３５Ｍ，Ｉ２３６Ｍ，Ｙ２４２Ｃ，Ｙ２４２Ｆ，Ｙ２４２Ｎ，Ｙ２４２Ｖ，Ｉ２４４Ｔ，Ｉ２４４Ｖ，Ｑ２４６Ｅ，Ｑ２４６Ｎ，Ｑ２４６Ｔ，Ｇ２４７Ａ，Ｇ２４７Ｓ，Ｔ２４９Ｋ，Ｔ２４９Ｍ，Ｔ２４９Ｎ，Ｈ２５０Ａ，Ｈ２５０Ｃ，Ｇ２５２Ｋ，Ｇ２５２Ｙ，Ｖ２５３Ｎ，Ｖ２５３Ｔ，Ｓ２５４Ａ，Ｓ２５４Ｍ，Ｓ２５４Ｒ，Ｓ２５４Ｙ，Ｖ２５５Ｌ，Ｖ２５５Ｐ，Ｖ２５６Ｌ，Ｖ２５６Ｔ，Ｇ２５７Ｃ，Ｇ２５７Ｄ，Ｇ２５７Ｅ，Ｇ２５７Ｌ，Ｇ２５７Ｎ，Ｇ２５７Ｐ，Ｇ２５７Ｑ，Ｇ２５７Ｓ，Ｇ２５７Ｔ，Ｇ２５７Ｙ，Ｉ２５８Ｅ，Ｉ２５８Ｌ，Ｉ２５８Ｍ，Ｉ２５８Ｎ，Ｇ２５９Ａ，Ｇ２５９Ｃ，Ｇ２５９Ｅ，Ｇ２５９Ｆ，Ｇ２５９Ｈ，Ｇ２５９Ｌ，Ｇ２５９Ｍ，Ｇ２５９Ｗ，Ｄ２６１Ａ，Ｄ２６１Ｎ，Ｌ２６３Ｃ，Ｌ２６３Ｉ，Ｌ２６３Ｑ，Ｌ２６３Ｔ，Ｋ２６５Ａ，Ｋ２６５Ｃ，Ｋ２６５Ｄ，Ｋ２６５Ｍ，Ｋ２６５Ｐ，Ｋ２６５Ｑ，Ｋ２６５Ｓ，Ｉ２６６Ａ，Ｉ２６６Ｆ，Ｉ２６６Ｌ，Ｉ２６６Ｓ，Ｆ２６７Ｅ，Ｆ２６７Ｇ，Ｆ２６７Ｎ，Ｆ２６７Ｓ，Ｆ２６７Ｖ，Ｆ２６７Ｗ，Ｙ２６８Ｍ，Ｙ２６８Ｑ，Ｙ２６８Ｖ，Ａ２７０Ｃ，Ａ２７０Ｆ，Ａ２７０Ｉ，Ａ２７０Ｌ，Ａ２７０Ｓ，Ｌ２７１Ａ，Ｌ２７１Ｄ，Ｌ２７１Ｆ，Ｌ２７１Ｉ，Ｔ２７２Ｅ，Ｔ２７２Ｌ，Ｔ２７２Ｖ，Ｔ２７２Ｗ，Ｑ２７３Ａ，Ｑ２７３Ｈ，Ｑ２７３Ｙ，Ｙ２７４Ｆ，Ｙ２７４Ｈ，Ｌ２７５Ｉ，Ｌ２７５Ｍ，Ｌ２７５Ｖ，Ｔ２７６Ｃ，Ｔ２７６Ｆ，Ｔ２７６Ｉ，Ｔ２７６Ｐ，Ｔ２７６Ｑ，Ｔ２７６Ｗ，Ｐ２７７Ｑ，Ｐ２７７Ｓ，Ｐ２７７Ｔ，Ｔ２７８Ｇ，Ｓ２７９Ａ，Ｓ２７９Ｄ，Ｓ２７９Ｉ，Ｓ２７９Ｌ，Ｓ２７９Ｍ，Ｓ２７９Ｎ，Ｓ２７９Ｑ，Ｓ２７９Ｔ，Ｎ２８０Ａ，Ｎ２８０Ｃ，Ｎ２８０Ｄ，Ｎ２８０Ｅ，Ｓ２８２Ｋ，Ｓ２８２Ｎ，Ｌ２８４Ｖ，Ｌ２８４Ｗ，Ｒ２８５Ｋ，Ａ２８６Ｄ，Ａ２８６Ｅ，Ａ２８６Ｆ，Ａ２８６Ｇ，Ａ２８６Ｈ，Ａ２８６Ｉ，Ａ２８６Ｓ，Ａ２８７Ｉ，Ａ２８７Ｌ，Ａ２８７Ｎ，Ａ２８７Ｖ，Ａ２８７Ｙ，Ａ２８８Ｃ，Ａ２８８Ｉ，Ａ２８８Ｓ，Ａ２８８Ｔ，Ａ２８８Ｖ，Ｖ２８９Ｃ，Ｖ２８９Ｅ，Ｖ２８９Ｆ，Ｖ２８９Ｇ，Ｖ２８９Ｉ，Ｖ２８９Ｎ，Ｖ２８９Ｓ，Ｖ２８９Ｗ，Ｑ２９０Ｃ，Ｑ２９０Ｄ，Ｑ２９０Ｆ，Ｑ２９０Ｇ，Ｑ２９０Ｌ，Ｑ２９０Ｗ，Ｓ２９１Ｅ，Ｔ２９３Ｃ，Ｔ２９３Ｅ，Ｔ２９３Ｆ，Ｔ２９３Ｇ，Ｔ２９３Ｈ，Ｔ２９３Ｑ，Ｔ２９３Ｓ，Ｌ２９５Ｃ，Ｌ２９５Ｉ，Ｌ２９５Ｎ，Ｙ２９６Ｎ，Ｇ２９７Ａ，Ｇ２９７Ｍ，Ｇ２９７Ｒ，Ｇ２９７Ｙ，Ｓ２９８Ｃ，Ｓ２９８Ｔ，Ｓ２９８Ｗ，Ｓ２９８Ｙ，Ｔ２９９Ｃ，Ｔ２９９Ｆ，Ｔ２９９Ｌ，Ｔ２９９Ｍ，Ｔ２９９Ｒ，Ｔ２９９Ｗ，Ｓ３００Ｃ，Ｓ３００Ｋ，Ｓ３００Ｍ，Ｓ３００Ｒ，Ｓ３００Ｙ，Ｑ３０１Ｅ，Ｑ３０１Ｈ，Ｑ３０１Ｐ，Ｑ３０１Ｒ，Ｖ３０３Ｃ，Ｖ３０３Ｈ，Ａ３０４Ｃ，Ａ３０４Ｄ，Ａ３０４Ｌ，Ａ３０４Ｎ，Ｓ３０５Ｇ，Ｓ３０５Ｉ，Ｓ３０５Ｌ，Ｓ３０５Ｎ，Ｓ３０５Ｗ，Ｓ３０５Ｙ，Ｖ３０６Ａ，Ｖ３０６Ｓ，Ｋ３０７Ａ，Ｋ３０７Ｃ，Ｋ３０７Ｇ，Ｋ３０７Ｉ，Ｋ３０７Ｍ，Ｋ３０７Ｎ，Ｋ３０７Ｑ，Ｋ３０７Ｒ，Ｋ３０７Ｗ，Ｋ３０７Ｙ，Ｑ３０８Ｃ，Ｑ３０８Ｄ，Ｑ３０８Ｆ，Ｑ３０８Ｇ，Ｑ３０８Ｉ，Ｑ３０８Ｍ，Ａ３０９Ｇ，Ａ３０９Ｓ，Ｄ３１１Ｃ，Ｄ３１１Ｅ，Ａ３１２Ｇ，Ａ３１２Ｍ，Ａ３１２Ｖ，Ｖ３１３Ｔ，Ｇ３１４Ａ，Ｇ３１４Ｅ，Ｇ３１４Ｈ，Ｇ３１４Ｍ，Ｇ３１４Ｓ，Ｇ３１４Ｗ，Ｖ３１５Ａ，Ｖ３１５Ｃ，Ｖ３１５Ｉ，Ｖ３１５Ｍ，Ｋ３１６Ｄ，Ｋ３１６Ｅ，Ｋ３１６Ｆ，Ｋ３１６Ｇ，Ｋ３１６Ｈ，Ｋ３１６Ｌ，Ｋ３１６Ｎ，Ｋ３１６Ｐ，Ｋ３１６Ｑ，Ｋ３１６Ｒ，Ｋ３１６Ｓ，Ｋ３１６Ｖ，Ｋ３１６Ｗ，およびＫ３１６Ｙ
適性スコア＋＋の変異体：
Ｉ００１Ｃ，Ｔ００４Ｒ，Ｔ００６Ｖ，Ｑ０１７Ｔ，Ｎ０１９Ｋ，Ｎ０１９Ｓ，Ｔ０２３Ｆ，Ｔ０２３Ｗ，Ｙ０２４Ｗ，Ｔ０２６Ｆ，Ｔ０２６Ｇ，Ｔ０２６Ｈ，Ｔ０２６Ｉ，Ｔ０２６Ｍ，Ｙ０２７Ｍ，Ｙ０２７Ｖ，Ｑ０３１Ｃ，Ｑ０３１Ｙ，Ｎ０３３Ａ，Ｎ０３３Ｃ，Ｎ０３３Ｌ，Ｎ０３３Ｍ，Ｙ０４６Ｈ，Ｙ０４６Ｎ，Ｔ０４８Ｄ，Ｔ０４９Ｗ，Ａ０５８Ｃ，Ａ０５８Ｖ，Ｑ０６１Ｆ，Ｑ０６１Ｖ，Ａ０６４Ｈ，Ａ０６４Ｑ，Ｄ０７２Ｗ，Ａ０７３Ｉ，Ｈ０７４Ｖ，Ｙ０７６Ｔ，Ｖ０７９Ｓ，Ｔ０８０Ａ，Ｋ０８５Ａ，Ｋ０８５Ｌ，Ｋ０８５Ｎ，Ｋ０８５Ｒ，Ｎ０８６Ａ，Ｎ０８６Ｃ，Ｎ０８６Ｅ，Ｎ０８６Ｆ，Ｎ０８６Ｇ，Ｎ０８６Ｋ，Ｎ０８９Ｈ，Ｎ０９６Ｆ，Ｎ０９６Ｔ，Ｎ０９７Ｃ，Ｎ０９７Ｒ，Ｎ０９７Ｓ，Ｎ０９７Ｙ，Ａ０９８Ｋ，Ａ０９８Ｖ，Ｉ１００Ｌ，Ｉ１００Ｖ，Ｒ１０１Ｔ，Ｓ１０２Ｇ，Ｓ１０３Ｔ，Ｓ１０７Ａ，Ｑ１０８Ｄ，Ｇ１１７Ｈ，Ｓ１１８Ｇ，Ｑ１２８Ｖ，Ｔ１２９Ｙ，Ｇ１３６Ａ，Ａ１４１Ｇ，Ｌ１４４Ｔ，Ｖ１４８Ｍ，Ｄ１５０Ｓ，Ｙ１５１Ｇ，Ｙ１５１Ｈ，Ｙ１５１Ｓ，Ｙ１５１Ｗ，Ｇ１５４Ｄ，Ｇ１５４Ｉ，Ｇ１５４Ｗ，Ｉ１５６Ｌ，Ｉ１５６Ｑ，Ｑ１５８Ｓ，Ｎ１５９Ａ，Ｎ１５９Ｃ，Ｎ１５９Ｇ，Ｎ１５９Ｍ，Ｎ１５９Ｔ，Ｅ１６０Ｑ，Ｉ１６８Ａ，Ｉ１６８Ｍ，Ｉ１６８Ｔ，Ｆ１７２Ｄ，Ｆ１７２Ｈ，Ｌ１７５Ｓ，Ｖ１７６Ｃ，Ｆ１７８Ｈ，Ｆ１７８Ｙ，Ｙ１７９Ａ，Ｙ１７９Ｄ，Ｙ１７９Ｈ，Ｙ１７９Ｍ，Ｙ１７９Ｎ，Ｙ１７９Ｑ，Ｙ１７９Ｓ，Ｙ１７９Ｔ，Ｙ１７９Ｗ，Ａ１８０Ｅ，Ａ１８０Ｇ，Ａ１８０Ｋ，Ａ１８０Ｔ，Ｎ１８１Ｇ，Ｎ１８１Ｋ，Ｎ１８１Ｍ，Ｎ１８１Ｔ，Ｋ１８２Ａ，Ｋ１８２Ｗ，Ｎ１８３Ｓ，Ｄ１８５Ｅ，Ｅ１８７Ｄ，Ｉ１８８Ｖ，Ｇ１９６Ｋ，Ｇ１９６Ｒ，Ｇ１９６Ｖ，Ｉ１９７Ｅ，Ｉ１９７Ｑ，Ｉ１９７Ｒ，Ｇ１９９Ｌ，Ｓ２０１Ｃ，Ｍ２０５Ｑ，Ｓ２０６Ｍ，Ｓ２０６Ｒ，Ｄ２０７Ｈ，Ｄ２０７Ｎ，Ｋ２１０Ｉ，Ｋ２１０Ｌ，Ｋ２１０Ｖ，Ｇ２１２Ａ，Ｇ２１２Ｄ，Ｇ２１２Ｑ，Ｄ２１３Ａ，Ｄ２１３Ｇ，Ｄ２１３Ｗ，Ｐ２１４Ｎ，Ｙ２１７Ｇ，Ｓ２１８Ｇ，Ｓ２１８Ｔ，Ｓ２１８Ｖ，Ｔ２２２Ｉ，Ｔ２２２Ｖ，Ｇ２２３Ｄ，Ｇ２２３Ｋ，Ｔ２２４Ｅ，Ｔ２２４Ｈ，Ｑ２２５Ａ，Ｑ２２５Ｍ，Ｑ２２５Ｒ，Ｖ２３０Ａ，Ｉ２３２Ｇ，Ｓ２３４Ｎ，Ｇ２３５Ｃ，Ｇ２３５Ｑ，Ｇ２３５Ｓ，Ｉ２３７Ｆ，Ｉ２３７Ｍ，Ｉ２４４Ｆ，Ｇ２４８Ａ，Ｇ２４８Ｅ，Ｇ２４８Ｓ，Ｔ２４９Ｐ，Ｙ２５１Ｍ，Ｇ２５２Ａ，Ｇ２５２Ｓ，Ｇ２５２Ｔ，Ｇ２５２Ｗ，Ｖ２５３Ｍ，Ｖ２５３Ｑ，Ｓ２５４Ｎ，Ｓ２５４Ｖ，Ｓ２５４Ｗ，Ｖ２５５Ｍ，Ｖ２５５Ｎ，Ｖ２５６Ａ，Ｖ２５６Ｄ，Ｖ２５６Ｆ，Ｖ２５６Ｇ，Ｖ２５６Ｈ，Ｖ２５６Ｒ，Ｉ２５８Ｒ，Ｉ２５８Ｓ，Ｇ２５９Ｋ，Ｇ２５９Ｒ，Ｒ２６０Ａ，Ｒ２６０Ｎ，Ｄ２６１Ｇ，Ｄ２６１Ｈ，Ｄ２６１Ｉ，Ｄ２６１Ｓ，Ｇ２６４Ｃ，Ｇ２６４Ｒ，Ｋ２６５Ｇ，Ｋ２６５Ｉ，Ｋ２６５Ｌ，Ｋ２６５Ｒ，Ｙ２６８Ｋ，Ｌ２７１Ｎ，Ｌ２７１Ｙ，Ｔ２７２Ｃ，Ｔ２７２Ｆ，Ｔ２７２Ｎ，Ｔ２７２Ｑ，Ｙ２７４Ｃ，Ｙ２７４Ｑ，Ｙ２７４Ｔ，Ｔ２７６Ｈ，Ｔ２７８Ｃ，Ｔ２７８Ｈ，Ｔ２７８Ｍ，Ｔ２７８Ｎ，Ｔ２７８Ｑ，Ｔ２７８Ｓ，Ｎ２８０Ｈ，Ｎ２８０Ｔ，Ｓ２８２Ａ，Ｓ２８２Ｈ，Ｓ２８２Ｌ，Ｓ２８２Ｍ，Ｓ２８２Ｔ，Ｑ２８３Ｓ，Ａ２８６Ｐ，Ａ２８７Ｄ，Ａ２８８Ｙ，Ｖ２８９Ｒ，Ｖ２８９Ｔ，Ｑ２９０Ｒ，Ｑ２９０Ｔ，Ｑ２９０Ｖ，Ｄ２９４Ｑ，Ｌ２９５Ｔ，Ｌ２９５Ｖ，Ｙ２９６Ｈ，Ｇ２９７Ｃ，Ｇ２９７Ｆ，Ｇ２９７Ｋ，Ｇ２９７Ｔ，Ｔ２９９Ｄ，Ｔ２９９Ｑ，Ｓ３００Ｈ，Ｓ３００Ｐ，Ｓ３００Ｖ，Ｓ３００Ｗ，Ｑ３０１Ｃ，Ｑ３０１Ｆ，Ｑ３０１Ｇ，Ｑ３０１Ｗ，Ｅ３０２Ｇ，Ｅ３０２Ｔ，Ｅ３０２Ｖ，Ｓ３０５Ｑ，Ｖ３０６Ｆ，Ｋ３０７Ｈ，Ｑ３０８Ｒ，Ｑ３０８Ｖ，Ｑ３０８Ｗ，Ｑ３０８Ｙ，Ａ３０９Ｔ，Ａ３０９Ｖ，Ａ３１２Ｔ，およびＶ３１３Ｉ
適性スコア＋の変異体：
Ｉ００１Ａ，Ｉ００１Ｈ，Ｉ００１Ｗ，Ｉ００１Ｙ，Ｇ００３Ｙ，Ｔ００４Ａ，Ｔ００４Ｎ，Ｓ００５Ｈ，Ｓ００５Ｌ，Ｖ００７Ｌ，Ｖ００９Ｌ，Ｖ００９Ｔ，Ｒ０１１Ｙ，Ｑ０１７Ｃ，Ｑ０１７Ｒ，Ｑ０１７Ｖ，Ｎ０１９Ｌ，Ｎ０１９Ｙ，Ｔ０２６Ｗ，Ｙ０２７Ａ，Ｑ０３１Ｉ，Ｎ０３３Ｋ，Ｆ０４０Ｗ，Ｓ０５３Ｋ，Ｓ０５３Ｒ，Ａ０５６Ｈ，Ａ０５６Ｉ，Ａ０５６Ｙ，Ｄ０５７Ｋ，Ａ０５８Ｎ，Ａ０５８Ｙ，Ｑ０６１Ｒ，Ｑ０６１Ｗ，Ｆ０６３Ｙ，Ｙ０７５Ａ，Ｖ０７９Ａ，Ｖ０７９Ｎ，Ｔ０８０Ｄ，Ｎ０８６Ｙ，Ｖ０８７Ｐ，Ｎ０８９Ｌ，Ｎ０８９Ｍ，Ｄ０９４Ｔ，Ａ０９８Ｙ，Ｖ１０４Ａ，Ｓ１０７Ｋ，Ｓ１０７Ｙ，Ｑ１０８Ａ，Ｇ１０９Ａ，Ｇ１０９Ｌ，Ｙ１１０Ｌ，Ｓ１１８Ｃ，Ｔ１２９Ｅ，Ｉ１３１Ｙ，Ｇ１３５Ａ，Ｉ１３７Ａ，Ａ１４１Ｃ，Ｔ１４９Ａ，Ｔ１４９Ｌ，Ｄ１５０Ａ，Ｄ１５０Ｆ，Ｄ１５０Ｋ，Ｄ１５０Ｎ，Ｄ１５０Ｑ，Ｄ１５０Ｔ，Ｄ１５０Ｖ，Ｔ１５２Ｌ，Ｔ１５２Ｍ，Ｉ１５６Ｍ，Ｉ１５６Ｔ，Ｑ１５８Ｌ，Ｑ１５８Ｒ，Ｑ１５８Ｙ，Ｅ１６０Ｌ，Ｅ１６０Ｙ，Ｔ１７４Ａ，Ｌ１７５Ｈ，Ｎ１８１Ａ，Ｋ１８２Ｌ，Ｅ１８７Ｌ，Ｉ１８８Ｌ，Ｉ１９７Ａ，Ｉ１９７Ｈ，Ｉ１９７Ｎ，Ｍ２０５Ａ，Ｍ２０５Ｖ，Ｓ２０６Ａ，Ｓ２０６Ｃ，Ｓ２０６Ｋ，Ｓ２０６Ｌ，Ｄ２０７Ａ，Ｇ２１２Ｙ，Ｄ２１３Ｌ，Ｈ２１６Ｒ，Ｓ２１８Ｆ，Ｔ２２４Ｆ，Ｔ２２４Ｌ，Ｔ２２４Ｐ，Ｔ２２４Ｑ，Ｔ２２４Ｖ，Ｔ２２４Ｙ，Ｎ２２７Ｄ，Ｎ２２７Ｌ，Ｎ２２７Ｙ，Ｉ２３６Ａ，Ｉ２３７Ｎ，Ｎ２３８Ｌ，Ｎ２３８Ｍ，Ｋ２３９Ａ，Ａ２４１Ｌ，Ａ２４１Ｓ，Ｑ２４６Ｌ，Ｔ２４９Ｌ，Ｔ２４９Ｙ，Ｈ２５０Ｋ，Ｈ２５０Ｍ，Ｈ２５０Ｎ，Ｈ２５０Ｐ，Ｈ２５０Ｑ，Ｈ２５０Ｒ，Ｈ２５０Ｖ，Ｈ２５０Ｙ，Ｖ２５３Ｉ，Ｖ２５３Ｒ，Ｖ２５３Ｙ，Ｓ２５４Ｋ，Ｓ２５４Ｌ，Ｖ２５５Ａ，Ｖ２５５Ｙ，Ｖ２５６Ｋ，Ｄ２６１Ｐ，Ｄ２６１Ｖ，Ｄ２６１Ｗ，Ｋ２６２Ａ，Ｙ２６８Ａ，Ｙ２６８Ｓ，Ｒ２６９Ｖ，Ｔ２７２Ｐ，Ｔ２７２Ｙ，Ｑ２７３Ｃ，Ｑ２７３Ｓ，Ｑ２７３Ｗ，Ｙ２７４Ａ，Ｔ２７８Ｋ，Ｔ２７８Ｒ，Ｔ２７８Ｙ，Ｎ２８０Ｇ，Ｎ２８０Ｑ，Ｓ２８２Ｒ，Ｑ２８３Ｋ，Ｑ２８３Ｌ，Ｑ２８３Ｐ，Ｑ２８３Ｒ，Ｑ２８３Ｗ，Ｑ２８３Ｙ，Ａ２８７Ｋ，Ａ２８７Ｒ，Ａ２８７Ｔ，Ｑ２９０Ｙ，Ｓ２９１Ｉ，Ｓ２９１Ｌ，Ｓ２９１Ｍ，Ｓ２９１Ｎ，Ｄ２９４Ａ，Ｄ２９４Ｖ，Ｙ２９６Ｌ，Ｙ２９６Ｒ，Ｔ２９９Ｐ，Ｓ３００Ｉ，Ｓ３００Ｌ，Ｑ３０１Ｌ，Ｅ３０２Ｋ，Ｅ３０２Ｌ，Ｆ３１０Ａ，Ａ３１２Ｌ，Ａ３１２Ｎ，Ａ３１２Ｒ，Ｖ３１３Ａ，Ｖ３１３Ｇ，およびＶ３１３Ｌ
Figure 2015534820
Figure 2015534820
選択された生産的位置でのサーモリシン変異体を更に挙げる。位置のナンバリングは、配列番号３に記載された成熟サーモリシンタンパク質に基づくものである。Ｔ００２Ｉ，Ｔ００２Ｍ，Ｔ０４８Ｅ，Ａ０５８Ｌ，Ｆ０６３Ｃ，Ｖ０８７Ｌ，Ｎ０９６Ｈ，Ｑ１２８Ｙ，Ｙ１５１Ｒ，Ａ１８０Ｅ，Ｓ１９８Ａ，Ｉ２４４Ｔ，Ｑ２７３Ｎ，Ｐ２７７Ｒ，Ｔ２７８Ｒ，Ｑ２８３Ｅ，Ｔ２９３Ｌ，Ｔ２９３Ｎ，Ｌ２９５Ｆ，Ｓ２９８Ａ，Ｑ３０１Ｉ，Ｎ０１９Ｄ，Ｓ０２５Ａ，Ｔ０２６Ｒ，Ｔ０４９Ｋ，Ｔ０４９Ｑ，Ｆ０６３Ｌ，Ｓ０６５Ａ，Ｓ０６５Ｔ，Ｌ０９１Ｍ，Ｎ０９６Ｑ，Ｎ０９６Ｒ，Ｎ０９６Ｙ，Ｎ０９７Ｋ，Ｒ１０１Ｍ，Ｇ１０９Ａ，Ｓ１１８Ａ，Ｉ１３１Ｌ，Ｖ１４０Ｄ，Ｑ１５８Ａ，Ｎ１５９Ｅ，Ｎ１５９Ｋ，Ｌ１７５Ｖ，Ａ１８０Ｒ，Ｇ１９６Ｈ，Ｇ１９６Ｔ，Ｇ１９６Ｙ，Ｋ２１９Ｓ，Ｑ２２５Ｅ，Ｉ２３２Ｒ，Ｉ２４４Ｌ，Ｑ２４６Ｄ，Ｄ２６１Ｎ，Ｐ２７７Ｇ，Ｔ２９３Ｙ，Ｓ３００Ｇ，Ｑ３０１Ｆ，Ｑ３０１Ｍ，Ｖ３０３Ｒ，Ｓ３０５Ａ，Ｄ３１１Ａ。
（実施例５）
サーモリシン同族体の同定
Ａ．プロテアーゼのＭＥＲＯＰＳデータベースにおける関連分子の同定
バチルス・サーモプロテオリティカスのサーモリシンは、ＭＥＲＯＰＳプロテアーゼデータベースではＭ４ファミリー（Ｍはメタロプロテアーゼを表す）に分類されている（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）。サーモリシンは、Ｍ４ファミリー（サーモリシンファミリー）メタロプロテアーゼのプロトタイプであって、クランＭＡの典型例である。サーモリシンは更に、第三の亜鉛配位子がグルタミン酸塩であることから、Ｇｌｕ−Ｚｉｎｃｉｎとしても知られるサブクランＭＡ（Ｅ）にも分類される。バチルス・サーモプロテオリティカスのサーモリシンには、Ｍｅｒｏｐｓの受託番号ＭＥＲ００１０２６が割り当てられた。
ＭＥＲＯＰＳデータベースは、ペプチダーゼ（プロテアーゼ）の階層的な構造による分類を利用している。この場合、各ペプチダーゼは、アミノ酸配列における統計的に有意な類似性に基づいてファミリーに割り当てられ、相同であると考えられるファミリーは同じクランに分類される。分子構造及び相同性によるペプチドの分類法は、アミノ酸配列及び三次元構造に関するデータが大量に入手できるかどうかに掛かっていたが、それが１９９０年代に実現できたことで開発に至った。１９９３年には、Ｒａｗｌｉｎｇｓ及びＢａｒｒｅｔｔにより、個々のペプチダーゼをファミリーに割り当てて、そのファミリーを更にクランに分類するシステムが示された（Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｎ．Ｄ．＆ Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．、（１９９３年）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９０，２０５〜２１８頁）。
Ｍ４ファミリーに属するペプチダーゼはいずれも、一つの触媒亜鉛イオンと結合している。多くの他のメタロペプチダーゼファミリーにはＨＥＸＸＨモチーフが存在しており、この場合、ヒスチジンは亜鉛の配位子であり、グルタミン酸塩は活性部位残基である。このファミリーのファミリーメンバーの大部分は、中性ｐＨにおいてエンドペプチダーゼ活性を有し、ほぼ例外なく細菌由来であり、しかもカルシウムイオンの結合によって熱安定性が生じる。タンパク質及びペプチドは、選択的にＸａａ＋Ｙａａの開裂によって分解する。ここで、Ｘａａは疎水性残基であり、そしてＹａａはロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）又はバリン（Ｖａｌ）である。サーモリシンは、ドメイン間に活性部位を有する２つのドメイン構造を有する。Ｎ末端ドメインは、２本のヘリックスを有する明白な６本鎖のβシートを含み、そのうち１本のヘリックスがＨＥＸＸＨ亜鉛結合モチーフを有する。Ｃ末端ドメインは、このファミリー固有のものであり、主にらせん状で、第三の亜鉛配位子を有する。
ＭＥＲＯＰＳデータベース（バージョン９．５）上での成熟サーモリシンタンパク質（配列番号３）の相同体に関するＢＬＡＳＴ検索により、以下に示される結果を得た（表５．１）。各酵素を、ＭＥＲＯＰＳデータベースの固有の受託番号及び遺伝子の起源によって一覧表にし、プログラムで算出された同一性（％）を示す。
Figure 2015534820
Figure 2015534820
Figure 2015534820
系統樹の作製など、ＭＥＲＯＰＳデータベースにおける多様なファミリーのファミリーメンバーの更なる解析も実行可能である。４２４のファミリーメンバーからなるＭ４ファミリーの系統樹（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｆａｍｗｒａｐ／ｆａｍｃａｒｄｓ／ｔｒｅｅｓ／ｍ４＿ｔｒｅｅ．ｈｔｍ）の構成を以下に示す（図２Ａ〜２Ｃ）。
上記図２に示すＭ４ファミリーの系統樹における重要なアミノ酸配列及び構成。
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１スチグマテラ・オーランチアカ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８６４０４）
Ｐ＿プロタンパク質〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
２（スチグマテラ・オーランチアカ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８６４８８）
３（ミクソコッカス・ザンサス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０６８０４５）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ〜ＰＰＣ
４（シュードアルテロモナス・チュニカータ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０６３１５６）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
５ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・エバミティリス）グリセリシン（ＭＥＲ０２８５６１）
６ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・スビセウス）グリセリシン（ＭＥＲ１４４０００）
７ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・ビリドクロモ）ゲネスグリセリシン（ＭＥＲ２２９６６８）
８ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・セリカラー）グリセリシン（ＭＥＲ０１２２７５）
９ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・スカビエイー）グリセリシン（ＭＥＲ２００７７６）
１０ Ｍ０４．０１７（クリベラ・フラビダ）グリセリシン（ＭＥＲ０７６５７７）
１１ Ｍ０４．０１７（ジャニバクター種ＨＴＣＣ２６４９）グリセリシン（ＭＥＲ１１９３７０）
１２ Ｍ０４．０１７（ノカルジオイデス種ＪＳ６１４）グリセリシン（ＭＥＲ０７５５７５）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１３ Ｍ０４．０１７（スチグマテラ・オーランチアカ）グリセリシン（ＭＥＲ０８６４９７）
１４ Ｍ０４．０１７（ザントモナス・カンペストリス）グリセリシン（ＭＥＲ０７０１９３）
１５ Ｍ０４．０１７（かいよう病菌）グリセリシン（ＸＡＣ０４６５タンパク質）（ＭＥＲ０１９５６０）
１６ Ｍ０４．０１７（イネ白葉枯病菌）グリセリシン（ＭＥＲ１１３８７０）
１７ Ｍ０４．０１７（ミクロモノスポラ種Ｌ５）グリセリシン（ＭＥＲ２３０６３５）
１８ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・エバミティリス）グリセリシン（ＳＡＶ１０３７タンパク質）（ＭＥＲ０２８５６３）
１９ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・スビセウス）グリセリシン（ＭＥＲ１８７８２７）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
２０ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス）グリセリシン（ＭＥＲ１３７０８０）
２１ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス種ＳＰＢ７４）グリセリシン（ＭＥＲ１６３９６５）
２２ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・アルブス）グリセリシン（ＭＥＲ１８７８２３）
２３ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・エバミティリス）グリセリシン（ＳＡＶ２７９５タンパク質）（ＭＥＲ０２８５６６）
２４ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・スビセウス）グリセリシン（ＭＥＲ１３７１７５）
２５ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・ガーナエンシス）グリセリシン（ＭＥＲ１８７８１７）
２６ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・セリカラー）グリセリシン（ＭＥＲ０１９３５１）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
２７ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・スカビエイー）グリセリシン（ＭＥＲ２００９６９）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜Ｐ＿プロタンパク質
