CN105039215B - 一株产木聚糖酶的芽孢杆菌及其应用和筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产木聚糖酶的芽孢杆菌及其应用和筛选方法，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏登记入册的编号为CCTCC NO:2015308，保藏日期为2015年5月17日。该菌株生产的木聚糖酶具有宽pH稳定性，pH 5.0～9.0范围内相对酶活均在50％以上，具有较为稳定的木聚糖酶活性。该菌株能将木聚糖酶分泌到胞外，使其容易从培养基中提取，由此得到的木聚糖酶能够在纸浆漂白、动物饲料、食品工业和能源工业中应用。

Description

一株产木聚糖酶的芽孢杆菌及其应用和筛选方法

技术领域

本发明涉及微生物及其应用领域，特别是涉及一株产木聚糖酶的芽孢杆菌及其应用和筛选方法。

背景技术

木聚糖酶(1,4-β-D-xylanase；EC 3.2.1.8)是一种重要的工业用酶，在造纸工业、食品、饲料和能源等领域中具有重要的应用价值。木聚糖酶在造纸工业上可作为纸浆漂白助剂，可以提高纸张的白度和强度，减少传统氯化物漂白剂的实用；在动物饲料中添加木聚糖酶，可以降解木聚糖，提高动物对饲料的利用率；在食品工业上，木聚糖酶还可以用于澄清果汁饮料，改良面包松软度。利用木聚糖酶降解木聚糖还可以得到低聚木糖，低聚木糖可以促进人体大肠中益生菌的增殖，改善肠道功能。自然界中，不同来源的木聚糖酶的酶活特性有很大的差异，有着各自特异的最适反应pH和最适作用温度。但是，多数木聚糖酶最适反应pH值在4.0～6.0，较窄的最适反应pH限制了木聚糖酶在工业上的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一株产木聚糖酶的芽孢杆菌及其应用和筛选方法，以克服现有技术中存在的问题。

基于上述目的，本发明提供的产木聚糖酶的芽孢杆菌Bacillus sp.LUX8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏登记入册的编号为CCTCCNO:2015308，保藏日期为2015年5月17日。

在本发明的一些实施例中，所述菌株发酵生产的木聚糖酶的酶解温度为30～50℃。

在本发明的一些实施例中，所述菌株发酵生产的木聚糖酶的酶解pH为5.0～9.0。

本发明还提供上述产木聚糖酶的芽孢杆菌的应用，将所述芽孢杆菌发酵，收集发酵产物，即得到木聚糖酶。

本发明还提供上述产木聚糖酶的芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：

将样品溶解在磷酸缓冲液中，取上清液；

将所述上清液稀释后涂布接种于琼脂平板生长培养基R2A，选择直径中等，形态边缘整齐、中间凹陷，颜色呈灰白色的菌落；

将获得的菌落转接到木聚糖筛选平板培养基上培养，培养后以Gram iodinesolution染色，筛选得到木聚糖酶活性最高的菌株，即为芽孢杆菌Bacillus sp.LUX8。

在本发明的一些实施例中，所述琼脂平板生长培养基R2A含有：0.4-0.6g/L酵母提取物，0.4-0.6g/L蛋白胨，0.4-0.6g/L酪蛋白，0.4-0.6g/L葡萄糖，0.4-0.6g/L可溶性淀粉，0.2-0.4g/L磷酸氢二钾，0.4-0.6g/L七水硫酸镁，0.2-0.4g/L丙酮酸钠，10.0-20.0g/L琼脂糖。

从上面所述可以看出，本发明提供的芽孢杆菌Bacillus sp.LUX8是从动物肠胃中分离得到的，于2015年5月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:2015308。该菌株生产的木聚糖酶具有宽pH稳定性，pH 5.0～9.0范围内相对酶活均在50％以上，具有较为稳定的木聚糖酶活性。分别用500μg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶A，37℃处理1小时对该菌生产的木聚糖酶活性没有显著影响。而且，本发明提供的菌株能将木聚糖酶分泌到胞外，使其容易从培养基中提取，由此得到的木聚糖酶能够在纸浆漂白、动物饲料、食品工业和能源工业中应用。

附图说明

图1为本发明实施例芽孢杆菌LUX8生产的木聚糖酶在不同反应pH下的相对酶活力；

图2为本发明实施例芽孢杆菌LUX8生产的木聚糖酶在不同反应温度下的相对酶活力。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

