CN113416652B - 一株天麻种子萌发菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株天麻种子萌发菌Mycena sp.MO‑2，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2020922；该菌种具有萌发快、生长迅速、易培养、生长力强、与菌材共培养时间短等优点；使用该菌种萌发天麻可缩短天麻培养周期，且经济成本较低，能有效增加天麻产量提高经济效益；为天麻共生萌发菌菌种培育和天麻产业向现代化、专业化、规模化发展奠定基础。

Description

一株天麻种子萌发菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株天麻种子萌发菌（ Mycena sp.）MO-2及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

天麻既是我国重要的中草药材，同时也是重要的经济作物，同时我国存在众多麻农将天麻的种植作为经济来源。但是，天麻的人工种植需要萌发菌和蜜环菌的两菌伴栽，并且众多研究表明在没有萌发菌共生的情况下天麻种子不可以独立完成萌发过程，所以在天麻种子萌发过程中优良的萌发菌菌种是提高天麻产量和质量所必不可少的条件；并且在现有的萌发菌中仍然存在萌发率低等问题。

发明内容

本发明提供了一株天麻种子萌发菌---小菇属（ Mycena sp.）MO-2，其于2020年12月18日保藏于“中国典型培养物保藏中心” (简称CCTCC) ，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2020922，地址:中国.武汉.武汉大学；本发明萌发菌是从采集的野生金星蕨（ parathelypteris glanduligera (kze.) ching）的根部与天麻种子伴播产生的原球茎中分离到的。

本发明另一目的是将上述天麻种子萌发菌（ Mycena sp.）MO-2应用在促进天麻种子的萌发中，其萌发快，生长迅速，生长力强，能缩短天麻生产周期。

为了实现以上目的，本发明采取以下技术措施：

1、从采集野生蕨草（金星蕨）的根部，用天麻种子伴播，培养天麻原球茎；取出原球茎，马上用超纯水洗净表面泥土杂质，但不能弄伤球茎，用万分之一浓度的氯化汞浸泡15~35秒，用镊子将浸泡后的球茎放置在固体PDA培养基表面；遮光、恒温18℃培养，白色菌丝会从原球茎周边呈环状出现，当白色菌丝出现第三环时，用解剖针轻轻刮取第三圈的白色菌丝，用十字划线法在1/2PDA培养基上划线；遮光、恒温18℃培养至出现单菌落；挑取单菌落，接种至复壮培养基中遮光、恒温18℃培养可得萌发菌零代菌株；

2、本发明菌株的保存培养基为PDA培养基，活化所用的培养基为改良加富PDA培养基（去皮马铃薯400g加水1000mL煮沸获得的马铃薯汁、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、蛋白胨9g、硫酸镁1.5g、琼脂15g、维生素B₂ 0.02g、水定容至1000mL、pH自然）；

3、 本发明萌发菌的形态学特征

绒毛状，菌丝洁白，中部浓密，边缘较稀疏、整齐，气生菌丝发达、分枝多，锁状联合较多，边缘菌丝呈螺旋状，培养基反面呈米黄色；

4、分子鉴定：采用CTAB法提取菌株DNA，通过rDNA-ITS扩增，所获得的序列与NCBI上序列进行Blast比对；

结合形态学特征和分子分析结果，最终确定该菌株为小菇属（ Mycena）的紫萁小菇（ Mycena osmundicola）。

本发明的有益效果在于：本发明菌株MO-2是从野生金星蕨的根部与天麻种子伴栽后获得的原球茎中分离获得的；通过实验证明该菌种具有萌发快、生长迅速、易培养、生长力强、与菌材共培养时间短等优点；使用该菌种萌发天麻可缩短天麻培养周期，且经济成本较低，能有效增加天麻产量提高经济效益；为天麻共生萌发菌菌种培育和天麻产业向现代化、专业化、规模化发展奠定基础。

附图说明

图1为本发明萌发菌总DNA提取的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图中B1-B5是扩增产物，“B水”为阴性对照；