２８ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス種ＳＰＢ７４）グリセリシン（ＭＥＲ１３７９６４）
２９ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・スビセウス）グリセリシン（ＭＥＲ１８７８２６）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜Ｈｅ＿ＰＩＧ
３０ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・エバミティリス）グリセリシン（ＭＥＲ０２８５６７）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３１ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・セプタタス）グリセリシン（ＭＥＲ１０８９３１）
３２ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・スカビエイー）グリセリシン（ＭＥＲ２００８７８）
３３ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス種Ｍｇ１）グリセリシン（ＭＥＲ１８０６８３）
３４ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・スビセウス）グリセリシン（ＭＥＲ１８７８２５）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜Ｐ＿プロタンパク質
３５ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・セリカラー）グリセリシン（ＭＥＲ０１１０８５）
３６ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・スカビエイー）グリセリシン（ＭＥＲ２００９６８）
３７ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・ガーナエンシス）グリセリシン（ＭＥＲ１８７８１６）
３８ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・グリセウス）グリセリシン（ＭＥＲ００４７４４）
３９ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・フィラメントサス）グリセリシン（ＭＥＲ１８７８２１）
４０ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・エバミティリス）グリセリシン（ＭＥＲ０２８５６５）
４１ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス種Ｍｇ１）グリセリシン（ＭＥＲ１６３４１６）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４２ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・グリセウス）グリセリシン（ＭＥＲ１２１３９３）
４３ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・フィラメントサス）グリセリシン（ＭＥＲ１８７８２０）
４４ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス種ＴＨ−３）グリセリシン（ＭＥＲ１６９９６４）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４５ Ｍ０４．０１７（ジャニバクター種ＨＴＣＣ２６４９）グリセリシン（ＭＥＲ１０９４４３）
４６ Ｍ０４．０１７（ジャニバクター種ＨＴＣＣ２６４９）グリセリシン（ＭＥＲ１０９４１７）
４７ Ｍ０４．０１７（クリベラ・フラビダ）グリセリシン（ＭＥＲ０９６４９７）
４８ Ｍ０４．０１７（ストレプトマイセス・エバミティリス）グリセリシン（ＭＥＲ０２８５６４）
４９ Ｍ０４．０２２（類鼻疽菌）ＺｍｐＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０２９９６１）
５０ Ｍ０４．０２２（鼻疽菌）ＺｍｐＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０４０１４２）
５１ Ｍ０４．０２２（バークホルデリア・タイランデンシス）ＺｍｐＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０５８４７７）
５２ Ｍ０４．０２２（バークホルデリア・オクラホメンシス）ＺｍｐＡペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７６６）
５３ Ｍ０４．０２２（バークホルデリア・セノセパシア）ＺｍｐＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０５０８０４）
５４ Ｍ０４．０２２（セパシア菌）ＺｍｐＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０２８６２２）
５５ Ｍ０４．０２２（バークホルデリア・アンビファリア）ＺｍｐＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０５５６９７）
５６ Ｍ０４．０２２（バークホルデリア種３８３）ＺｍｐＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０５６８１６）
５７ Ｍ０４．０２２（バークホルデリア・ウボネンシス）ＺｍｐＡペプチダーゼ．（ＭＥＲ１６６２６６）
５８（デハロコッコイデス種ＶＳ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１０９８８３）
５９（未同定真正細菌ＳＣＢ４９）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３７２２９）
６０（クロセイバクター・アトランチカス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１８３４０）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ｆｎ３
６１（フラボバクテリウム・ジョンソニアエ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０６２８３２）
６２（フラボバクテリウムカラムナーレ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６２０）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
６３（クロセイバクター・アトランチカス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１０９８４７）
６４（クリセオバクテリウム・グレウム）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７７６）
６５（コルディア・アルジシダ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１６６４０３）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＭＡＭ
６６（ミクロシラ・マリナ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６２４）
６７（クロセイバクター・アトランチカス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１７３８８）
６８（クロセイバクター・アトランチカス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３８８０２）
６９（パエニバチルス・ラルバエ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７６５）
７０ Ｍ０４．００１（パエニバチルス・ラルバエ）サーモリシン（ＭＥＲ１６８８８２）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
７１（パエニバチルス・ポリミキサ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ００１０３３）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
７２ Ｍ０４．００１（ブレビバチルス・ブレビス）サーモリシン（ＭＥＲ００１０２８）
７３ Ｍ０４．００１（ブレビバチルス・ブレビス）サーモリシン（ｎｐｒタンパク質）（ＭＥＲ１６９６７７）
７４ Ｍ０４．００１（バチルス・シュードマイコイデス）サーモリシン（ＭＥＲ１８７７９０）
７５ Ｍ０４．００１（バチルス・マイコイデス）サーモリシン（ＭＥＲ１８７７９４）
７６ Ｍ０４．００１（セレウス菌）サーモリシン（ＭＥＲ０６１８１７）
７７ Ｍ０４．００１（セレウス菌）サーモリシン（ＭＥＲ１８７８０８）
７８ Ｍ０４．００１（バチルス・ウェイヘンステファネンシス）サーモリシン（ＭＥＲ１０９３８９）
７９ Ｍ０４．００１（バチルス・マイコイデス）サーモリシン（ＭＥＲ１８７７９８）
８０ Ｍ０４．００１（セレウス菌）サーモリシン（ＭＥＲ００１０３０）
８１ Ｍ０４．００１（バチルス・チューリンゲンシス）サーモリシン（ＭＥＲ００３１８１）
８２ Ｍ０４．００１（バチルス・シュードマイコイデス）サーモリシン（ＭＥＲ１７６７０９）
８３ Ｍ０４．００１（乳酸桿菌種）サーモリシン（ＭＥＲ００１３５４）
８４ Ｍ０４．００１（バチルス・アントラシス）サーモリシン（ＭＥＲ０２１８２４）
８５ Ｍ０４．００１（バチルス・メガテリウム）サーモリシン（ＭＥＲ００１０３１）
８６ Ｍ０４．００１（バチルス種ＳＧ−１）サーモリシン（ＭＥＲ１０９４２７）
８７ Ｍ０４．００１（バチルス・カルドリティカス）サーモリシン（ＭＥＲ００１０３４）
８８ Ｍ０４．０１８（ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス）ステアロリシン（ＭＥＲ００１０２５）
８９ Ｍ０４．００１（ゲオバチルス種Ｙ４１２ＭＣ５２）サーモリシン（ＭＥＲ２３４４１７）
９０ Ｍ０４．００１（アリシクロバチルス・アシドカルダリウス）サーモリシン（ＭＥＲ００１３５３）
９１ Ｍ０４．００１（バチルス種）サーモリシン（ＭＥＲ００１９２７）
９２ Ｍ０４．００１（ゲオバチルス種Ｙ４１２ＭＣ６１）サーモリシン（ＭＥＲ１６８１３３）
９３ Ｍ０４．００１（ゲオバチルス種Ｃ５６−Ｔ３）サーモリシン（ＭＥＲ２１２３３８）
９４ Ｍ０４．００１（ゲオバチルス・カウストフィルス）サーモリシン（ＭＥＲ０４０４７４）
９５ Ｍ０４．００１（バチルス・サーモプロテオリティカス）サーモリシン（ＭＥＲ００１０２６）
９６ Ｍ０４．００１（ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス）サーモリシン（ＭＥＲ００１０２７）
９７ Ｍ０４．０１８（バチルス種ＳＧ−１）ステアロリシン（ＭＥＲ１０９３６４）
９８ Ｍ０４．００１（エクシグオバクテリウム・シビリクム）サーモリシン（ＭＥＲ０９１６７５）
９９ Ｍ０４．００１（エクシグオバクテリウム種ＡＴ１ｂ）サーモリシン（ＭＥＲ１２４５２６）
１００ Ｍ０４．００１（バチルス・マイコイデス）サーモリシン（ＭＥＲ１８７７９７）
１０１ Ｍ０４．００１（バチルス・シュードマイコイデス）サーモリシン（ＭＥＲ１８７７９３）
１０２（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７８７）
１０３ Ｍ０４．０１２（バチルス・チューリンゲンシス）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ０３９８１０）
１０４ Ｍ０４．０１２（セレウス菌）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ０２８８８７）
１０５ Ｍ０４．０１２（バチルス・ウェイヘンステファネンシス）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ０８４２１５）
１０６ Ｍ０４．０１２（バチルス・マイコイデス）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ１８７８００）
１０７ Ｍ０４．０１２（セレウス菌）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ１５１８７５）
１０８ Ｍ０４．０１２（バチルス・アントラシス）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ０２１８０４）
１０９ Ｍ０４．０１２（バチルス・シュードマイコイデス）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ１８７７９２）
１１０ Ｍ０４．０１２（バチルス・マイコイデス）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ１８７７９６）
１１１（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８４１６５）
１１２ Ｍ０４．０１２（セレウス菌）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ１８７８１０）
１１３ Ｍ０４．０１２（セレウス菌）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ１８７８０６）
１１４ Ｍ０４．０１２（バチルス・チューリンゲンシス）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ１８７７７９）
１１５ Ｍ０４．０１２（オセアノバチルス・イヘイエンシス）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ０２２０３８）
１１６ Ｍ０４．０１２（枯草菌）中性ペプチダーゼＢ（ＭＥＲ００１０２９）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１１７（ヘルペトシフォン・アウランチアクス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６５０）
１１８（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８０９）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１１９ Ｍ０４．００９（表皮ブドウ球菌）オーレオリシン（ＭＥＲ００１８６９）
１２０ Ｍ０４．００９（スタフィロコッカス・キャピティス）オーレオリシン（ＭＥＲ１７８９０３）
１２１ Ｍ０４．００９（黄色ブドウ球菌）オーレオリシン（ＭＥＲ００４７１１）
１２２ Ｍ０４．００９（マクロコッカス・カセオリティカス）オーレオリシン（ＭＥＲ１５５１３５）
１２３ Ｍ０４．００９（スタフィロコッカス・シュードインターメディウス）オーレオリシン（ＭＥＲ１７９７３６）
１２４ Ｍ０４．００９（スタフィロコッカス・ワーネリ）オーレオリシン（ＭＥＲ１８７８１４）
１２５ Ｍ０４．００９（スタフィロコッカス・クロモゲネス）オーレオリシン（ＭＥＲ０１１０７５）
１２６ Ｍ０４．００９（スタフィロコッカス・サプロフィチカス）オーレオリシン（ＭＥＲ０５７０５１）
１２７（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５０３２３）
１２８（バチルス・チューリンゲンシスＭ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７８０）
１２９（セレウス菌）に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０６２５９１）
１３０（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７７０）
１３１（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８０９８７）
１３２（セレウス菌Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８０５）
１３３（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７８９）
１３４（バチルス・ベトナメンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０３８２８１）
１３５（バチルス種ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０６２５８９）
１３６（バチルス種ＳＧ−１）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１０９４７８）
１３７（バチルス・コアウイレンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７７１）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ
１３８ Ｍ０４．０２１（サーモアクチノミセス属２７ａ）中性ペプチダーゼ（ＭＥＲ０２９７１９）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１３９ Ｍ０４．０１４（枯草菌）バシロリシン（ＭＥＲ０８００１４）
１４０ Ｍ０４．０１４（バチルス種ＲＨ２１９）バシロリシン（ＭＥＲ０８０７４３）
１４１ Ｍ０４．０１４（バチルス種Ｂ１６）バシロリシン（ＭＥＲ０５４６７６）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１４２ Ｍ０４．０１４（ブレビバチルス・ラテロスポラス）バシロリシン（ＭＥＲ０４８４７１）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１４３ Ｍ０４．０１４（バチルス・アミロリケファシエンス）バシロリシン（ＭＥＲ００１０３５）
１４４ Ｍ０４．０１４（バチルス種）バシロリシン（ＭＥＲ００１０３８）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１４５ Ｍ０４．０１４（バチルス・プミルス）バシロリシン（ＭＥＲ０９１６３４）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１４６ Ｍ０４．０１４（枯草菌）バシロリシン（ＭＥＲ００１０３２）
１４７（クロストリジウム・アセトブチリクム）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１４９３７）
１４８ Ｍ０４．０１１（クロストリジウム・パーフリンジェンス）λ毒素（ＭＥＲ００２１０３）
１４９ Ｍ０４．０１１（クロストリジウム・アセトブチリクム）λ毒素（ＭＥＲ０１４９４１）
１５０（クロストリジウム・ヒストリチクム）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ００３７９０）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ
１５１（クロロフレクス・アウランティアカス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ００１４５３）