实施例1芽孢杆菌的分离鉴定

从加拿大安大略省动物屠宰场采集牛胃中的样品，分别取样品1克溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，涡旋摇匀，静止30分钟，让残渣下沉，取上清液稀释100倍，涂布接种于琼脂平板生长培养基R2A(0.5g/L酵母提取物，0.5g/L蛋白胨，0.5g/L酪蛋白，0.5g/L葡萄糖，0.5g/L可溶性淀粉，0.3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L七水硫酸镁，0.3g/L丙酮酸钠，15.0g/L琼脂糖)。28℃培养，分别培养24、48、72小时后观察平皿中生长的单菌落菌直径大小、形态和颜色。选择菌落直径中等，形态边缘整齐、中间凹陷，颜色均匀的菌落。将获得的菌落反复进行平板划线分离，以获得纯化的菌株，供进一步筛选用。需要说明的是，当牛消化食物(例如草料)时，牛胃中含有将草料等分解为木聚糖酶的菌，样品中即含有该菌。

用牙签挑取纯化后的细菌单菌落，将其转接到木聚糖筛选平板培养基上(1g/L硝酸钠，1g/L氯化钾，1g/L磷酸氢二钾，0.5g/L七水硫酸镁，0.5g/L木聚糖，15.0g/L琼脂糖)，28℃培养48小时。48小时后以Gram iodine solution(2.0g KI and 1.0g I,300ml ddH₂O)染色，染色后置于28℃条件下培养5分钟。5分钟后测量对比透明圈直径大小，透明圈大说明产木聚糖酶高、分解木聚糖的能力大。含有木聚糖的培养基呈褐色浑浊，木聚糖被木聚糖酶分解后培养基呈无色透明状。因此通过对比透明圈直径的大小可以直观对比木聚糖酶活性差异。筛选得到木聚糖酶活性最高的菌株，命名为LUX8。

将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏登记入册的编号为CCTCC NO:2015308，保藏日期为2015年5月17日。

在本发明的另一实施例中，上述琼脂平板生长培养基R2A含有：0.4g/L酵母提取物，0.4g/L蛋白胨，0.55g/L酪蛋白，0.45g/L葡萄糖，0.42g/L可溶性淀粉，0.4g/L磷酸氢二钾，0.5g/L七水硫酸镁，0.35g/L丙酮酸钠，18.0g/L琼脂糖。

在本发明的另一实施例中，上述琼脂平板生长培养基R2A含有：0.6g/L酵母提取物，0.52g/L蛋白胨，0.4g/L酪蛋白，0.5g/L葡萄糖，0.6g/L可溶性淀粉，0.25g/L磷酸氢二钾，0.6g/L七水硫酸镁，0.28g/L丙酮酸钠，18.0g/L琼脂糖。

实施例2 16S rDNA检测分析

将筛选得到的LUX8在LB培养基中28℃培养24小时，取培养液2ml离心弃上清，用基因组提取试剂盒(Norgen Biotek,加拿大)，提取细菌基因组DNA。以该DNA为模板，采用16SrRNA通用引物HAD-1(5’-GACTCCTACGGGAGGCAGCAGT)，E1115R(5’-AGGGTTGCGCTCGTTGCGGG)进行PCR反应，扩增菌体16S rRNA基因序列。20μl的反应体系含PCR缓冲液2μl，正反引物1μM,Mg²⁺2.5mM,dNTP0.02mM,Taq DNA聚合酶0.5U。反应条件为：95℃,5min；94℃,30s；55℃，30s；72℃，1min，30cycles；最后72℃，10min。

反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测、分离PCR产物，割胶回收目的片段进行测序分析，部分序列如SEQ ID NO.1。将序列正NCBI上进行同源序列对比搜索(Nucleitide-Nucleitide Blast)，结果表明，该菌株16S rRNA与Bacillus sp.的16S rRNA最为相似，具有92％的序列同源性。因此鉴定筛选得到的具有高木聚糖酶活性的菌株LUX8为Bacillussp..