图3本发明萌发菌的基因进化树；

图4为不同碳源与氮源对萌发菌生长影响实验的接种方式示意图，A图为接种方式，B图为画线方式；

图5为不同碳源氮源对萌发菌生长影响的结果示意图，其中A图为碳源，B图为氮源；

图6为DNS法测木糖（A）、葡萄糖（B）浓度的标准曲线；

图7为本发明萌发菌在液体完全培养基中培养7天内胞外半纤维素酶（A图）、纤维素酶（B图）、漆酶（C图）活性变化；

图8为蒽酮比色法测定木糖（A）、葡萄糖浓度标准曲线（B）；

图9为萌发菌在麦麸-玉米粉培养基中培养时半纤维素（A）、纤维素（B）和木质素（C）在第60天和90天时的消耗情况；

图10为本发明实施例中显微镜下观察天麻种子与萌发菌共生情况；其中A图为天麻种子；B-F图为天麻种子与萌发菌共生；

图11为天麻种子与萌发菌共生培养6周时的萌发情况；

图12为本发明实施例中天麻种子萌发第8周情况；

图13为对照的萌发菌的萌发第8周的情况。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂。

实验所需试剂有，PDA培养基、Tris-HCl、NaCl、EDTA、β-巯基乙醇、Tris-饱和酚、氯仿、异丙醇、醋酸钾、乙醇、葡萄糖、酵母膏5g、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素B₂，以上试剂购买自昆明拓源经贸有限公司；PCR试剂盒（购自TaKaRa公司）、胶回收试剂盒（购自Biomiga公司）。

液体完全培养基：用天平依次称取葡萄糖46g、酵母膏5g、蛋白胨13g、硫酸镁2g、磷酸二氢钾1g、VB₁0.01g、VB₂0.03g、水1000mL，pH自然，其中维生素需在培养基高温高压（121℃、20min）灭菌后降温至40-50℃时加入；

复壮培养基：磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁2.5g、去皮马铃薯200g加1000mL水煮沸获得的马铃薯汁、葡萄糖20 g、维生素B110 mg、蛋白胨10g、琼脂20g，用水定容至1000 mL；

实施例1：萌发菌的采集、分离和鉴定

1、萌发菌的采集、分离

挖取采集野生金星蕨的根部，用天麻种子（开花授粉后得到翅种），伴播，培养天麻原球茎；取出原球茎，马上用超纯水洗净表面泥土杂质，用万分之一浓度的氯化汞浸泡20s，用镊子将浸泡后的球茎放置在固体PDA培养基表面遮光、恒温18℃培养出白色菌丝出现第三环时，用解剖针轻轻刮取第三圈的白色菌丝，用十字划线法在1/2PDA培养基上划线；遮光、恒温18℃培养出现单菌落，挑取单菌落，接种至复壮培养基中遮光、恒温18℃培养出萌发菌零代菌株；

 取灭菌苹果绿色树叶斜插入培养基，取少量零代菌株，放入PDA培养基上，让萌发菌长到树叶上，长满后，待用。新的无菌培养皿上底层少量无菌水、放入小块薄的无菌海绵，海绵上平铺侵染了待定萌发菌的树叶，用软性无菌毛笔，撒上天麻翅种，恒温遮光18℃培养天麻；最终发现天麻种子能够发芽，证明该菌种为萌发菌，萌发菌菌种保存于4℃保藏。

2、萌发菌的形态特征

菌种活化：将保存在4℃的菌种接种在PDA平板上活化一次，于25℃恒温箱中黑暗培养7d备用；在PDA固体培养基上接种72h后菌种开始萌发，色白，菌丝稠密；绒毛状，中部浓密，边缘较稀疏、整齐，气生菌丝发达、分枝多，锁状联合较多，边缘菌丝呈螺旋状，培养基反面呈米黄色。

3、萌发菌分子鉴定

采用CTAB法提取DNA，取0.01g冻干菌丝体，加入2×CTAB提取液500μL，充分研磨；65℃水浴1h；加入等体积的氯仿/Tris-饱和酚（1:1）混合液，13000r/min离心10min；取上清于一新离心管中，加等体积的氯仿/异戊醇（24:1），13000 r/min离心10min；取上清，于上清中加入3mol/L醋酸钾80μL，加等体积冰冷的异戊醇，混匀后置于-20℃冰箱中沉淀1h，13000r/min离心10min；弃上清，收集沉淀；体积浓度75%酒精冲洗，超净台真空干燥；20μL TE 溶解 DNA，-20℃保存备用，DNA提取结果如图1所示；