１５２（クロロフレクサス属Ｙ−４００−ｆｌ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１５５４９７）
１５３ Ｍ０４．００８（リステリア・イノキュア）Ｍｐｌペプチダーゼ（リステリア属）（ＭＥＲ２２９９２５）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１５４ Ｍ０４．００８（リステリア菌）Ｍｐｌペプチダーゼ（ＭＥＲ００１０４７）
１５５ Ｍ０４．００８（リステリア・イバノビイ）Ｍｐｌペプチダーゼ（ＭＥＲ０４５７３９）
１５６ Ｍ０４．００８（リステリア・ゼーリゲリ）Ｍｐｌペプチダーゼ（ＭＥＲ０４５７４０）
１５７（プレシオシスチス・パシフィカ（Plesiocystis pacifica））Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１６０６０３）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ〜ＰＰＣ
１５８（スチグマテラ・オーランチアカ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６４３）
１５９（スチグマテラ・オーランチアカ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６４０）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１６０（ミクソコッカス・ザンサス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０６８４７５）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ〜ＰＰＣ
１６１ミクソコッカス・ザンサス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１７６２４）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１６２（シェワネラ・ヘリファキセンシス（Shewanella halifaxensis））Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１７６６３）
１６３（シュワネラ・ビオラセア）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２０３０８８）
１６４（ハリスコメノバクター・ヒドロシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２４８５７０）
１６５（サイトファガ・ハッチンソニイ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２３９２７）
１６６（ビブリオ・ミミカス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２２９３１５）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１６７（ビブリオ・バルニフィカス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２５４４２）
１６８（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８０２）
１６９（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６７８）
１７０（バチルス・アントラシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１９０６５）
１７１（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５４５０７）
１７２（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０３９８１３）
１７３（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８０４）
１７４（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６７４）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜Ｂｉｇ＿３〜Ｇｒａｍ＿ｐｏｓ＿ａｎｃｈｏｒ
１７５（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２８８８９）
１７６（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０３９８１１）
１７７（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２８８９０）
１７８（バチルス・アントラシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２０８４０）
１７９（バチルス・マイコイデス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７９９）
１８０（バチルス・ウェイヘンステファネンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１０９６８４）
１８１（バチルス・シュードマイコイデス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７９１）
１８２（バチルス・マイコイデス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７９５）
１８３（バチルス・マイコイデス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８０１）
１８４（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０３９８１４）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１８５（セレウス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２８８８８）
１８６（バチルス・アントラシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２０８３５）
１８７（ハヘラ・チェジュエンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５８６６７）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１８８（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ｎｐｒタンパク質）（ＭＥＲ０８８２９９）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
１８９（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ｎｐｒ−１タンパク質）（ＭＥＲ０７９３４２）
１９０（スポロゲネス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３７５４２）
１９１（ボツリヌス菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ｎｐｒタンパク質）（ＭＥＲ１８７７６７）
１９２（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ｎｐｒ＿１タンパク質）（ＭＥＲ１８７７５４）
１９３（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７５３）
１９４（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９３３８）
１９５（スポロゲネス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１４４８８４）
１９６（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ｎｐｒタンパク質）（ＭＥＲ０７９３４１）
１９７（スポロゲネス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７６９）
１９８（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ｎｐｒ＿２タンパク質）（ＭＥＲ１８７７５５）
１９９（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９３４０）
２００（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ｎｐｒ−４タンパク質）（ＭＥＲ０９５３１７）
２０１（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ｎｐｒ−４タンパク質）（ＭＥＲ０９４８０２）
２０２（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ｎｐｒタンパク質）（ＭＥＲ０９４８０１）
２０３（スポロゲネス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３６６８４）
２０４（ボツリヌス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ｎｐｒタンパク質）（ＭＥＲ０７９３３９）
２０５（スポロゲネス菌）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１７８２７５）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜Ｐ＿プロタンパク質〜Ｐ＿プロタンパク質
２０６（メタノサルシナ・アセチボランス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１７６９７）
２０７（ストレプトマイセス・ガーナエンシス）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８１８）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
２０８（ストレプトマイセス・セリカラー）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１１０８２）
２０９（ストレプトマイセス・スカビエイー）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２００７０５）
２１０（ストレプトマイセス・エバミティリス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２８５６２）
２１１（ストレプトマイセス・スビセウス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３７３７３）
２１２（ストレプトマイセス種Ｍｇ１）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３７４６３）
２１３（ストレプトマイセス・グリセウス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１２１４４７）
２１４（ストレプトマイセス・フィラメントサス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８１９）
２１５（ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１４０３６４）
２１６（ストレプトマイセス・アルブス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８２２）
２１７（ストレプトマイセス種ＳＰＢ７４）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１６３８６１）
２１８ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｅｐｓｕｍ？ｉｄ＝Ｍ０４．ＵＰＷ（ストレプトマイセス・クラブリゲルス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８２４）
２１９（アルスロバクター・クロロフェノリカス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１２６７５８）
２２０（アルスロバクター・フェナントレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２４０１８３）
２２１（アルスロバクター種ＦＢ２４）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５０７５９）
２２２（アルスロバクター・アウレッセンス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０７５１９５）
２２３（海洋性放線菌ＰＨＳＣ２０Ｃ１）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ
２２４（ブラキバクテリウム・ファエシウム（Brachybacterium faecium））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１２７５５２）
２２５（クラビバクター・ミシガンエンシス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１２１２１６）
２２６（クラビバクター・ミシガンエンシス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１５２９９）
２２７（マイクロバクテリウム・テスタセウム）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２４７３９９）
２２８（イントラスポランギウム・カルバム（Intrasporangium calvum））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２３１７３８）
２２９（ジャニバクター種ＨＴＣＣ２６４９）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１５３０１）
２３０（フランキア・アルニ（Frankia alni））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６５１）
２３１（フランキア種ＣｃＩ３）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５１５１０）
２３２（フランキア種ＥＡＮ１ｐｅｃ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５１７４７）
２３３（メイオテルムス・シルヴェナス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０３８２６９）
２３４（蛍光菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７５６）
２３５（ミクソコッカス・ザンサス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０６８０９５）
２３６（バークホルデリア種ＣＣＧＥ１００２）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２０３８７８）
２３７（トウゴマ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１６２８２１）
２３８（カテヌリスポラ・アシジフィラ（Catenulispora acidiphila））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３２７９５）
２３９（ブレビバクテリウム・リネンス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１５３００）
２４０（アナベナ・バリアビリス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５４９７６）
２４１（ノストック種ＰＣＣ ７１２０）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１６７１９）
２４２（ノストック・パンクチフォルメ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２４２５９）
２４３（かいよう病菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１９５６１）
２４４（ザントモナス・カンペストリス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０７０１７５）
２４５（イネ白葉枯病菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２７４９６）
２４６（ザントモナス・カンペストリス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１９４１６）
２４７（サーモモノスポラ・クルバータ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１２９２２９）
２４８（ハロモナス・エロンガータ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２２３５４８）
２４９（クロモハロバクター・サレキシゲンス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５０８９７）
２５０（パラ百日咳菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０３０７０６）
２５１（気管支敗血症菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０３０７８１）
２５２（ボルデテラ・ペツリイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１４６９０）
２５３（バリオボラックス・パラドクス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７５７）
２５４（バリオボラックス・パラドクス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２３５２８１）
２５５（シュードモナス・ブラッシカセアルム）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２４４７７０）
２５６（シュードモナス・フルバ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２４９２１５）
２５７（シュードモナス・スツッツェリ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９４６９９）
２５８（ディケヤー・ダダンティイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２２３８４３）