部分16S rRNA的序列如下：

ACGGTGCTAACGCGCGTGAGTATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTTACTGCTCGCACCCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCCGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGTCAACCGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGAGAAGAGGAGATGGATTCCACGTGTAGCGTGAAATGCGAGAGTGGGAGGACACATGGCGAAGGGACTCTTGGCTGAACTGACGTGAGGAGGAAGGGGGGGCAACGGTTAGTACCCTGTAGCCACCCGAACATGATCAATTTAGGGGTTCGCCCTAGGTGACAACGATAGCCCCCCTGGGGCGGCCAGTAATCAAGATTGCGGGCCCCACGGACTTGTATTGAGACCGAGACTACAGCTGCTCTTAACTGAAGTTCCTCGGAAATAAGGGTGTTCGACCGGCGGAATGTATCGAGGCAATCGCTCGAGTA

实施例3本发明提供的芽孢杆菌LUX8的酶学特性

将LUX8在LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)培养24小时后收集菌液，离心取上清用于测定木聚糖酶活性。

木聚糖酶的活性检测方法简述如下：

测定底物：1.0％山毛榉木木聚糖(Beech wood xylan，Sigma)；

标准曲线：分别吸取0mM，1mM，2mM，3mM，4mM和5mM木糖标准液，加入等体积DNS，沸水中沸腾5分钟，取出冷却后，于波长540nm测定吸光值，根据获得的吸光值绘制标准曲线。

酶活测定：取1.5ml离心管，加入100μl木聚糖底物溶液，95μl pH缓冲液，5μl酶液，40℃保温10min，加入200μl DNS，摇匀后沸水浴5min，冷却后于波长540nm测定吸光值，以0min反应时间为空白对照。

木聚糖酶活性定义为：在40℃,相应pH条件下，1min水解木聚糖底物产生出相当于1μmol葡萄糖的还原糖量为一个酶活力单位。酶活测定时选用的底物为山毛榉木木聚糖(Beech wood xylan，Sigma)，利用二硝基水杨酸(DNS)方法检测还原糖。测定结果显示，在pH 7.0的情况下LUX8培养液上清酶活为820U/mL。

1)酶初提液最适pH测定：

木聚糖酶于各种不同pH的缓冲液(pH 3-6，柠檬酸缓冲液；pH 7-8磷酸缓冲液；pH9-10甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)中室温处理60min后进行酶促反应测定其最适pH，底物为1w/w％木聚糖。结果参见图1(以最高酶活力为100％，其它pH下的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以pH值为横坐标，相对酶活力为纵坐标)，由图1可知，木聚糖酶在pH 5-9的范围内稳定，说明LUX8能生产具有宽pH范围的木聚糖酶。

2)酶初提液最适反应温度测定：

木聚糖酶的最适温度在pH 7.0磷酸缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。将木聚糖酶在不同温度下温浴60min后加入反应底物，反应10min后加入等体积DNS沸水浴5min，冷却后于波长540nm测定吸光值。结果参见图2(以最高酶活力为100％，其它pH下的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标)，由图2可知，木聚糖酶在反应温度为30～50℃时具有较高酶活性，在反应温度为40℃时具有最高酶活性。

3)酶初提液蛋白酶抗性实验：

酶初提液分别在含有500，100和50μg/mL胃蛋白酶(pH 2.5)、胰蛋白酶(pH7.0)、胶原蛋白酶(pH7.0)和蛋白酶K溶液，37℃温浴60min后测酶活性，计算相对酶活率，结果参见表1。可见，经LUX8发酵得到的木聚糖酶对胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶A具有良好的蛋白酶抗性，对蛋 白酶K具有一定的抗性，用50μg/mL蛋白酶K处理60min后，仍然保留30％的木聚糖酶活性。

表1.蛋白酶对木聚糖酶活性影响

从以上结果可以看出，本发明提供的芽孢杆菌LUX8是从动物肠胃中分离得到的，于2015年5月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:2015308。该菌株生产的木聚糖酶具有宽pH稳定性，酶粗提液最适反应pH为7.0，最适反应温度40℃；酶粗提液有较宽的pH作用范围，pH 5.0～9.0范围内相对酶活均在50％以上，具有较为稳定的木聚糖酶活性。分别用500μg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶A，37℃处理1小时对该菌生产的木聚糖酶活性没有显著影响。而且，本发明提供的菌株能将木聚糖酶分泌到胞外，使其容易从培养基中提取，由此得到的木聚糖酶能够在纸浆漂白、动物饲料、食品工业和能源工业中应用。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一株产木聚糖酶的芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏登记入册的编号为CCTCC NO:2015308，保藏日期为2015年5月21日。

2.根据权利要求1所述的产木聚糖酶的芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株发酵生产的木聚糖酶的酶解温度为30～50℃。

3.根据权利要求1所述的产木聚糖酶的芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株发酵生产的木聚糖酶的酶解pH为5.0～9.0。

4.一种根据权利要求1～3中任意一项所述的产木聚糖酶的芽孢杆菌的应用，其特征在于，将所述芽孢杆菌发酵，收集发酵产物，即得到木聚糖酶。