以总DNA为模板，引物BZZ-5F和BZZ-5R扩增目的片段，引物序列如下：

BZZ-5F：5’-GCTCGTCCATCTATTTATCTTCTCT-3’；

BZZ-5R：5’-CCAAGTGACGGTCCACAA-3’；

PCR反应体系(20μL ) : 模板DNA溶液1.0μL、2× Taq mix酶10μL、10μmol/L的正向引物和反向引物各1μL，加超纯水补足；PCR反应条件:95℃，3min；95℃，30s；54℃，60s；72℃，2min； 35个循环；72℃延伸，10min；取出部分PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测（结果如图2）；

扩增出核糖体DNA的基因序列，PCR产物送到云南省擎科生物技术有限公司进行测序；在NCBI上进行Blast分析；构建这株萌发菌的系统发育树，从NCBI上下载其他萌发菌菌株的相关序列，进行多基因系统发育分析（见图3）。

实施例2：萌发菌的生理生化特性

1、萌发菌对碳源、氮源的利用

碳源固体培养基制备：在基础培养基（去皮马铃薯200g、琼脂20g、水1000mL、pH自然）中分别加入常见碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖，使加入的不同碳源培养基中的碳元素浓度均为0.8g/L，制成含不同碳源的固体培养基，并设置空白对照（不额外添加碳源）；将以上不同碳源的培养基分别倒入培养皿中。

接种时先将在固体PDA上培养好的萌发菌用植物叶片打孔器直接在培养基上打孔，再将萌发菌与打孔下来的整块培养基接入以上配制的不同碳源的固体PDA培养基上（如图4A所示），并在培养基背面已接种点中心为中心画“十”字（如图4B所示），便于测量菌落直径，最后将接种好的培养基置于黑暗条件下23℃培养3d，每个处理重复3次，计算菌落直径时将横向直径与纵向直径做平均值即为样品菌落直径。

氮源固体培养基制备：在基础培养基（去皮马铃薯200g、琼脂20g、水1000mL、pH自然）中分别加入氮源：蛋白胨、尿素、酵母粉、氯化铵、碳酸氢铵，使加入的不同氮源培养基中的氮元素浓度均为0.75g/L，制成含不同氮源的固体培养基，并设置空白对照（不额外添加氮源）；将以上不同氮源的培养基分别倒入培养皿中；

接种时先将在固体PDA上培养好的萌发菌用植物叶片打孔器直接在培养基上打孔，再将萌发菌与打孔下来的整块培养基接入以上配制的不同氮源的固体培养基上，并在培养基背面已接种点中心为中心画“十”字，便于测量菌落直径，最后将接种好的培养基置于黑暗条件下23℃ 培养3d，每个处理重复3次，计算菌落直径时将横向直径与纵向直径做平均值即为样品菌落直径。

以空白组生长出来的萌发菌菌落直径的平均值为100%，将每一个不同碳源氮源培养基上生长出来的萌发菌（不包括空白组）菌落的直径与空白组生长出来的萌发菌菌落直径的平均值相除，由此得出不同碳源氮源培养基对萌发菌生长影响的数据，结果见图5，在不同氮源存在的情况下，萌发菌的生长均受到了不同程度的抑制，只是蛋白胨与氯化铵对菌落直径的抑制不明显，酵母粉的抑制程度略有增强，但尿素和碳酸氢铵直接导致萌发菌在培养基上不能拿生长，说明尿素和碳酸氢铵对萌发菌的生长有极大的抑制作用；但在不同碳源存在时，情况则大不相同，不同碳源均对萌发菌的生长存在促进作用，其中果糖和葡萄糖对萌发菌生长的促进作用最明显。

2、胞外酶酶活性测定

2.1粗酶液的制备

在超净工作台中将在液体培养基培养好的萌发菌菌球用匀浆机打散，吸取2mL菌液移至含有150mL液体完全培养基的250mL锥形瓶中，然后150r/min、25℃黑暗条件下进行培养，每天定时取2mL发酵液作为粗酶液，连续取7天样。

2.2半纤维素酶酶活性测定

（1）用移液枪向离心管中移入1%的木聚糖溶液750μL，加入稀释5倍的粗酶液500μL混匀，50℃水浴保温30min；其中1%木聚糖溶液：用天平准确称取1g木聚糖、0.32g NaOH，用100mL去离子水超声溶解，溶解冷却后加入0.5mL冰乙酸制得；