２５９（ディケヤー・ダダンティイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１９３４１５）
２６０（ディケヤー・ジアエ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７５８）
２６１（軟腐病菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ００１０４５）
２６２（ペクトバクテリウム・ワサビアエ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８３０）
２６３（ディケヤー・ダダンティイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８２７０７）
２６４ Ｍ０４．０２３（シトロバクター・ローデンチウム）ｚｐｘペプチダーゼ（ＭＥＲ１９６１８４）
２６５ Ｍ０４．０２３（エンテロバクター・カンセロゲナス）ｚｐｘペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７７２）
２６６ Ｍ０４．０２３（サルモネラ菌）ｚｐｘペプチダーゼ（ＭＥＲ１０８７１２）
２６７ Ｍ０４．０２３（エンテロバクター・サカザキ）ｚｐｘペプチダーゼ（ｚｐｘタンパク質）（ＭＥＲ０９１６０１）
２６８ Ｍ０４．０２３（火傷病菌）ｚｐｘペプチダーゼ（ｐｒｔ１タンパク質）（ＭＥＲ２０２０７４）
２６９ Ｍ０４．０２５（エルウィニア・ビリンギアエ）プロテアリシン（ｍｐｒタンパク質）（ＭＥＲ２２０９０２）
２７０ Ｍ０４．０２５（パントエア種Ａｔ−９ｂ）プロテアリシン（ＭＥＲ２３２０２２）
２７１ Ｍ０４．０２５（イネ内穎褐変病菌）プロテアリシン（ＭＥＲ２０２８１７）
２７２ Ｍ０４．０２５（ラーネラ種Ｙ９６０２）プロテアリシン（ＭＥＲ２３７１３９）
２７３ Ｍ０４．０２５（セラチア・グリメシイ）プロテアリシン（ＭＥＲ１１５２９８）
２７４ Ｍ０４．０２５（セラチア種Ａ２）プロテアリシン（ＭＥＲ１１９６６４）
２７５ Ｍ０４．０２５（セラチア・プロテアマキュランス）プロテアリシン（ＭＥＲ０５９４３９）
２７６ Ｍ０４．０２５（セラチア種ＡＳ９）プロテアリシン（ＭＥＲ２４９８２５）
２７７ Ｍ０４．０２５（セラチア種ＡＳ１２）プロテアリシン（ＭＥＲ２４９８０７）
２７８（ゲオデルマトフィルス・オブスクルス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３２５８９）
２７９（ゲンマタ・オブスキュリグロブス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７６８）
２８０（ノカルジオイデス種ＪＳ６１４）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０４９５２３）
２８１ Ｍ０４．０２４（ゼノラブダス・ボビエニイ）ＰｒｔＳペプチダーゼ（フォトラブダス・ルミネッセンス）（ＭＥＲ２００６１６）
２８２ Ｍ０４．０２４（ゼノラブダス・ネマトフィラ）ＰｒｔＳペプチダーゼ（ＭＥＲ２１９８１６）
２８３ Ｍ０４．０２４（ゼノラブダス・ネマトフィラ）ＰｒｔＳペプチダーゼ（ＭＥＲ２１９８１５）
２８４ Ｍ０４．０２４（フォトラブダス・アシンビオティカ）ＰｒｔＳペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７５９）
２８５ Ｍ０４．０２４（フォトラブダス・ルミネッセンス）ＰｒｔＳペプチダーゼ（ＭＥＲ０３３４８１）
２８６ Ｍ０４．０２４（フォトラブダス種Ａｚ２９）ＰｒｔＳペプチダーゼ（ＭＥＲ１１５２９７）
２８７（アスペルギルス・テレウス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６４４）
２８８（ネオサルトリア・フィシェリ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６１５）
２８９（ピレノフォラ・トリチシ・リペンティス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３８９０３）
２９０（サッカロポリスポラ・エリスラエア）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８８６８８）
２９１（ネクトリア・ハエマトコカ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２４３７７１）
２９２（ジベレラ・ゼアエ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０６４８３８）
２９３（メタリジウム・アニソピラエ（メタリジウム菌））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２４３７７０）
２９４（メタリジウム・アクリダム）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２４３７６９）
２９５（ワドリア・コンドロフィラ（Waddlia chondrophila））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２１１８４４）
２９６（シュードモナス・サバスタノイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２３２８２２）
２９７（シリンゲ菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５２６７２）
２９８（シュードモナス・コロナファシエンス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８１３）
２９９（シアノセイス種ＡＴＣＣ ５１１４２）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１０３３６２）
３００（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７８３）
３０１（セレウス菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１７８９７８）
３０２（セレウス菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８１１）
３０３（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７７８）
３０４（セレウス菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８０７）
３０５（メタノサルシナ・アセチボランス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１７６９８）
３０６（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７８４）
３０７（バチルス・チューリンゲンシス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７８８）
３０８（セルロファーガ・アルジコラ（Cellulophaga algicola））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２３５５６２）
３０９（クロコウジカビ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６３１）
３１０（プロビデンシア・ラスティジアニイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７７３）
３１１（プロビデンシア・アルカリファシエンス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７７４）
３１２（プロビデンシア・レットゲリ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７７５）
３１３（プロビデンシア・スチュアルティ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１２２８３９）
３１４（マイコバクテリウム・アブセサス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１７３６４）
３１５（マイコバクテリウム・アブセサス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１７３６３）
３１６（ブラディリゾビウム・ジャポニクム）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２６９８８）
３１７（アグロバクテリウム・ビチス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１６２４５４）
３１８（ムシラジニバクター・パルジス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２２９３１６）
ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３１９（霊菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ００１０４６）
３２０（ストレプトマイセス・ガーナエンシス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８１５）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３２１（粘液細菌）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１４２９２）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３２２（ストレプトマイセス・フィラメントサス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６７９）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３２３（ストレプトマイセス・エバミティリス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２８５１９）
３２４（ストレプトスポランギウム・ロセウム）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８１２）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３２５ Ｍ０４．００７（フェシウム菌）ココリシン（ＭＥＲ１８７７４９）
３２６ Ｍ０４．００７（フェカリス菌）ココリシン（ＭＥＲ００２８１０）
３２７（レニバクテリウム・サルモニナルム）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ００２０８３）
３２８（クリベラ・フラビダ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９３６６）
３２９（ヘルペトシフォン・アウランチアクス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８５８５１）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３３０ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・ジャンダエイ）ＰＡペプチダーゼ（アエロモナス型）（ＭＥＲ０７９８１５）
３３１ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・オイクレノフィラ）ＰＡペプチダーゼ（アエロモナス型）（ＭＥＲ０７９８０３）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ
３３２ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・パンクタータ）ＰＡペプチダーゼ（アエロモナス型）（ＭＥＲ０２９９４３）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３３３ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・エンシェレイア）ＰＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９８１７）
３３４ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・ベスチアルム）ＰＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９８１６）
３３５ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・メディア）ＰＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９８０２）
３３６ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・サルモニシダ）ＰＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９８１９）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ
３３７ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・パンクタータ）ＰＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０３００７３）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３３８ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・エンシェレイア）ＰＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９８０４）
３３９ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・ポポフィイ）ＰＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９８０５）
３４０ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・ハイドロフィラ）ＰＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０１１８５３）
３４１ Ｍ０４．０１６（アエロモナス種ＣＤＣ ２４７８−８５）ＰＡペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９８１８）
３４２ Ｍ０４．０１６（アエロモナス・シュベルティイ（Aeromonas schubertii））ＰＡペプチダーゼ（アエロモナス型）（ＭＥＲ０７９８０６）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ
３４３（アエロモナス・ベロニイ（Aeromonas veronii））Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５５１５４）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３４４（アエロモナス・ソブリア）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０７９８２０）
ＦＴＰ〜ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ〜ＰＰＣ
３４５（レイネケア種ＭＥＤ２９７）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８３７２７）
３４６（シュワネラ・デニトリフィカンス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０５０２３１）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ〜ＰＫＤ
３４７（シュワネラ・バルティカ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０４８８９５）
３４８（シュワネラ・アマゾネンシス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０４８８１１）
３４９（シュワネラ・ウーディイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８７２６５）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３５０（クロモバクテリウム・ビオラセウム）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２７３５０）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ〜ＰＰＣ
３５１（シュードアルテロモナス種ＳＢ−Ｂ１）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１４０５９２）
３５２（シュードアルテロモナス種ＳＭ９９１３）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６１７）
３５３（シュードアルテロモナス種Ａ２８）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１９０９８）
３５４（南極細菌株（Antarctic bacterium str.）６４３）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１２２５５）
３５５（シュードアルテロモナス種ＳＭ４９５）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７４８）
３５６（シュードアルテロモナス・ピスキキダ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０１９０９９）
３５７（シュードアルテロモナス・ルテニカ（Pseudoalteromonas ruthenica））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７５１）
３５８（シュードアルテロモナス・チュニカータ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１０８８５５）
３５９（モリテラ・ビスコサ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３９４４２）
３６０（ハリアンギウム・オクラセウム）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１４７６１）
３６１（ハリアンギウム・オクラセウム）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１２４４５０）
３６２（カンギエラ・コレエンシス（Kangiella koreensis））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０６５６１３）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ
３６３ Ｍ０４．００３（マリノモナス種ＭＥＤ１２１）ビブリオリシン（ＭＥＲ１３９８２６）
３６４（ビブリオ・スプレンディダス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１２２４８６）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ〜ＰＫＤ
３６５（ビブリオナレス目の細菌ＳＷＡＴ−３）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３９２５４）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＫＤ
３６６（ビブリオ・トゥビアッシ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７５０）
３６７（ビブリオ・ハーベイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６８８）
３６８（ビブリオ・キャンプベリイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３９５６８）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３６９（シュワネラ種ＭＲ−７）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０７２７６８）
３７０（シュワネラ種ＭＲ−４）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０７３０３０）
３７１（シュワネラ種ＡＮＡ−３）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０７３３８１）
３７２（シュワネラ・アマゾネンシス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０４９９２８）
３７３（シュワネラ・ウーディイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８７２０９）
３７４（腸炎ビブリオ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０２７９３６）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ
３７５（ビブリオ種Ｅｘ２５）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３９７４９）
３７６（ビブリオ・ハーベイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１０９２７１）
３７７（ハヘラ・チェジュエンシス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８０００２）
３７８ Ｍ０４．００３（モリテラ種ＰＥ３６）ビブリオリシン（ＭＥＲ１１３７６８）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ〜ＰＰＣ〜Ｐ＿プロタンパク質
３７９（難培養性細菌ｐＴＷ３）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１６４９６１）
３８０（難培養性細菌ｐＴＷ２）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１６４９５１）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
３８１ Ｍ０４．００５（緑膿菌）シュードリシン（ＭＥＲ００１０２４）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＰＣ
３８２ Ｍ０４．００３（ビブリオ・トゥビアッシ）ビブリオリシン（ＭＥＲ１３９０４４）
３８３ Ｍ０４．００３（ビブリオ・プロテオリチカス）ビブリオリシン（ＭＥＲ００１０４３）
３８４ Ｍ０４．００３（リストネラ・アンギラルム）ビブリオリシン（ＭＥＲ１２０５８３）
３８５ Ｍ０４．００３（ビブリオ・アンギラルム）ビブリオリシン（ＭＥＲ００１０４４）
３８６ Ｍ０４．００３（リストネラ・アンギラルム）ビブリオリシン（ＭＥＲ１２０６７１）
３８７ Ｍ０４．００３（ビブリオ・エスチュアリアナス）ビブリオリシン（ＭＥＲ１１３８０９）
３８８ Ｍ０４．００３（ビブリオ・バルニフィカス）ビブリオリシン（ＭＥＲ００３３５３）
３８９ Ｍ０４．０１０（ビブリオ・スプレンディダス）ビメリシン（ＭＥＲ０９１６３６）
３９０ Ｍ０４．０１０（ビブリオ種ＭＥＤ２２２）ビメリシン（ＭＥＲ１１３７１１）
３９１ Ｍ０４．０１０（ビブリオ種Ｔ−１８００）ビメリシン（ＭＥＲ０２９７９６）
３９２ Ｍ０４．０１０（ビブリオナレス目の細菌ＳＷＡＴ−３）ビメリシン（ＭＥＲ１０９２３７）
３９３ Ｍ０４．００３（コレラ菌）ビブリオリシン（ＭＥＲ００１０４１）
３９４ Ｍ０４．００３（ビブリオ・ミミカス）ビブリオリシン（ＭＥＲ１２２２９９）
３９５ Ｍ０４．００３（ビブリオ・フラビアリス）ビブリオリシン（ＭＥＲ０１９０９７）
３９６ Ｍ０４．００３（サリニビブリオ種ＡＦ−２００４）ビブリオリシン（ＭＥＲ０９１６３９）
３９７ Ｍ０４．０１０（フォトバクテリウム種ＳＫＡ３４）ビメリシン（ＭＥＲ１１００３４）
３９８ Ｍ０４．０１０（ビブリオ・アンガスタム）ビメリシン（ＭＥＲ１０９０５６）
３９９ Ｍ０４．０１０（フォトバクテリウム・アンガスタム）ビメリシン（ＭＥＲ１８７７６３）
４００ Ｍ０４．０１０（ビブリオ・アンガスタム）ビメリシン（ＭＥＲ１０９３０２）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４０１（モリテラ種ＰＥ３６）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１０９１８０）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４０２（アルテロモナダーレス属の細菌ＴＷ−７）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０９１６１０）
４０３（シュワネラ・ビオラセア）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２０３２５３）
４０４（ビブリオ・キャンプベリイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１６８１２５）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４０５（レジオネラ・ロングビーチエ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１９８５６５）
４０６ Ｍ０４．０２０（ビブリオ種ＡＮＤ４）ｐａｐ６ペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７６４）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４０７ Ｍ０４．０２０（ビブリオ・キャンプベリイ）ｐａｐ６ペプチダーゼ（ＭＥＲ１１８６０５）
４０８ Ｍ０４．０２０（ビブリオ・ハーベイ）ｐａｐ６ペプチダーゼ（ＭＥＲ０２０２４０）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４０９（ビブリオ・スプレンディダス）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１３９９４５）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４１０ Ｍ０４．００６（レジオネラ・ニューモフィラ）Ｍｓｐペプチダーゼ（レジオネラ種）（ＭＥＲ００１０３９）
４１１ Ｍ０４．００６（レジオネラ・ドランコーティイ）Ｍｓｐペプチダーゼ（レジオネラ種）（ＭＥＲ１８７８２８）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４１２ Ｍ０４．００６（レジオネラ・ロングビーチエ）Ｍｓｐペプチダーゼ（レジオネラ種）（ＭＥＲ００２３９４）
４１３（レジオネラ・ニューモフィラ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０４０７８０）
４１４（レジオネラ・ドランコーティイ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７８２９）
４１５（レジオネラ・ロングビーチエ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１９８４７１）
４１６（レジオネラ・ニューモフィラ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０４０７８２）
４１７（レジオネラ・ニューモフィラ）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０４０７８１）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＫＤ〜ＰＫＤ〜ＰＫＤ
４１８ Ｍ０４．０１９（シュードアルテロモナス・ピスキキダ）ＭｐｒＩＩＩ（ＭＥＲ０２４５９１）
４１９（テレディニバクター・ツルネラエ）Ｍ４に割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７６０）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ〜ＰＫＤ〜ＰＫＤ〜ＰＫＤ〜ＰＫＤ
４２０（レイネケア種ＭＥＤ２９７）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ０８３７２２）
４２１（レイネケア・ブランデンシス（Reinekea blandensis））Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１８７７６２）
ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４２２（レイネケア種ＭＥＤ２９７）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１１７３９２）
４２３（アルテロモナス種ＳＮ２）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ２４７９９１）
ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃ
４２４（ヒドロゲニビルガ種１２８−５−Ｒ１−１）Ｍ４ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ（ＭＥＲ１４２０７０）
Ｂ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｓｔ検索アルゴリズムを用いた関連分子の同定
タンパク質ＢＬＡＳＴ解析（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，Ｍａｄｄｅｎ ＴＬ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＡＡ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ，Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ．（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２）を、Ｇｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｓｔ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ）において、特許及びパブリックドメインのデータベースに対して、問い合わせ配列としてサーモリシン（配列番号３）のアミノ酸配列を用いて実行することで、以下に示す結果を得た（表５．２）。ＢＬＡＳＴは、ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔによるＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２アルゴリズムの実行であって、生物学的類似性の観点から最も関連するアミノ酸配列を見つけだす。この配列検索は、タンパク質を検索するために次のデフォルトＢＬＡＳＴパラメータを有している：ワードサイズ：３、Ｅ値カットオフ：１０、スコア行列：ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ開始：１１、ギャップ伸長：２
Figure 2015534820
Figure 2015534820
Figure 2015534820
Figure 2015534820
Figure 2015534820
Figure 2015534820
（実施例６）
安定性が強化されたサーモリシン変異体を同定するための温度因子の利用
結晶学上の温度因子は、高分子を構成する各原子の相対運動の尺度である。これらの温度因子は、結晶Ｘ線回折の個々のピーク強度として与えられる回折パターン計算値が実測パターンと最もよくマッチするようにモデルを精密化した結果として生じる。温度因子は、式：−ｅｘｐ（−Ｂｓｉｎ２θ／λ）（式中、Ｂは温度因子である）を用いて、運動性の高い原子が、散乱角（θ）の関数として高分子凝集体の回折全体の縮小効果を有することを反映するように減衰因子として精密化される（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．及びＪｏｈｎｓｏｎ Ｌ．Ｎ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９７６年、１２１頁）。
全体的に運動性が高い領域は、折り畳まれた高分子がより不安定である領域を表し、温度上昇又は変性剤によって分子がストレスを受けたときにアンフォールディングが始まる点である可能性が高い。さらに、全体的な運動性が高いい領域は、平均温度因子が最も高い領域であると見込まれる。
バチルス・サーモプロテオリティカスのサーモリシンタンパク質の結晶構造は、多数の独立した研究機関によって決定されている。タンパク質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）により、８ＴＬＮ、２ＴＬＸ及び３ＤＯ１の識別子を入力することで独立した３つのタンパク質モデルが選択された。主鎖の温度因子が最も高い結晶構造内の領域であって、具体的には主鎖平均温度因子が平均値より観測された分散の少なくとも１．５倍超の領域をスクリーニングすることにより、全体的に運動性を有する領域を調べた。表６ａ〜６ｃに、主鎖平均温度因子が、所定の結晶学的モデルの分子全体に関する主鎖平均温度因子に関して観測された分散と比較して１．５倍超のｚスコアを有する残基を挙げる。これら３つの構造では、同じ領域が、サーモリシン中の全残基に関する主鎖平均温度因子より上に観測された分散の１．５倍超の温度因子を示すことが見出される。これら領域は、コンセンサス柔軟性領域を表し、次の残基を含む。
１〜２位（Ｎ末端残基）、１２７〜１２８位、１８０〜１８１位、１９５〜１９９位、２１１位、２２３〜２２４位、２９８〜３００位、及び３１６位（Ｃ末端残基）。
Figure 2015534820
Figure 2015534820
Figure 2015534820
サーモリシン内の全ての部位を、分子内の可能な限り多数の１アミノ酸置換を作製することによってスクリーニングした。様々な洗濯洗剤配合物中での熱安定性又は高温での改善された洗浄性能のどちらかを付与するいくつかの変異体が、これらのコンセンサス柔軟性領域のうちの一つに該当する部位で生じることが分かった。Ｓｕｎ Ａｌｌ−ｉｎ−１ Ｔｕｒｂｏ Ｇｅｌ若しくはＡｔ処方洗剤（ｐＨ ８）中での改善された洗浄性能又は改善された熱安定性を付与する、コンセンサス柔軟性領域における代表的な置換を表６．２に挙げる。作業仮説は、これらの柔軟性領域がタンパク質のアンフォールディング開始部位であることである。この仮説に基づいて、様々なコンセンサスな柔軟性領域での変異体を組み合わせることで、より一層の安定化が図られると予想される。表２に示すものから選択されるいくつかの柔軟性領域を同時に安定化させれば、実質的により安定な分子が得られるであろう。
Figure 2015534820

Claims (54)

  1. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも７５％は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記生産的位置が、２位、８７位、９６位、１９８位、２７７位、２９３位、２９５位、２９８位及び３０１位からなる群から選択される（ここで、前記サーモリシン変異体の前記アミノ酸位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  2. 前記生産的位置が、２位（Ｔ，Ｆ，Ｌ，Ｐ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ｑ，Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｋ，Ｍ）、８７位（Ｖ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｉ，Ｓ，Ｐ，Ｒ，Ｔ，Ｃ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ，Ｙ）、９６位（Ｎ，Ｃ，Ｄ，Ｉ，Ｖ，Ｆ，Ｔ，Ｇ，Ｈ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｗ，Ｋ，Ｌ，Ｙ）、１９８位（Ｓ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｋ）、２７７位（Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｎ，Ｒ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｄ，Ｙ）、２９３位（Ｔ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｑ，Ｓ，Ｎ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｙ）、２９５位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｎ，Ｔ，Ｖ，Ｆ，Ｇ，Ａ，Ｋ，Ｍ，Ｗ）、２９８位（Ｓ，Ｃ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｅ，Ｎ，Ｐ，Ａ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｒ）、３０１位（Ｑ，Ｅ，Ｈ，Ｐ，Ｒ，Ｌ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｗ，Ｍ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｋ）からなる群から選択される（ここで、前記サーモリシン変異体の前記アミノ酸位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、請求項１に記載の変異体。
  3. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変は生産的位置であり、前記生産的位置で試験された前記改変が、次の評価基準［すなわち、
