CN108977367A - 一株黑曲霉菌株及其在降解油茶饼粕中茶皂素的应用 - Google Patents

一株黑曲霉菌株及其在降解油茶饼粕中茶皂素的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株黑曲霉菌株，该黑曲霉(Aspergillus niger)菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其命名为黑曲霉L‑2(Aspergillus niger L‑2)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：60396，保藏时间为2018年6月25日。该菌株具有降解油茶饼粕中茶皂素的能力，为降解茶皂素提供了菌种来源，具有良好的应用前景。本发明还相应提供一种上述的黑曲霉菌株在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，经固态发酵后，茶皂素降解率高，可达96.2％；与采用二种或二种以上的菌种发酵降解油茶饼粕中茶皂素的方法相比，用本发明的菌种，单一菌种的工艺条件容易控制，可降低操作成本。

Description

一株黑曲霉菌株及其在降解油茶饼粕中茶皂素的应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一株黑曲霉菌株及其在降解油茶饼粕中茶皂素的应用。
背景技术
油茶(Camellia Oleifera abel)系山茶科山茶属植物。我国的油茶资源丰富，榨油后所产生的油茶饼粕数量可观。榨油后的油茶饼粕，含有粗蛋白10-15％、粗脂肪0.5-7％、糖类30-60％、粗纤维15-25％、茶皂素10-15％、粗灰分6％等成分，可以作为动物的饲料来源。目前限制油茶饼粕饲用途的主要因素有两方面：一方面，蛋白质含量较低，纤维素含量较高，营养水平低，现有技术中可以采取一些措施进行处理；另一方面，油茶饼粕中含有大量的茶皂素等抗营养因子，影响了饲料的适口性和动物的摄食量，因此需要将油茶饼粕进行茶皂素降解处理后才可作为饲料的来源。
目前，通过复合菌发酵技术可达到降解茶皂素的目的。然而，该方法的脱皂率还有待提高。另外，采用二种或二种以上的菌种复合发酵降解油茶饼粕中茶皂素，其工艺条件不易控制，操作成本较高。因此，寻找一种可单独用于降解油茶饼粕中茶皂素的菌株十分重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一株黑曲霉菌株及其在降解油茶饼粕中茶皂素的应用。
黑曲霉(Aspergillus niger)属于子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科，能够产生淀粉酶，糖化酶以及蛋白酶等多种酶，在工业上用途较广。黑曲霉对环境的要求不高，繁殖较快。因此，选取黑曲霉作为降解茶皂素的菌种，为降解茶皂素提供了菌种来源，具有良好的应用前景。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一株黑曲霉菌株，该黑曲霉(Aspergillus niger)菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，其命名为黑曲霉L-2(Aspergillus niger L-2)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCCNo：60396，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
上述的黑曲霉L-2(Aspergillus niger L-2)是从油茶粕中分离纯化获得，在PDA平板上，倒置28℃培养72h后，菌落呈现圆形和椭圆形，菌丝为白色，成熟后会有少量黑色孢子附着在菌丝表面。
上述的黑曲霉L-2(Aspergillus niger L-2)的DNA基因序列，见SEQ ID NO.1所示。
上述的黑曲霉L-2(Aspergillus niger L-2)，其ITS序列在NCBI数据库中用BLAST进行同源性分析，得到相似性较高的序列，运用MEGA6.06软件构建系统发育树；该黑曲霉L-2的ITS序列与黑曲霉种(Aspergillus niger)的同源性达到99％。
综合形态学观察、生理生化鉴定及ITS序列分析结果，可以确定该黑曲霉L-2为黑曲霉种(Aspergillus niger)，其被命名为黑曲霉L-2。
基于一个总的技术构思，本发明还相应提供一种上述的黑曲霉菌株在降解油茶饼粕中茶皂素的应用。
上述的应用，优选的，具体包括如下步骤：挑取活化后的黑曲霉L-2的单菌落菌丝，于马铃薯葡萄糖液体培养基中进行扩繁培养，将得到的种子液接种到含有油茶饼粕的发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养过程中实现对油茶饼粕中茶皂素的降解。
优选的，所述黑曲霉菌株的活化方法包括以下步骤：在无菌环境下，取黑曲霉L-2斜面，用接种环取一环菌，接种于含马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基的平皿中，在26-30℃条件下倒置培养24-36h后，达到活化的黑曲霉L-2。
优选的，所述扩繁培养的时间为10-20h。
优选的，所述发酵培养的接种量为1％-15％。
优选的，所述发酵培养基包括油茶饼粕和水，所述油茶饼粕和水的质量比为(2-8):4。
优选的，所述发酵培养的培养温度为30-40℃，pH为3.5-5.0，培养时间为50-120h。
优选的，所述PDA液体培养基中包括去皮马铃薯、葡萄糖和水，所述去皮马铃薯、葡萄糖和水的质量比为(8-12):1:50。
优选的，在发酵培养期间，每隔12-48h进行一次翻料处理，确保菌株能够均匀发酵。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明提供的黑曲霉菌株为黑曲霉L-2，该菌株具有降解油茶饼粕中茶皂素的能力，为降解茶皂素提供了菌种来源，具有良好的应用前景。
2、本发明的黑曲霉L-2在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，经固态发酵后，茶皂素降解率高，可达96.2％；与采用二种或二种以上的菌种发酵降解油茶饼粕中茶皂素的方法相比，用本发明的菌种，单一菌种的工艺条件容易控制，可降低操作成本。
一株黑曲霉菌株，其命名为黑曲霉L-2(Aspergillus niger L-2)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCCNo：60396，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例中黑曲霉L-2的菌落形态图。
图2是实施例中黑曲霉L-2的微观形态图。
图3是实施例中黑曲霉L-2的ITS序列构建的系统发育树图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
本发明提供的一株黑曲霉菌株，其命名为黑曲霉L-2(Aspergillus niger L-2)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：60396，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
1、菌株的分离和筛选
取自然发酵的油茶粕，准确称取10g样品用90mL无菌水稀释并震荡20min，逐级梯度稀释，选择10-6、10-7和10-8三个梯度的悬浮液各100μL，加到PDA培养基平板上，每个梯度3个平行，涂布均匀，放置30℃培养箱培养72h。挑选形态特征差异明显的单菌落进行划线纯化，编号并保存。
2、菌株的鉴定
1)形态学观察：
将菌株接种到PDA平板上，倒置28℃培养72h，观察记录平板上菌落的生长情况。图1显示菌株的菌落特征大体上如下：菌丝为白色菌丝，有成熟的黑色孢子，菌落表面较干燥，菌落形态近似为圆形或者椭圆形；图2显示菌株的微观形态。
2)ITS序列分析：
采用真菌DNA提取试剂盒(北京鼎国生物公司)提取供试菌株DNA。
ITS引物：ITS1(5'-TCCGTAGGTAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTAT-TGATATGC-3')。
PCR反应体系(50μL):2×PCR Mix 25μL，20mol/LITS1/ITS4引物各2.5μL，模板DNA2μL，ddH2O 18μL。
扩增条件：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃60s，共35个循环；72℃10min；4℃保存。扩增产物由上海生工生物工程有限公司测序(测序结果参见序列表所示)测序结果在GenBank中进行BLAST相似性比对，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining构建系统发育树(系统发育树如图3所示)。
综合形态学观察、生理生化鉴定及ITS序列分析结果，可以确定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)，其被命名为黑曲霉L-2(Aspergillus niger L-2)。
3、黑曲霉L-2的应用
挑取活化后的黑曲霉L-2的单菌落菌丝，于PDA液体培养基(马铃薯葡萄糖培养基)中培养18h，将种子液按照1％的接种量接到发酵培养基中，培养温度30℃，培养时间100h，不需要光照。每隔12h进行一次翻料处理，确保菌种能够均匀发酵，发酵完全后即完成油茶饼粕中茶皂素的降解。用香草醛-浓硫酸法来测量油茶饼粕中的茶皂素的含量，此条件下茶皂素的剩余量为0.524％，初始茶皂素的含量为13.8％，降解率达到96.2％。
PDA液体培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。
发酵培养基：油茶饼粕30g，水24ml，pH为4.2，121℃灭菌20min。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 中南林业科技大学
<120> 一株黑曲霉菌株及其在降解油茶饼粕中茶皂素的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 572
<212> DNA
<213> 黑曲霉菌L-2(Aspergillus niger L-2)
<400> 1
gttccgggtg cgggtctttg ggccacctcc catccgtgtc tattataccc tgttgcttcg 60
gcgggcccgc cgcttgtcgg ccgccggggg ggcgcctttg ccccccgggc ccgtgcccgc 120
cggagacccc aacacgaaca ctgtctgaaa gcgtgcagtc tgagttgatt gaatgcaatc 180
agttaaaact ttcaacaatg gatctcttgg ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaaat 240
gcgataacta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc 300
gccccctggt attccggggg gcatgcctgt ccgagcgtca ttgctgccct caagcccggc 360
ttgtgtgttg ggtcgccgtc cccctctccg gggggacggg cccgaaaggc agcggcggca 420
ccgcgtccga tcctcgagcg tatggggctt tgtcacatgc tctgtaggat tggccggcgc 480
ctgccgacgt tttccaacca ttttttccag gttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc 540
tgaacttaag catatcaata agccggagag aa 572

