CN104726385B - 具有高纤维素酶活性的菌株及其应用和获得方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有高纤维素酶活性的菌株及其应用和和获得方法，所述菌株命名为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.WH1，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏登记入册的编号为CCTCC NO:M 2014236，保藏日期为2014年5月29日。本发明提供的具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌菌株WH1，从纸浆污泥中分离得到，具有更高的纤维素酶活性，能够广泛应用于食品工业、酿造业、造纸业、饲料工业、纺织工业和生物质转化，提高生物质材料转化效率，降低纤维素转化成本。

Description

具有高纤维素酶活性的菌株及其应用和获得方法
技术领域
本发明涉及一种具有纤维素酶的工程菌株，特别是指一种具有高纤维素酶活性的菌株及其应用和获得方法。
背景技术
纤维素酶是使纤维素降解生产葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶。纤维素酶的三个组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量低寡糖、双糖或单糖。纤维素酶广泛应用于食品工业、酿造业、造纸业、饲料工业、纺织工业和生物质转化。
纤维素类物质是自然界中最为丰富的可再生资源之一。利用纤维素酶可以将天然纤维素降解为可利用的糖类，再通过发酵技术转化为生物酒精或其它可利用的生物分子材料，实现生物质材料的高效利用。高效利用木质纤维素对解决资源紧张、粮食短缺和环境污染等问题具有重要意义，采用微生物处理生物质是当前的研究热点。
目前制约纤维素材料利用的关键因素之一是纤维素酶降解效率低，纤维素酶用量大，从而造成纤维素转化成本过高。因此，筛选具有高活性纤维素酶的微生物菌株对降低生物质的转化成本，提高生物质材料的转化效率具有重要的应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一株具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌及其应用和获得方法，以提高生物质材料的转化效率，降低纤维素的转化成本。
基于上述目的，本发明提供的具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌Paenibacillussp.WH1从纸浆污泥中分离得到。
所述具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌Paenibacillus sp.WH1已于2014年5月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2014236。
经16S rDNA检测分析，菌株WH1与类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)的16S rDNA最为相似，具有99％的序列同源性。因此鉴定筛选得到的具有高纤维素酶活性的菌株WH1为Paenibacillus。
本发明还提供一种获得上述具有高纤维素酶活性的菌株的方法，括以下步骤：
将纸浆污泥溶解在磷酸缓冲液中，取上清液；
将所述上清液稀释后涂布接种于琼脂平板生长培养基R2A，选择直径中等，形态边缘整齐、中间凹陷，颜色呈灰白色的菌落；
将获得的菌落在LB培养基中培养，取培养后的菌液滴于羧甲基纤维素钠平板培养基中，以大肠杆菌为阴性对照，纤维素酶生产用纤维单胞菌为阳性对照，筛选获得比阳性对照具有更高纤维素酶活性的菌株，即为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.WH1。
在本发明的一个实施例中，所述琼脂平板生长培养基R2A含有：0.4-0.6g/L酵母提取物，0.4-0.6g/L蛋白胨，0.4-0.6g/L酪蛋白，0.4-0.6g/L葡萄糖，0.4-0.6g/L可溶性淀粉，0.2-0.4g/L磷酸氢二钾，0.4-0.6g/L七水硫酸镁，0.2-0.4g/L丙酮酸钠，10.0-20.0g/L琼脂糖。
本发明还提供上述具有高纤维素酶活性的菌株在制备纤维素降解制剂中的应用。
从上面所述可以看出，本发明提供的具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌菌株WH1，从纸浆污泥中分离得到，具有更高的纤维素酶活性，能够广泛应用于食品工业、酿造业、造纸业、饲料工业、纺织工业和生物质转化，提高生物质材料转化效率，降低纤维素转化成本。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1:
1、初步筛选
从造纸废弃场采集纸浆污泥作为样品，分别取样品1克溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，涡旋摇匀，静止30分钟，让残渣下沉，取上清液稀释100 倍，涂布接种于琼脂平板生长培养基R2A(0.5g/L酵母提取物，0.5g/L蛋白胨，0.5g/L酪蛋白，0.5g/L葡萄糖，0.5g/L可溶性淀粉，0.3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L七水硫酸镁，0.3g/L丙酮酸钠，15.0g/L琼脂糖)。28℃培养，分别培养24、48、72小时后观察平皿中生长的单菌落菌直径大小、形态和颜色。选择直径中等，形态边缘整齐、中间凹陷，颜色呈灰白色的菌落。将获得的菌落反复进行平板划线分离，以获得纯化的菌株，供进一步筛选用。
在本发明的另一实施例中，上述琼脂平板生长培养基R2A含有：0.4g/L酵母提取物，0.4g/L蛋白胨，0.55g/L酪蛋白，0.45g/L葡萄糖，0.42g/L可溶性淀粉，0.4g/L磷酸氢二钾，0.5g/L七水硫酸镁，0.35g/L丙酮酸钠，18.0g/L琼脂糖。