    前記親酵素サーモリシンに対して、発現、洗剤安定性、熱安定性、ＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄活性、又はＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性のパラメータのうち少なくとも３種に関する最小性能指数（ＰＩ）が１以上である、位置］を満たしており、並びに
    前記生産的位置が２７８位、２８３位、１８０位、２４４位、４８位及び６３位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  4. 前記生産的位置が、Ｔ２７８Ｒ、Ｑ２８３Ｅ、Ａ１８０Ｅ、Ｉ２４４Ｔ、Ｔ４８Ｅ及びＦ６３Ｃからなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、請求項３に記載の変異体。
  5. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変は生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも１つの改変が、次の評価基準［すなわち、
    前記親酵素サーモリシンに対して、発現、洗剤安定性、熱安定性、ＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄活性、又はＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性のパラメータの少なくとも全てに関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であるが、前記パラメータのうち一つ以下が０．８未満である、位置］を満たしており、並びに
    前記生産的位置が、０１９位、０２５位、０２６位、０６３位、０９１位、０９６位、０９７位、１０１位、１０９位、１１８位、１３１位、１４０位、１５８位、１５９位、１７５位、１８０位、２１９位、２２５位、２３２位、２４４位、２４６位、２６１位、２７７位、２９３位、３００位、３０１位、３０１位、３０３位、３０５位、及び３１１位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  6. 前記生産的位置が、Ｎ０１９Ｄ、Ｓ０２５Ａ、Ｔ０２６Ｒ、Ｓ０６５Ａ、Ｌ０９１Ｍ、Ｎ０９６Ｑ、Ｎ０９６Ｒ、Ｎ０９６Ｙ、Ｎ０９７Ｋ、Ｒ１０１Ｍ、Ｇ１０９Ａ、Ｓ１１８Ａ、Ｉ１３１Ｌ、Ｖ１４０Ｄ、Ｑ１５８Ａ、Ｎ１５９Ｅ、Ｎ１５９Ｋ、Ｌ１７５Ｖ、Ａ１８０Ｒ、Ｇ１９６Ｔ、Ｇ１９６Ｙ、Ｋ２１９Ｓ、Ｑ２２５Ｅ、Ｉ２３２Ｒ、Ｉ２４４Ｌ、Ｑ２４６Ｄ、Ｄ２６１Ｎ、Ｐ２７７Ｇ、Ｔ２９３Ｙ、Ｓ３００Ｇ、Ｑ３０１Ｆ、Ｑ３０１Ｍ、Ｖ３０３Ｒ、Ｓ３０５Ａ、Ｄ３１１Ａからなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、請求項５に記載の変異体。
  7. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも７５％は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記生産的位置が、２位、２６位、４７位、４９位、５３位、６５位、８７位、９１位、９６位、１０８位、１１８位、１２８位、１５４位、１７９位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２０９位、２１１位、２１７位、２１９位、２２５位、２３２位、２５６位、２５７位、２５９位、２６１位、２６５位、２６７位、２７２位、２７６位、２７７位、２８６位、２８９位、２９０位、２９３位、２９５位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０３位、３０５位、３０８位、３１１位、及び３１６位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  8. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも７５％は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記生産的位置が、２位、２６位、４７位、５３位、８７位、９１位、９６位、１０８位、１１８位、１５４位、１７９位、１９７位、１９８位、１９９位、２０９位、２１１位、２１７位、２１９位、２２５位、２３２位、２５６位、２５７位、２５９位、２６１位、２６５位、２６７位、２７２位、２７６位、２７７位、２８６位、２８９位、２９０位、２９３位、２９５位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０３位、３０５位、３０８位、３１１位、及び３１６位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  9. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも４０％でかつ７５％未満は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記生産的位置が、１位、４位、１７位、２５位、４０位、４５位、５６位、５８位、６１位、７４位、８６位、９７位、１０１位、１０９位、１４９位、１５０位、１５８位、１５９位、１７２位、１８１位、２１４位、２１６位、２１８位、２２１位、２２２位、２２４位、２５０位、２５３位、２５４位、２５８位、２６３位、２６４位、２６６位、２６８位、２７１位、２７３位、２７５位、２７８位、２７９位、２８０位、２８２位、２８３位、２８７位、２８８位、２９１位、２９７位、３０２位、３０４位、３０７位、及び３１２位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  10. 前記親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を更に含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも４０％でかつ７５％未満は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記生産的位置が、１位、４位、１７位、２５位、４０位、４５位、６１位、７４位、８６位、９７位、１０１位、１０９位、１４９位、１５０位、１５８位、１５９位、１７２位、１８１位、２１４位、２１６位、２１８位、２２１位、２２２位、２２４位、２５０位、２５３位、２５４位、２５８位、２６３位、２６４位、２６６位、２６８位、２７１位、２７５位、２７９位、２８２位、２８３位、２８７位、２８８位、２９１位、２９７位、３０２位、３０４位、３０７位、及び３１２位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、請求項３に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  11. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも１５％でかつ４０％未満は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記生産的位置が、５位、９位、１１位、１９位、２７位、３１位、３３位、３７位、４６位、６４位、７３位、７６位、７９位、８０位、８５位、８９位、９５位、９８位、９９位、１０７位、１２７位、１２９位、１３１位、１３７位、１４１位、１４５位、１４８位、１５１位、１５２位、１５５位、１５６位、１６０位、１６１位、１６４位、１６８位、１７１位、１７６位、１８０位、１８２位、１８７位、１８８位、２０５位、２０６位、２０７位、２１０位、２１２位、２１３位、２２０位、２２７位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２４２位、２４４位、２４６位、２４８位、２４９位、２５２位、２５５位、２７０位、２７４位、２８４位、２９４位、２９６位、３０６位、３０９位、３１０位、３１３位、３１４位、及び３１５位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  12. 前記親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を更に含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも１５％でかつ４０％未満は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記生産的位置が、５位、９位、１１位、１９位、２７位、３１位、３３位、３７位、４６位、６４位、７３位、７６位、７９位、８０位、８５位、８９位、９５位、９８位、９９位、１０７位、１２７位、１２９位、１３１位、１３７位、１４１位、１４５位、１４８位、１５２位、１５５位、１６０位、１６１位、１６４位、１６８位、１７１位、１７６位、１８０位、１８２位、１８７位、１８８位、２０５位、２０６位、２０７位、２１０位、２１２位、２１３位、２２０位、２２７位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２４２位、２４４位、２４６位、２４８位、２４９位、２５２位、２５５位、２７０位、２７４位、２８４位、２９４位、２９６位、３０６位、３０９位、３１０位、３１３位、３１４位、及び３１５位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、請求項５に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  13. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも１つの改変でかつ１５％未満は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記生産的位置が、３位、６位、７位、２０位、２３位、２４位、４４位、４８位、５０位、５７位、６３位、７２位、７５位、８１位、９２位、９３位、９４位、１００位、１０２位、１０３位、１０４位、１１０位、１１７位、１２０位、１３４位、１３５位、１３６位、１４０位、１４４位、１５３位、１７３位、１７４位、１７５位、１７８位、１８３位、１８５位、１８９位、１９３位、２０１位、２２３位、２３０位、２３８位、２３９位、２４１位、２４７位、２５１位、２６０位、２６２位、２６９位、及び２８５位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  14. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を更に含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変が、サーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも１つの改変でかつ１５％未満は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記生産的位置が、３位、７位、２０位、２３位、２４位、４４位、４８位、５０位、５７位、７２位、８１位、９２位、９３位、９４位、１００位、１０２位、１０３位、１０４位、１１０位、１１７位、１２０位、１３４位、１３５位、１３６位、１４０位、１４４位、１５３位、１７３位、１７４位、１７５位、１７８位、１８３位、１８５位、１８９位、１９３位、２０１位、２２３位、２３０位、２３８位、２３９位、２４１位、２４７位、２５１位、２６０位、２６２位、２６９位、及び２８５位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、請求項７に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  15. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変が、サーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも７５％は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記改変が、２位（Ｔ，Ｆ，Ｌ，Ｐ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ｑ，Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｋ，Ｍ）、２６位（Ｔ，Ｋ，Ｌ，Ｒ，Ｖ，Ｙ，Ｗ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｃ，Ｄ）、４７位（Ｒ，Ａ，Ｃ，Ｈ，Ｋ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｔ）、４９位（Ｔ，Ａ，Ｆ，Ｈ，Ｖ，Ｅ，Ｙ）、５３位（Ｓ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｑ，Ｔ，Ｗ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｎ，Ｖ，Ｃ，Ｌ）、６５位（Ｓ，Ｉ，Ｍ，Ｑ，Ｌ，Ａ）、８７位（Ｖ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｉ，Ｓ，Ｐ，Ｒ，Ｔ，Ｃ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ，Ｙ）、９１位（Ｌ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｋ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ａ，Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ｙ）、９６位（Ｎ，Ｃ，Ｄ，Ｉ，Ｖ，Ｆ，Ｔ，Ｇ，Ｈ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｗ，Ｋ，Ｌ，Ｙ）、１０８位（Ｑ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ａ，Ｄ，Ｉ，Ｋ，Ｎ，Ｌ，Ｍ）、１１８位（Ｓ，Ｃ，Ｇ，Ｅ，Ａ，Ｄ，Ｍ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｖ）、１２８位（Ｑ，Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｓ，Ｋ，Ａ）、１５４位（Ｇ，Ｌ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｄ，Ｉ，Ｗ，Ｃ，Ｎ，Ａ，Ｈ，Ｋ，Ｍ，Ｙ）、１７９位（Ｙ，Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｆ）、１９６位（Ｇ，Ｅ，Ｔ，Ｋ，Ｖ，Ｌ，Ｙ，Ａ，Ｗ）、１９７位（Ｉ，Ｄ，Ｋ，Ｌ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ａ，Ｈ，Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｒ，Ｆ，Ｃ）、１９８位（Ｓ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｋ）、１９９位（Ｇ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｌ，Ａ，Ｙ）、２０９位（Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｇ，Ｉ，Ｋ，Ｐ，Ｒ，Ｙ，Ｃ，Ｍ）、２１１位（Ｙ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｅ，Ｒ）、２１７位（Ｙ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｇ，Ａ，Ｆ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｌ）、２１９位（Ｋ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ａ，Ｅ，Ｒ，Ｓ）、２２５位（Ｑ，Ｄ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｍ，Ｒ，Ｃ，Ｅ，Ｋ，Ｌ，Ｓ）、２３２位（Ｉ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ，Ｇ，Ｌ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）、２５６位（Ｖ，Ｌ，Ｔ，Ｋ，Ａ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｒ，Ｓ，Ｎ）、２５７位（Ｇ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｙ，Ｋ，Ｒ）、２５９位（Ｇ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，Ｗ，Ｋ，Ｒ，Ｎ，Ｓ，Ｔ）、２６１位（Ｄ，Ａ，Ｎ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｓ）、２６５位（Ｋ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｒ，Ｎ）、２６７位（Ｆ，Ｅ，Ｇ，Ｎ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｃ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｔ，Ｙ）、２７２位（Ｔ，Ｅ，Ｌ，Ｖ，Ｗ，Ｐ，Ｙ，Ｃ，Ｆ，Ｎ，Ｑ，Ａ，Ｋ）、２７６位（Ｔ，Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｐ，Ｑ，Ｗ，Ｈ，Ａ，Ｌ，Ｖ，Ｙ）、２７７位（Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｎ，Ｒ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｄ，Ｙ）、２８６位（Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｓ，Ｐ，Ｃ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｙ）、２８９位（Ｖ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｎ，Ｓ，Ｗ，Ｒ，Ｔ，Ｌ，Ｍ，Ｙ，Ａ）、２９０位（Ｑ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｌ，Ｗ，Ｙ，Ｒ，Ｔ，Ｖ，Ａ，Ｈ，Ｎ）、２９３位（Ｔ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｑ，Ｓ，Ｎ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｙ）、２９５位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｎ，Ｔ，Ｖ，Ｆ，Ｇ，Ａ，Ｋ，Ｍ，Ｗ）、２９８位（Ｓ，Ｃ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｅ，Ｎ，Ｐ，Ａ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｒ）、２９９位（Ｔ，Ｃ，Ｆ，Ｌ，Ｍ，Ｒ，Ｗ，Ｐ，Ｄ，Ｑ，Ｎ，Ａ，Ｋ）、３００位（Ｓ，Ｃ，Ｋ，Ｍ，Ｒ，Ｙ，Ｉ，Ｌ，Ｈ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｄ，Ｎ）、３０１位（Ｑ，Ｅ，Ｈ，Ｐ，Ｒ，Ｌ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｗ，Ｍ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｋ）、３０３位（Ｖ，Ｃ，Ｈ，Ｇ，Ｋ，Ｌ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｐ，Ｙ）、３０５（Ｓ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｗ，Ｙ，Ｑ，Ｈ，Ｔ，Ｖ，Ａ，Ｋ，Ｍ）、３０８位（Ｑ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｍ，Ｒ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ａ，Ｌ）、３１１位（Ｄ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ａ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｖ，Ｗ，Ｙ）、及び３１６位（Ｋ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｌ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ａ，Ｍ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  16. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変が、サーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも４０％でかつ７５％未満は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記改変が、１位（Ｉ，Ｋ，Ｍ，Ｖ，Ａ，Ｈ，Ｗ，Ｙ，Ｃ，Ｌ）、４位（Ｔ，Ｅ，Ａ，Ｎ，Ｒ，Ｖ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｙ）、１７位（Ｑ，Ｉ，Ｗ，Ｙ，Ｃ，Ｒ，Ｖ，Ｔ，Ｌ）、２５位（Ｓ，Ｄ，Ｆ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｍ，Ｒ）、４０位（Ｆ，Ｅ，Ｇ，Ｍ，Ｑ，Ｓ，Ｙ，Ｗ，Ａ，Ｋ，Ｌ）、４５位（Ｋ，Ｅ，Ｌ，Ｓ，Ｆ，Ｈ，Ｑ，Ｙ，Ａ，Ｇ，Ｍ）、５６位（Ａ，Ｋ，Ｑ，Ｖ，Ｗ，Ｈ，Ｉ，Ｍ）、５８位（Ａ，Ｎ，Ｙ，Ｖ，Ｌ）、６１位（Ｑ，Ｍ，Ｒ，Ｗ，Ｆ，Ｖ，Ｃ，Ｉ，Ｌ）、７４位（Ｈ，Ｅ，Ｌ，Ｖ，Ｃ，Ｆ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｗ）、８６（Ｎ，Ｌ，Ｓ，Ｙ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｋ，Ｄ）、９７位（Ｎ，Ｋ，Ｃ，Ｒ，Ｓ，Ｙ，Ｅ，Ｍ）、１０１位（Ｒ，Ｔ，Ｃ，Ｌ，Ｓ，Ｈ）、１０９位（Ｇ，Ａ，Ｌ，Ｓ，Ｅ，Ｍ，Ｒ，Ｗ）、１４９位（Ｔ，Ｍ，Ｖ，Ａ，Ｌ，Ｄ，Ｓ，Ｎ）、１５０位（Ｄ，Ａ，Ｆ，Ｋ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｓ）、１５８位（Ｑ，Ａ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｌ，Ｒ，Ｙ，Ｓ）、１５９位（Ｎ，Ｒ，Ｗ，Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｍ，Ｔ，Ｓ，Ｙ）、１７２位（Ｆ，Ｇ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙ，Ｄ，Ｈ）、１８１位（Ｎ，Ｌ，Ａ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｔ，Ｓ）、２１４位（Ｐ，Ｃ，Ｇ，Ｋ，Ｓ，Ｎ，Ａ，Ｒ）、２１６位（Ｈ，Ｃ，Ｅ，Ｓ，Ｔ，Ｒ，Ａ）、２１８位（Ｓ，Ｋ，Ｌ，Ｙ，Ｆ，Ｇ，Ｔ，Ｖ）、２２１位（Ｙ，Ｋ，Ｎ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ａ，Ｆ，Ｇ，Ｍ）、２２２位（Ｔ，Ｃ，Ｄ，Ｌ，Ｙ，Ｉ，Ｖ，Ａ，Ｍ，Ｋ）、２２４位（Ｔ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｌ，Ｐ，Ｑ，Ｖ，Ｙ，Ｅ，Ｈ）、２５０位（Ｈ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｖ，Ｙ）、２５３位（Ｖ，Ｎ，Ｔ，Ｉ，Ｒ，Ｙ，Ｍ，Ｑ）、２５４位（Ｓ，Ａ，Ｍ，Ｒ，Ｙ，Ｋ，Ｌ，Ｎ，Ｖ，Ｗ）、２５８位（Ｉ，Ｅ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｑ，Ｖ）、２６３位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｑ，Ｔ，Ｈ，Ｋ，Ｎ，Ｖ，Ａ，Ｍ）、２６４位（Ｇ，Ｃ，Ｒ，Ａ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ）、２６６位（Ｉ，Ａ，Ｆ，Ｌ，Ｓ，Ｃ，Ｍ，Ｔ，Ｖ）、２６８位（Ｙ，Ｍ，Ｑ，Ｖ，Ａ，Ｓ，Ｋ）、２７１位（Ｌ，Ａ，Ｄ，Ｆ，Ｉ，Ｎ，Ｙ，Ｈ）、２７３位（Ｑ，Ａ，Ｈ，Ｙ，Ｃ，Ｓ，Ｗ，Ｅ，Ｇ，Ｎ）、２７５位（Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｖ，Ｃ，Ｑ，Ｓ，Ｔ）、２７８位（Ｔ，Ｇ，Ｋ，Ｒ，Ｙ，Ｃ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｓ）、２７９位（Ｓ，Ａ，Ｄ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ｇ）、２８０位（Ｎ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｑ，Ｈ，Ｔ）、２８２位（Ｓ，Ｋ，Ｎ，Ｒ，Ａ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，Ｔ）、２８３位（Ｑ，Ｋ，Ｌ，Ｐ，Ｒ，Ｗ，Ｙ，Ｓ）、２８７位（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｖ，Ｙ，Ｋ，Ｒ，Ｔ，Ｄ，Ｃ）、２８８位（Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｍ）、２９１位（Ｓ，Ｅ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｖ，Ａ，Ｔ）、２９７位（Ｇ，Ａ，Ｍ，Ｒ，Ｙ，Ｃ，Ｆ，Ｋ，Ｔ，Ｄ，Ｎ）、３０２位（Ｅ，Ｋ，Ｌ，Ｇ，Ｔ，Ｖ，Ｄ，Ｑ，Ａ）、３０４位（Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｅ，Ｋ，Ｙ）、３０７位（Ｋ，Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｉ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｒ，Ｗ，Ｙ，Ｈ）、及び３１２位（Ａ，Ｇ，Ｍ，Ｖ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｔ，Ｃ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  17. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変が、サーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも１５％でかつ４０％未満は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記改変が、５位（Ｓ，Ｄ，Ｎ，Ｐ，Ｈ，Ｌ）、９位（Ｖ，Ｌ，Ｔ，Ｉ）、１１位（Ｒ，Ｉ，Ｙ，Ｋ）、１９位（Ｎ，Ｌ，Ｙ，Ｋ，Ｓ）、２７位（Ｙ，Ｗ，Ａ，Ｍ，Ｖ，Ｃ，Ｌ）、３１位（Ｑ，Ａ，Ｋ，Ｖ，Ｉ，Ｃ，Ｙ）、３３位（Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｋ，Ａ，Ｃ，Ｌ，Ｍ）、３７位（Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｒ，Ｌ，Ｋ）、４６位（Ｙ，Ｌ，Ｈ，Ｎ，Ｃ）、６４位（Ａ，Ｈ，Ｑ，Ｔ，Ｄ，Ｅ）、７３位（Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｌ，Ｍ，Ｗ）、７６位（Ｙ，Ｈ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｔ）、７９位（Ｖ，Ｌ，Ｑ，Ｔ，Ａ，Ｎ，Ｓ）、８０位（Ｔ，Ｉ，Ｄ，Ａ，Ｌ，Ｎ）、８５位（Ｋ，Ｅ，Ａ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｓ）、８９位（Ｎ，Ｌ，Ｍ，Ｈ）、９５（Ｇ，Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｓ）、９８位（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｈ，Ｒ，Ｙ，Ｋ，Ｖ）、９９位（Ａ，Ｅ，Ｋ，Ｐ，Ｒ，Ｓ）、１０７位（Ｓ，Ｄ，Ｋ，Ｙ，Ａ，Ｇ）、１２７位（Ｇ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）、１２９位（Ｔ，Ｉ，Ｒ，Ｅ，Ｙ，Ｌ，Ｍ）、１３１位（Ｉ，Ｙ，Ｗ，Ｌ）、１３７位（Ｉ，Ｐ，Ａ，Ｅ，Ｔ，Ｖ，Ｌ）、１４１位（Ａ，Ｓ，Ｃ，Ｇ）、１４５位（Ｔ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｍ，Ｎ，Ｑ）、１４８位（Ｖ，Ｌ，Ｎ，Ｙ，Ｍ，Ａ，Ｑ）、１５１位（Ｙ，Ｇ）、１５２位（Ｔ，Ｓ，Ｌ，Ｍ，Ｇ）、１５５位（Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｍ）、１５６位（Ｉ，Ｌ，Ｑ）、１６０位（Ｅ，Ｌ，Ｙ，Ｑ）、１６１位（Ｓ，Ａ，Ｎ，Ｐ，Ｔ）、１６４位（Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｃ，Ａ）、１６８位（Ｉ，Ａ，Ｍ，Ｔ，Ｌ）、１７１位（Ｉ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｌ，Ｓ，Ｇ）、１７６位（Ｖ，Ｌ，Ｎ，Ｃ）、１８０位（Ａ，Ｅ，Ｇ，Ｋ，Ｔ，Ｓ）、１８２位（Ｋ，Ｌ，Ａ，Ｗ）、１８７位（Ｅ，Ｌ，Ｄ）、１８８位（Ｉ，Ｌ，Ｖ）、２０５位（Ｍ，Ｌ，Ａ，Ｖ，Ｑ）、２０６位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｒ）、２０７位（Ｄ，Ａ，Ｈ，Ｎ）、２１０位（Ｋ，Ｉ，Ｌ，Ｖ）、２１２位（Ｇ，Ｙ，Ａ，Ｄ，Ｑ）、２１３位（Ｄ，Ｎ，Ｓ，Ｌ，Ａ，Ｇ，Ｗ）、２２０位（Ｒ，Ｋ，Ｖ，Ａ）、２２７位（Ｎ，Ｄ，Ｌ，Ｙ，Ａ）、２３４位（Ｓ，Ｄ，Ｎ，Ａ，Ｃ）、２３５位（Ｇ，Ｍ，Ｃ，Ｑ，Ｓ，Ａ）、２３６位（Ｉ，Ｍ，Ａ，Ｃ）、２３７位（Ｉ，Ｎ，Ｆ，Ｍ）、２４２位（Ｙ，Ｃ，Ｆ，Ｎ，Ｖ）、２４４位（Ｉ，Ｔ，Ｖ，Ｆ，Ａ，Ｍ，Ｌ）、２４６位（Ｑ，Ｅ，Ｎ，Ｔ，Ｌ，Ｃ，Ｄ）、２４８位（Ｇ，Ａ，Ｅ，Ｓ）、２４９位（Ｔ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｌ，Ｙ，Ｐ）、２５２位（Ｇ，Ｋ，Ｙ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｗ）、２５５位（Ｖ，Ｌ，Ｐ，Ａ，Ｙ，Ｍ，Ｎ）、２７０位（Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｓ，Ｇ）、２７４位（Ｙ，Ｆ，Ｈ，Ａ，Ｃ，Ｑ，Ｔ，Ｍ）、２８４位（Ｌ，Ｖ，Ｗ，Ａ，Ｍ，Ｙ）、２９４位（Ｄ，Ａ，Ｖ，Ｑ，Ｎ）、２９６位（Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｒ，Ｈ，Ｗ，Ｍ）、３０６位（Ｖ，Ａ，Ｓ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｔ）、３０９位（Ａ，Ｇ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｃ）、３１０位（Ｆ，Ａ，Ｃ，Ｗ，Ｍ）、３１３位（Ｖ，Ｔ，Ａ，Ｇ，Ｌ，Ｉ，Ｃ）、３１４位（Ｇ，Ａ，Ｅ，Ｈ，Ｍ，Ｓ，Ｗ，Ｑ）、及び３１５位（Ｖ，Ａ，Ｃ，Ｉ，Ｍ，Ｌ，Ｔ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  18. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変が、サーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも１つの改変でかつ１５％未満は、次の評価基準［すなわち、
    ａ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．９以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．０以上である、位置、
    ｂ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．８以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．２以上である、位置、
    ｃ）前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するＰＩが１．５以上である、位置］のうち少なくとも１つを満たしており、並びに
    前記改変が、３位（Ｇ，Ｙ）、６位（Ｔ，Ｃ，Ｖ）、７位（Ｖ，Ｌ，Ｉ）、２０位（Ｉ，Ｌ，Ｖ）、２３位（Ｔ，Ｆ，Ｗ）、２４位（Ｙ，Ｗ）、４４位（Ａ，Ｃ）、４８位（Ｔ，Ｅ，Ｄ）、５０位（Ｌ，Ｐ）、５７位（Ｄ，Ｋ）、６３位（Ｆ，Ｙ，Ｃ）、７２位（Ｄ，Ｆ，Ｗ）、７５位（Ｙ，Ａ）、８１位（Ｙ，Ｆ）、９２位（Ｓ，Ｌ）、９３位（Ｙ，Ｔ，Ｃ）、９４位（Ｄ，Ｔ）、１００位（Ｉ，Ｌ，Ｖ）、１０２位（Ｓ，Ｇ，Ｎ）、１０３位（Ｓ，Ｔ）、１０４位（Ｖ，Ａ）、１１０位（Ｙ，Ｌ）、１１７位（Ｇ，Ｈ）、１２０位（Ｍ，Ｌ）、１３４位（Ｓ，Ａ，Ｐ）、１３５位（Ｇ，Ａ）、１３６位（Ｇ，Ａ，Ｓ）、１４０位（Ｖ，Ｄ）、１４４位（Ｌ，Ｔ）、１５３位（Ａ，Ｔ）、１７３位（Ｇ，Ａ，Ｃ）、１７４位（Ｔ，Ｃ，Ａ）、１７５位（Ｌ，Ｈ，Ｓ）、１７８位（Ｆ，Ｈ，Ｙ）、１８３位（Ｎ，Ｓ）、１８５位（Ｄ，Ｅ）、１８９位（Ｇ，Ａ）、１９３位（Ｙ，Ｆ）、２０１位（Ｓ，Ｃ，Ａ）、２２３位（Ｇ，Ｄ，Ｋ）、２３０位（Ｖ，Ａ）、２３８位（Ｎ，Ｌ，Ｍ）、２３９位（Ｋ，Ａ）、２４１位（Ａ，Ｌ，Ｓ）、２４７位（Ｇ，Ａ，Ｓ）、２５１位（Ｙ，Ｍ）、２６０位（Ｒ，Ａ，Ｎ）、２６２位（Ｋ，Ａ）、２６９位（Ｒ，Ｖ，Ｋ）、及び２８５位（Ｒ，Ｋ，Ｙ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  19. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変が、組み合わせ可能な活性を有する変異であり、前記組み合わせ可能な活性を有する位置で試験された前記改変のうち少なくとも１つの改変は、次の評価基準［すなわち、
    前記親酵素サーモリシンに対して、発現及び洗剤安定性又は熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性に関する最小ＰＩが１．５以上である、位置］を満たしており、並びに
    前記組み合わせ可能な活性を有する位置が、１７位、１９位、２４位、２５位、３１位、３３位、４０位、４８位、７３位、７９位、８０位、８１位、８５位、８６位、８９位、９４位、１０９位、１１７位、１４０位、１４１位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５６位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６８位、１７１位、１７４位、１７５位、１７６位、１７８位、１８０位、１８１位、１８２位、１８３位、１８９位、２０５位、２０６位、２０７位、２１０位、２１２位、２１３位、２１４位、２１８位、２２３位、２２４位、２２７位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４１位、２４４位、２４６位、２４８位、２４９位、２５０位、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、２５８位、２５９位、２６０位、２６１位、２６２位、２６６位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２７３位、２７４位、２７６位、２７８位、２７９位、２８０位、２８２位、２８３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、３００位、３０２位、３０６位、３１０位、及び３１２位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  20. 前記親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変が、組み合わせ可能な活性を有する変異であり、前記組み合わせ可能な活性を有する位置で試験された前記改変のうち少なくとも１つの改変は、次の評価基準［すなわち、
    前記親酵素サーモリシンに対して、発現及び洗剤安定性又は熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性に関する最小ＰＩが１．５以上である、位置］を満たしており、並びに
    前記組み合わせ可能な活性を有する位置が、１７位、１９位、２４位、２５位、３１位、３３位、４０位、４８位、７３位、７９位、８０位、８１位、８５位、８６位、８９位、９４位、１０９位、１１７位、１４０位、１４１位、１５０位、１５２位、１５３位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６８位、１７１位、１７４位、１７５位、１７６位、１７８位、１８０位、１８１位、１８２位、１８３位、１８９位、２０５位、２０６位、２０７位、２１０位、２１２位、２１３位、２１４位、２１８位、２２３位、２２４位、２２７位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４１位、２４４位、２４６位、２４８位、２４９位、２５０位、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、２５８位、２５９位、２６０位、２６１位、２６２位、２６６位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２７３位、２７４位、２７６位、２７８位、２７９位、２８０位、２８２位、２８３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、３００位、３０２位、３０６位、３１０位、及び３１２位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、請求項１３に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  21. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変が、組み合わせ可能な活性を有する変異であり、前記組み合わせ可能な活性を有する位置で試験された前記改変のうち少なくとも１つの改変は、次の評価基準［すなわち、
