CN114317341B - 一株可产乳糖酶的哈维氏弧菌变种及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株可产乳糖酶的哈维氏弧菌变种，菌株编号为BHNC004002，所述菌株于2021年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No：M20211247。本发明还提供了一株哈维氏弧菌变种在表达乳糖酶中的应用，其表达的乳糖酶酶活温度和酶活PH值适应范围广。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一株可产乳糖酶的哈维氏弧菌变种及其应用。
背景技术
乳糖酶(lactase)，学名β-半乳糖苷半乳糖水解酶，又名β-半乳糖苷酶，是一种白色粉末，无味道，无嗅。乳糖酶通过特定条件催化β—半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷键发生水解，将人体内过多的乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，易被肠道吸收。目前乳糖酶根据不同来源可分为胞内酶或胞外酶，如乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根酶等产乳糖酶均为胞外酶，脆壁克鲁维酵母和大部分细菌产胞内酶。乳酸克拉维酵母菌乳糖酶的最适PH6.0-7.0；最适温度40-45℃，此酶适合于牛乳和甜乳清的加工处理。由黑曲霉制备的乳糖酶最适PH3.5-4.0，最适温度60-65℃，适于加工处理干酪和酸性乳清。由米曲霉生产的乳糖酶最适温度为50-55℃，在PH值为3.5-6.0范围内可应用，适于加工处理牛乳和酸乳，该酶在70℃时热处理很快失活。
哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，是一种革兰氏阴性菌，呈杆状或短杆状，发光的海洋细菌，广泛分布于海洋环境中。哈维氏弧菌作为发光细菌和水产养殖生物的条件性致病菌，哈维氏弧菌在近十多年得到了广泛的研究。哈维氏弧菌在无盐培养基中不生长，在含盐营养琼脂平板上生长良好。其中在TCBS平板上生长，菌落呈黄色圆形，且不透明；在普通琼脂培养基上为灰白色圆形。现有技术中公开有哈维氏弧菌能表达分泌金属蛋白酶、几丁质酶和磷脂酶等，较少存在有关哈维氏弧菌能够表达乳糖酶研究的报导。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一株可产乳糖酶的哈维氏弧菌变种(Vibrioharveyi)，菌株编号为BHNC004002，所述菌株于2021年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为武汉，保藏编号为CCTCC No：M20211247。
可选地，所述哈维氏弧菌变种的16S rDNA序列为SEQ ID NO.1。
可选地，所述哈维氏弧菌变种是从海南博鳌港海域(E110.60848，N19.186684)的海水中分离得到的。
本发明要解决的技术问题之二是提供一株哈维氏弧菌变种在表达乳糖酶中的应用。
可选地，所述哈维氏弧菌变种表达的乳糖酶酶活温度范围为20-70℃。
可选地，所述哈维氏弧菌变种表达的乳糖酶酶活温度范围为30-50℃。
可选地，所述哈维氏弧菌变种表达的乳糖酶酶活温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃或70℃。
可选地，所述哈维氏弧菌变种表达的乳糖酶酶活PH值作用范围为3.0-7.7。
可选地，所述哈维氏弧菌变种表达的乳糖酶酶活PH值作用范围为5.0-7.5。
可选地，所述哈维氏弧菌变种表达的乳糖酶酶活PH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或7.7。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明分离和鉴定了一株可产乳糖酶的哈维氏弧菌变种(Vibrio harveyi)，更具体的为本发明鉴定了一株可产乳糖酶的哈维氏弧菌海南变种。通过基因组序列分析和构建系统发育树，确定该菌株为哈维氏弧菌，菌株编号为BHNC004002。
2、与现有技术相比，本发明获得的哈维氏弧菌变种生产表达的乳糖酶酶活温度和酶活PH值适应范围广。本发明中哈维氏弧菌变种生产表达的乳糖酶的热稳定性大于现有技术中乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉和脆壁克鲁维酵母生成的乳糖酶，对乳糖有较高活性的乳糖酶产生菌在大规模推进工业化生产上具有重大意义。
附图说明
图1为本发明实施例中从海南博鳌港取回的海水样品图；
图2为本发明实施例中培养获得的哈维氏弧菌变种的菌落形态图；
图3为本发明实施例中哈维氏弧菌变种的系统发育树图；
图4为本发明实施例中乳糖酶在不同PH值下酶活的影响图；
图5为本发明实施例中乳糖酶在不同温度下酶活的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1哈维氏弧菌变种(Vibrio harveyi)菌株的获得
1.菌株筛选
取从海南博鳌港海域(E110.60848，N19.186684)带回的海水样品原液涂布与LB固体培养基，培养基中加入2‰的X-Gal，将LB平板置于30℃培养箱中倒置培养2-4天，之后从平板上挑选显蓝色的单菌落，转移至新的LB固体培养基上，获得纯化后的菌株如图2所示。将纯化后的菌株接种到LB液体培养基中，摇床培养(30℃，245rpm)，与12h后取菌液添加甘油保存于-80℃冰箱，并在48h、96h分别取样测乳糖酶酶活。