在本发明的另一实施例中，上述琼脂平板生长培养基R2A含有：0.6g/L酵母提取物，0.52g/L蛋白胨，0.4g/L酪蛋白，0.5g/L葡萄糖，0.6g/L可溶性淀粉，0.25g/L磷酸氢二钾，0.6g/L七水硫酸镁，0.28g/L丙酮酸钠，18.0g/L琼脂糖。
2、进一步筛选
将获得的单菌落28℃在LB培养基中摇菌培养，取5微升培养后的菌液滴于CMC(羧甲基纤维素钠)平板培养基中，以大肠杆菌(Escherichia.coli)为阴性对照，纤维素酶生产用纤维单胞菌(Cellulomonas xylanilytica)为阳性对照，28℃培养48小时。48小时后以革兰氏碘液(2.0g KI and 1.0g I,300ml ddH2O)染色，染色后置于28℃条件下培养5分钟。5分钟后测量对比透明圈直径大小，透明圈大说明产纤维素酶高、分解纤维的能力大。含有CMC的培养基呈褐色浑浊，CMC被纤维素酶分解后培养基呈无色透明状。因此通过对比透明圈直径的大小可以直观对比纤维素酶活性差异。筛选获得比阳性对照具有更高纤维素酶活性的菌株。筛选得到纤维素酶活性最高的菌株，命名为WH1。
3、16S rDNA检测分析
将筛选得到的WH1在LB培养基中28℃培养24小时，取培养液2ml离心弃上清，用基因组提取试剂盒，提取细菌基因组DNA。以该DNA为模板，采用16S rDNA通用引物P-1(5’-GACTCCTACGGGAGGCAGCAGT),P- 2(5’-AGGGTTGCGCTCGTTGCGGG)进行PCR反应，扩增菌体16SrDNA序列。20μl的反应体系含PCR缓冲液2μl，正反引物1μM,Mg2+2.5mM,dNTP 0.02mM,TaqDNA聚合酶0.5U。反应条件为：95℃,5min；94℃,30s；55℃,30s；72℃,1min,30cycles；最后72℃,10min。反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测、分离PCR产物，割胶回收目的片段进行测序分析。将序列正NCBI上进行同源序列对比搜索(Nucleitide-Nucleitide Blast)，结果表明，该菌株16S rDNA与类芽孢杆菌Paenibacillus sp.的16S rDNA最为相似，具有99％的序列同源性。因此鉴定筛选得到的具有高纤维素酶活性的菌株WH1为类芽孢杆菌Paenibacillus。
将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏登记入册的编号为CCTCC NO:M 2014236，保藏日期为2014年5月29日。
对比例1：
取100μl的菌株WH1菌液加入到含有5ml的Dubois salt液体培养基(K2PO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，NaNO3 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，pH 7.4)的试管中，在试管中加入一条7mm宽的Whatman一号滤纸为底物。设置含有相同菌液浓度的纤维素酶生产用纤维单胞菌(Cellulomonas xylanilytica)为阳性对照，相同菌液浓度的E.coli为阴性对照。28℃振荡培养5天后，取出静置10分钟后进行对比，加入菌株WH1的试管中滤纸被充分降解，培养液上清澄清。阳性对照上清浑浊，阴性对照滤纸完整。结果显示菌株WH1具有最高的滤纸酶活性。
本发明所述的具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌菌株WH1与纤维素酶生产用纤维单胞菌(Cellulomonas xylanilytica)相比，降解纤维素酶的酶活显著提高，提高了49％。
对比例2：
将菌株WH1在含有1％CMC对Dubois salt液体培养基培养48小时后用于测定滤纸酶活性和CMC酶活性。
WH1生长用的培养基是Dubois salts media(K2PO4 1g/L,KCl 0.5g/L,MgSO40.5g/L,NaNO3 0.5g/L,FeSO4 0.01g/L,pH 7.4)加FP(1％,w/v)or CMC(1％,w/v).
滤纸酶活性定义为：在50℃，相应pH条件下，1min水解滤纸纤维素底物产生出相当于1μmol葡萄糖的还原糖量为一个酶活力单位。滤纸酶活测定时选用的滤纸为Whatman一号滤纸，还原糖的检测使用DNS法。测定结果显示，在pH7.0的情况下菌株WH1培养液上清酶活为13.2±1.8U，细胞裂解液的酶活为13.8±0.5U。细胞裂解液的酶活比培养液上清酶活高4.5％。
CMC活性定义为，pH为7.0，反应温度50℃，以1min水解CMC-Na底物产生1μmol的葡萄糖残基为1个酶活单位。结果显示，菌株WH1培养液上清CMC活性为25.7±4.2U，细胞裂解液的酶活为88.2±10.8U。细胞裂解液的酶活是培养液上清酶活的3.43培。
本发明还提供一种所述具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌菌株WH1在制备纤维素降解制剂中的应用，该纤维素降解制剂可显著提高生物质材料转化效率，降低纤维素转化成本。
由此可见，本发明提供的具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌菌株WH1，从纸浆污泥中分离得到，具有更高的纤维素酶活性，能够广泛应用于食品工业、酿造业、造纸业、饲料工业、纺织工业和生物质转化，提高生物质材料转化效率，降低纤维素转化成本。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种具有高纤维素酶活性的菌株，其特征在于，所述菌株命名为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.WH1，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏登记入册的编号为CCTCC NO:M 2014236，保藏日期为2014年5月29日。
2.根据权利要求1所述的具有高纤维素酶活性的菌株，其特征在于，所述菌株从纸浆污泥中分离得到。
3.根据权利要求1所述的具有高纤维素酶活性的菌株在制备纤维素降解制剂中的应用。
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