    前記親酵素サーモリシンに対して、発現及び洗剤安定性又は熱安定性に関する最小性能指数（ＰＩ）が０．５以上であり、前記親酵素サーモリシンに対して、ｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性に関する最小ＰＩが１．５以上である、位置］を満たしており、並びに
    前記改変が、１７位（Ｅ，Ｆ，Ｐ）、１９位（Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｉ，Ｒ，Ｔ，Ｖ）、２４位（Ｆ，Ｈ）、２５位（Ｈ）、３１位（Ｌ）、３３位（Ｑ）、４０位（Ｃ）、４８位（Ａ，Ｒ）、７３位（Ｙ）、７９位（Ｃ）、８０位（Ｃ，Ｒ）、８１位（Ｈ）、８５位（Ｃ，Ｍ，Ｙ）、８６位（Ｖ）、８９位（Ｋ，Ｒ，Ｔ，Ｖ）、９４位（Ｅ）、１０９位（Ｄ）、１１７位（Ａ，Ｋ，Ｒ，Ｔ）、１４０位（Ｓ）、１４１位（Ｔ）、１５０位（Ｅ，Ｍ，Ｗ）、１５１位（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｉ）、１５２位（Ｄ）、１５３位（Ｖ）、１５６位（Ｈ，Ｒ）、１５８位（Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｖ）、１５９位（Ｆ，Ｉ，Ｋ）、１６０位（Ｓ）、１６１位（Ｙ）、１６８位（Ｎ）、１７１位（Ｄ）、１７４位（Ｓ，Ｖ）、１７５位（Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ）、１７６位（Ｅ，Ｑ）、１７８位（Ｃ，Ｍ）、１８０位（Ｌ，Ｗ）、１８１位（Ｙ）、１８２位（Ｆ，Ｒ）、１８３位（Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｑ，Ｒ，Ｔ）、１８９位（Ｃ）、２０５位（Ｃ，Ｆ）、２０６位（Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）、２０７位（Ｔ）、２１０位（Ａ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｔ）、２１２位（Ｆ，Ｈ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ｔ）、２１３位（Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｖ，Ｙ）、２１４位（Ｑ）、２１８位（Ｒ）、２２３位（Ｙ）、２２４位（Ｉ，Ｒ）、２２７位（Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｋ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ）、２３５位（Ｄ，Ｌ，Ｔ）、２３６位（Ｐ）、２３７位（Ａ，Ｑ）、２３８位（Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｓ）、２３９位（Ｃ，Ｇ，Ｈ，Ｌ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｖ，Ｙ）、２４１位（Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｔ，Ｖ）、２４４位（Ｑ）、２４６位（Ｋ，Ｒ）、２４８位（Ｃ，Ｈ）、２４９位（Ｇ，Ｖ）、２５０位（Ｆ，Ｓ）、２５１位（Ｈ）、２５２位（Ｆ，Ｉ，Ｌ）、２５３位（Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｐ）、２５４位（Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｐ）、２５５位（Ｆ，Ｑ）、２５８位（Ｆ）、２５９位（Ｉ）、２６０位（Ｃ，Ｄ，Ｉ）、２６１位（Ｋ，Ｒ，Ｔ）、２６２位（Ｃ，Ｆ，Ｈ，Ｌ，Ｐ，Ｒ）、２６６位（Ｗ）、２６８位（Ｆ，Ｒ）、２６９位（Ｐ，Ｔ，Ｗ，Ｙ）、２７０位（Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｖ）、２７１位（Ｖ）、２７２位（Ｒ）、２７３位（Ｒ）、２７４位（Ｄ，Ｅ）、２７６位（Ｇ，Ｓ）、２７８位（Ｖ）、２７９位（Ｅ）、２８０位（Ｐ，Ｒ，Ｖ）、２８２位（Ｐ）、２８３位（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｔ，Ｖ）、２９４位（Ｔ）、２９５位（Ｒ）、２９６位（Ｅ，Ｉ）、２９７位（Ｉ，Ｖ）、３００位（Ｑ）、３０２位（Ｗ）、３０６位（Ｙ）、３１０位（Ｉ，Ｎ）、及び３１２位（Ｑ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  22. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記サーモリシン酵素変異体が、前記親酵素サーモリシンに比べて改善されたｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性又は洗剤安定性若しくは熱安定性を有し、前記改変が、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列中の残基全てに関する主鎖平均温度因子よりも観測された分散の１．５倍分より大きい温度因子を有する位置で生じ、並びに
    残基位置が、１位、２位、１２７位、１２８位、１８０位、１８１位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２１１位、２２３位、２２４位、２９８位、２９９位、３００位、及び３１６位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  23. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記サーモリシン酵素変異体が、前記親酵素サーモリシンに比べて改善されたｐＨ６又はｐＨ８でのＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄、Ａｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性又は洗剤安定性若しくは熱安定性を有し、前記改変が、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列中の残基全てに関する主鎖平均温度因子よりも観測された分散の１．５倍分より大きい温度因子を有する位置で生じ、並びに
    残基位置が、１位、２位、１２７位、１８０位、１８１位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２１１位、２２３位、２２４位、２９８位、２９９位、３００位、及び３１６位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  24. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記サーモリシン酵素変異体が、前記親酵素サーモリシンに比べて改善された洗剤安定性若しくは熱安定性を有し、前記改変が、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列中の残基全てに関する主鎖平均温度因子よりも観測された分散の１．５倍分より大きい温度因子を有する位置で生じ、
    前記改変が、１位（Ｉ，Ｖ）、２位（Ｔ，Ｃ，Ｉ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｖ）、１２７位（Ｇ，Ｃ）、１２８位（Ｑ，Ｅ，Ｆ）、１８０位（Ａ，Ｅ，Ｎ）、１８１位（Ｎ，Ａ，Ｇ，Ｑ，Ｓ）、１９６位（Ｇ，Ｌ，Ｙ）、１９７位（Ｉ，Ｆ）、１９８位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）、２１１位（Ｙ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ）、２２４位（Ｔ，Ｄ，Ｈ，Ｙ）、２９８位（Ｓ，Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｗ，Ｙ）、２９９位（Ｔ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｗ）、及び３１６位（Ｋ，Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｙ）からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  25. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変は、生産的変異であり、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも１つの改変は、次の評価基準［すなわち、
    前記親酵素サーモリシンに対して、発現、洗剤安定性、熱安定性、ＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄活性、又はＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性のパラメータのうち少なくとも３種に関する最小性能指数（ＰＩ）が１以上である、位置］を満たしており、並びに
    組み合わせ可能な活性を有する位置は、００２位、０４８位、０６３位、０８７位、０９６位、１８０位、１９８位、２４４位、２７７位、２８３位、２９３位、２９５位、２９８位、及び３０１位からなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  26. 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変は、生産的変異であり、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも１つの改変は、次の評価基準［すなわち、
    前記親酵素サーモリシンに対して、発現、洗剤安定性、熱安定性、ＰＡＳ−３８微小布見本の洗浄活性、又はＡｂｚ−ＡＧＬＡ−Ｎｂａに対する活性のパラメータのうち少なくとも３種に関する最小性能指数（ＰＩ）が１以上である、位置］を満たしており、並びに
    組み合わせ可能な活性を有する位置は、Ｔ００２Ｉ、Ｔ００２Ｍ、Ｔ０４８Ｅ、Ａ０５８Ｌ、Ｆ０６３Ｃ、Ｖ０８７Ｌ、Ｎ０９６Ｈ、Ａ１８０Ｅ、Ｓ１９８Ａ、Ｉ２４４Ｔ、Ｐ２７７Ｒ、Ｔ２７８Ｒ、Ｑ２８３Ｅ、Ｔ２９３Ｌ、Ｔ２９３Ｎ、Ｌ２９５Ｆ、Ｓ２９８Ａ、及びＱ３０１Ｉからなる群から選択される（ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号３で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  27. 前記変異体がＭ４ペプチダーゼである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  28. 前記変異体がＭＡクランの一メンバーである、請求項２７に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  29. 前記変異体が、ＰｅｐＳＹ〜ペプチダーゼ＿Ｍ４〜ペプチダーゼ＿Ｍ４＿Ｃファミリーの一メンバーである、請求項２７に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  30. 前記変異体が、配列番号３に記載のサーモリシンと少なくとも５０％の同一性を有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
  31. 前記サーモリシン酵素変異体が、バチルス属、ゲオバチルス種、アリシクロバチルス属、乳酸桿菌、エクシグオバクテリウム属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、ヘルペトシフォン属、オセアノバチルス属、シュワネラ属、クロストリジウム属、ブドウ球菌属、フラボバクテリウム属、スチグマテラ属、ミクソコッカス属、ビブリオ属、メタノサルシナ属、クリセオバクテリウム属、ストレプトマイセス属、クリベラ属、ジャニバクター属、ノカルジオイデス属、ザントモナス属（Xanthamonas）、ミクロモノスポラ属、バークホルデリア属、デハロコッコイデス属、クロセイバクター、コルジア属、マイクロシーラ属、サーモアクチノミセス属、クロロフレクサス属、リステリア属、プレシオシスチス属、ハリスコメノバクター属、サイトファーガ属、ハヘラ属、アルスロバクター属、ブラキバクテリウム属、クラビバクター属、ミクロバクテリウム属、イントラスポランギウム属、フランキア属、メイオテルムス属、シュードモナス属、トウゴマ属、カテヌリスポラ属、アナベナ属、ノストック属、ハロモナス属、クロモハロバクター属、ボルデテラ属、バリオボラックス属、ディケヤー属、ペクトバクテリウム属、シトロバクター属、エンテロバクター属、サルモネラ属、エルウィニア属、パントエア属、ラーネラ属、セラチア属、ゲオデルマトフィルス属、ゲンマタ属、ゼノラブダス属、フォトラブダス属、アスペルギルス属、ネオサルトリア属、ピレノフォラ属、サッカロポリスポラ属、ネクトリア属、ジベレラ属、メタリジウム属、ワドリア属、シアノセイス属、セルロファーガ属、プロビデンシア属、ブラディリゾビウム属、アグロバクテリウム属、ムシラジニバクター（Mucilaginibacter）、セラチア属、ソランジウム属、ストレプトスポランジウム属、レニバクテリウム属、アエロモナス属、レイネケア属、クロモバクテリウム属、モリテラ属、ハリアンギウム属、カンギエラ属、マリノモナス属、ビブリオナレス属、リストネラ属、サリニビブリオ属、フォトバクテリウム属、アルテロモナダーレス属、レジオネラ属、テレディニバクター属、レイネケア属、ヒドロゲニビルガ属、及びシュードアルテロモナス属からなる群から選択される一つの属に由来するものである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体。
  32. 前記サーモリシン酵素変異体が、バチルス属、ゲオバチルス種、アリシクロバチルス属、乳酸桿菌、エクシグオバクテリウム属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、ヘルペトシフォン属、オセアノバチルス属、シュワネラ属、クロストリジウム属、ブドウ球菌属、フラボバクテリウム属、スチグマテラ属、ミクソコッカス属、ビブリオ属、メタノサルシナ属、クリセオバクテリウム属、及びシュードアルテロモナス属からなる群から選択される一つの属に由来するものである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体。
  33. 前記サーモリシン酵素変異体が、バチルス属に由来するものである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体。
  34. 請求項１〜３３のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体を少なくとも１種含む、クリーニング組成物。
  35. 前記クリーニング組成物が、粒状、粉末、固体、棒状、液体、錠剤型、ゲル又はペースト組成物である、請求項３４に記載のクリーニング組成物。
  36. 前記クリーニング組成物が洗剤組成物である、請求項３４又は３４に記載のクリーニング組成物。
  37. 前記クリーニング組成物が、洗濯洗剤組成物、食器用洗剤組成物、又は硬質表面用クリーニング組成物である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のクリーニング組成物。
  38. 前記食器用洗剤が、食器手洗い用洗剤組成物又は自動食器洗浄用洗剤組成物である、請求項３６に記載のクリーニング組成物。
  39. 前記クリーニング組成物が洗濯洗剤組成物である、請求項３６に記載のクリーニング組成物。
  40. 少なくとも１種の漂白剤を更に含む、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載のクリーニング組成物。
  41. 前記クリーニング組成物がリン酸塩を含まない、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 前記クリーニング組成物がリン酸塩を含有する、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 少なくとも１種の追加の酵素を更に含む、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載のクリーニング組成物。
  44. 前記少なくとも１種の追加の酵素が、アシルトランスフェラーゼ、αアミラーゼ、βアミラーゼ、αガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、βガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エクソマンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、βグルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼ、追加のメタロプロテアーゼ酵素、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４３に記載のクリーニング組成物。
  45. 表面又は物品を、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体を少なくとも１種含むクリーニング組成物と接触させる工程を含む、クリーニング方法。
  46. 表面又は物品を、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載のクリーニング組成物と接触させる工程を含む、クリーニング方法。
  47. 前記表面又は物品をそれぞれ前記クリーニング組成物と接触させた後に、前記表面又は物品をすすぐ工程を更に含む、請求項４５又は４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記物品が食器である、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記物品が布である、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記表面又は物品をそれぞれ前記クリーニング組成物と接触させた後に、前記表面又は物品をすすぐ工程を更に含む、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記表面又は物品をすすぐ工程の後に、前記表面又は物品を乾燥する工程を更に含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 請求項３４〜４４のいずれか一項に記載のクリーニング組成物及びクリーニングが必要な表面又は物品を準備する工程と；前記クリーニング組成物と、前記クリーニングが必要な表面又は物品とを、前記表面又は物品の洗浄に適した条件下で接触させて、洗浄された表面又は物品を生じさせる工程とを含む、表面又は物品をクリーニングする方法。
  53. 前記洗浄された表面又は物品をすすいで、すすがれた表面又は物品を生じる工程を更に含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記すすがれた表面又は物品を乾燥する工程を更に含む、請求項５２又は５３のいずれか一項に記載の方法。
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