筛选得到的哈维氏弧菌菌株，由于其在LB平板培养基(含2‰的X-Gal)上产生了最明显的蓝斑，所以该菌株是乳糖酶产酶菌，并且所产的乳糖酶具有较好的PH，温度适应性，由此我们将菌株保藏在了中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉，保藏日期为：2021年10月11日，保藏编号为：CCTCC M 20211247。
实施例2哈维氏弧菌变种(Vibrio harveyi)菌株的基因序列分析
1、菌株的鉴定：首先采用试剂盒抽提法提取菌株的16S rDNA，通过PCR扩增，通用引物806R和16S-515F进行PCR扩增，PCR反应体系为：Mix(dNTP、酶、Mg 2+、10×buffer)25μL，806R引物2μL，16S-515F引物2μL，菌液模板2μL，无菌水19μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。利用EasyPure PCR Purification Kit纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)对目的PCR产物进行回收纯化。然后进行全长测序，测得的序列如SEQ ID NO：1所示。运用NCBI中的Blast程序与数据库中的细菌16S rDNA序列进行相似性比对。得出该菌株为哈维氏弧菌。
2、构建菌株的系统发育树：获得菌株的16S rDNA后，用MEGA 5.1软件构建该菌株的系统发育树(见图3)，分析各菌株的进化关系。该菌株为哈维氏弧菌，菌株编号BHNC004002。
实施例3哈维氏弧菌变种(Vibrio harveyi)菌株表达的乳糖酶的酶活力最适作用PH
酶活力单位的定义：一个酶活单位(NLU)定义为在反应条件下释放1.30μmol/min的邻硝基苯酚所需的酶量。
酶活测定方法：邻硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)溶于P-E-M缓冲液中(pH值为6.5)配制成质量分数为0.25％的底物溶液。取5ml底物溶液加入1mlL酶液中，30℃保温10min。加入2mL碳酸钠溶液显色，测定420nm光吸收值。计算水解产物邻硝基酚(ONP)的含量和酶活性。
取酶液分别用pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.7以及8.0的缓冲液稀释，测定酶活力，相对酶活力变化曲线如图4所示，乳糖酶在pH 5.5时的酶活力最高，pH适用范围为3.0-7.0。
实施例4哈维氏弧菌表达的乳糖酶的酶活力最适作用温度
在pH值为5.5条件下，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃以及80℃下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图5所示，酶的最适作用温度为40℃。在作用温度小于20℃和高于80℃的情况下，哈维氏弧菌表达的乳糖酶的相对酶活力下降到20以下。
由此可见，本发明提供的一种哈维氏弧菌表达的乳糖酶的PH和温度适应范围很广。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波希诺亚海洋生物科技有限公司
<120> 一株可产乳糖酶的哈维氏弧菌变种及其应用
<130> 2021.11.11
<141> 2021-11-16
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 263
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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gcgaacaccc cccctggaca gatactgaca ctcagatgcg aaaggtggcg cgcaaacagg 240
attagcgacc atggtagtcc att 263
Claims (6)
1.一株可产乳糖酶的哈维氏弧菌变种（Vibrio harveyi），其特征在于：菌株编号为BHNC004002，所述菌株于2021年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No：M20211247，所述哈维氏弧菌变种的16S rDNA 序列为SEQ ID NO.1。
2.一种权利要求1所述的哈维氏弧菌变种在表达乳糖酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述哈维氏弧菌变种表达的乳糖酶酶活温度范围为20-70℃。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述哈维氏弧菌变种表达的乳糖酶酶活温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃或70℃。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述哈维氏弧菌变种表达的乳糖酶酶活PH值作用范围为3.0-7.7。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述哈维氏弧菌变种表达的乳糖酶酶活PH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或7.7。
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| 酶的食品保健作用综述;李维静;;安徽农学通报(第10期);全文 * |
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