（2）取出后立即吸取100μL，移入新的离心管中，加入DNS试剂100μL，摇匀后立即沸水浴l0min；

（3）取出冷却后，加入去离子水补足1mL，混匀，用酶标仪测540nm处的OD值；以煮沸灭活的粗酶液为对照，每组3个重复；

酶活力计算，通常情况下，单位时间内转化1μmol底物或是底物中1μmol相关基团所需的酶的量称为一个国际单位(U)，酶活性通常以X表示，单位是酶活性单位/每升(U/L)；

木聚糖酶酶活性按下式进行计算：

式中： C是实验组的测定液中木糖的浓度与对照组的浓度的差（木糖浓度由标准曲线计算获得），单位为μg/μL； V _酶是反应添加的酶液体积，单位是μL（本文中为50μL）； V _总为测定糖浓度时的上样量，单位为μL（本文中为100μL）；n是稀释倍数；t是酶反应时间，单位为分钟；

结果见图7A，半纤维素酶酶活性在第4天达到最大值，并在之后的几天基本保持酶活不变。

木糖标准曲线的确定

①精确称取分析纯木糖0.100g，用100mL容量瓶定容至100mL；

②从中吸取200μL、400μL、600μL、800μL和1000μL，分别定容至1000μL，分别得到浓度为0.2μg/μL、0.4μg/μL、0.6μg/μL、0.8μg/μL、1.0μg/μL的木糖浓度梯度；

③吸取不同浓度的木糖溶液100μL、100μL DNS液，沸水浴5至10min，然后用去离子水补足1mL；

④测定540nm处吸光度（OD值）；以OD值为纵坐标，添加的木糖浓度为横坐标绘制标准曲线；由图6A可知，R²=0.9921>0.99，证明线性拟合良好，该数据可用，此时吸光度（y）与木糖浓度（x，μg/μL）之间的关系是y=0.2209x+0.0119；

2.3 纤维素酶活性测定

（1）用移液枪向离心管中移入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液750μL，加稀释5倍的粗酶液500μL混匀，50℃水浴保温30min；其中0.5%羧甲基纤维素钠溶液：量取100mL去离子水放入烧杯中，称取0.5g羧甲基纤维素钠后小心将药品粉末慢慢弹入烧杯中，并同时慢慢搅拌溶解制得；

（2）取出后立即吸取100μL移入新的离心管中，加入DNS试剂100μL，摇匀后立即沸水浴l0min；

（3）取出冷却后，加入去离子水补足1mL，混匀后用酶标仪测540nm处的OD值，以煮沸灭活的粗酶液为对照，每组3个重复；

葡萄糖标准曲线的制备

①精确称取分析纯葡萄糖0.100g，用100mL容量瓶定容至100mL；

②从中吸取200μL、400μL、600μL、800μL和1000μL，分别定容至1000μL，分别得到浓度为0.2μg/μL、0.4μg/μL、0.6μg/μL、0.8μg/μL、1.0μg/μL的葡萄糖浓度梯度；

③吸取不同浓度的葡萄糖溶液100μL，100μLDNS液，沸水浴5至10min，然后用去离子水补足1mL；

④测定540nm处吸光度（OD值）；以OD值为纵坐标，添加的葡萄糖浓度含量为横坐标绘制标准曲线；由图6B可知，R²=0.9948>0.99，证明线性拟合良好，该数据可用，此时吸光度（y）与葡萄糖浓度（x，μg/μL）之间的关系是y=0.3084x+0.028；

CMC酶酶活性计算公式同步骤2.2；结果见图7B，纤维素酶均在第4天达到最大值，并在之后的几天基本保持酶活不变。

2.4漆酶酶活性测定

（1）用移液枪吸取0.5mmol/L的丁香醛连氮100μL移入2mL离心管中，加入粗酶液50μL和1.5mLpH6.0的0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液混匀；其中0.5mmol/L丁香醛连氮：称取0.018g丁香醛连氮溶于100mL去离子水中制得；

（2）25℃恒温水浴5min后立即沸水浴终止反应，用酶标仪测525nm处的OD值；以煮沸灭活的粗酶液为对照，每组3个重复；

漆酶酶活性按下式计算:

式中：  V _总为测定糖浓度时的上样量，单位为μL（本文中为100μL）；n是稀释倍数；t是酶反应时间，单位为分钟；e是丁香酸连氮的摩尔消光系数，65000L/(moL·cm)；∆OD为漆酶实验组与对照组吸光度的差值；