Claims (10)

1.一株黑曲霉菌株，其特征在于，该黑曲霉(Aspergillus niger)菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其命名为黑曲霉L-2(Aspergillus nigerL-2)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：60396，保藏时间为2018年6月25日。
2.一种根据权利要求1所述的黑曲霉菌株在降解油茶饼粕中茶皂素的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：挑取活化后的黑曲霉L-2的单菌落菌丝，于PDA液体培养基中进行扩繁培养，将得到的种子液接种到含有油茶饼粕的发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养过程中实现对油茶饼粕中茶皂素的降解。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述黑曲霉菌株的活化方法包括以下步骤：在无菌环境下，取黑曲霉L-2斜面，用接种环取一环菌，接种于含马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基的平皿中，在26-30℃条件下倒置培养24-36h后，达到活化的黑曲霉L-2。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述扩繁培养的时间为10-20h。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的接种量为1％-15％。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包括油茶饼粕和水，所述油茶饼粕和水的质量比为(2-8):4。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的培养温度为30-40℃，pH为3.5-5.0，培养时间为50-120h。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PDA液体培养基中包括去皮马铃薯、葡萄糖和水，所述去皮马铃薯、葡萄糖和水的质量比为(8-12):1:50。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的应用，其特征在于，在发酵培养期间，每隔12-48h进行一次翻料处理，确保菌株能够均匀发酵。
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