结果见图7C，漆酶在第4天达到最大值，并在之后的几天基本保持酶活不变。由此可见，漆酶、纤维素酶、半纤维素酶均在第4天达到最大值，并在之后的几天基本保持酶活不变，由此可以看出萌发菌在液体完全培养基中培养时前三天处于生长发育阶段，直到第四天达到生长量最大值。漆酶、纤维素酶和半纤维素酶活性是先升高然后基本保持不变，且发酵终点的酶活性大于培养第一天；实验室萌发菌菌株漆酶、纤维素酶和半纤维素酶酶活性在第4天达到最大值。

3、木质纤维素利用效率

3.1试剂及培养基的配制

中性洗涤剂：称取30g SDS定容到1000mL；

蒽酮指示剂：称取0.2g蒽酮粉末溶于配制好的80%的浓硫酸中即可，保存于棕色试剂瓶中，于0-4℃保存；

2mol/L盐酸溶液：在通风橱中量取17mL12mol/L的浓盐酸加去离子水稀释至100mL；

72%浓硫酸：量取72mL分析纯浓硫酸缓慢倒入18mL去离子水中；

麦麸-玉米面培养基：79g木屑、19g麦麸、11g玉米面、1.1g蔗糖、0.34g磷酸二氢钾、0.23g硫酸镁、0.56g氯化钙、1.1g硫酸钙、去离子水37mL；

样品准备：将培养好的液体培养基中的萌发菌菌体用均浆机打散并接种2mL到木屑-麦麸-玉米面培养基中，随后在25℃、黑暗条件下培养，培养到60d和90d取样用于测定木质纤维素的利用效率，以未接种萌发菌的木屑-麦麸-玉米粉培养基为对照，分别计算出60天和90天时的木质纤维素利用效率。

3.2半纤维素利用效率测定实验

（1）称取步骤3.1中的样品0.5g放入100mL碘量瓶中，用量筒量取50mL中性洗涤剂，加入100mL碘量瓶中，之后放入已沸的高压蒸汽消毒器中，100℃保温1h；

（2）取出后用抽滤机使用0.45μm滤膜过滤，残渣先后用去离子水、丙酮洗；

（3）残渣重新置于100mL碘量瓶中，量取50mL2M盐酸溶液加入碘量瓶中，然后放入已沸的高压消毒器中，100℃准确保温50min；

（4）取出后用抽滤机使用0.45μm滤膜过滤；

（5）滤液适当稀释后，吸取200μL，加1mL蒽酮试剂，沸水浴10min，于625nm测OD由木糖标准曲线求出糖量，乘上系数0.9即为半纤维素含量。

（6）木糖标准曲线的制备

①精确称取分析纯木糖0.400g，用1000mL容量瓶定容至1000mL；

②从中吸取200μL、400μL、600μL、800μL和1000μL，分别定容至1000μL，分别得到浓度为0.08μg/μL、0.16μg/μL、0.24μg/μL、0.32μg/μL、0.40μg/μL的木糖浓度梯度；

③吸取不同浓度的木糖溶液200μL、1000μL蒽酮试剂，沸水浴10min；

④测定625nm处吸光度（OD值）；以OD值为纵坐标，添加的木糖浓度含量为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线吸光度（y）与木糖浓度（x，μg/μL）之间的关系是y=0.5121x+0.1025，R²=0.9948（如图8A）；

结果见图9A，90天时半纤维素消耗量为91.07mg/g，相比60天时的33.83mg/g在最后30天里增长了170%，说明萌发菌在开始的60天内基本没有消耗半纤维素，而在60天以后开始大量消耗半纤维素。

3.3纤维素利用效率测定实验

（1）称取样品0.5g放入100mL碘量瓶中，量取50mL中性洗涤剂，加入100mL碘量瓶中，之后放入已沸的高压蒸汽消毒器中，100℃保温1h；

（2）取出后用抽滤机使用0.45μm滤膜过滤，残渣先后用去离子水、丙酮洗；

（3）残渣重新置于100mL碘量瓶中，量取50mL2M盐酸溶液加入碘量瓶中，然后放入已沸的高压消毒器中，100℃准确保温50min；

（4）取出后用抽滤机使用0.45μm滤膜过滤，水洗残渣至pH6.5-7.0；

（5）将残渣再用丙酮清洗两次，60℃干燥至恒重，再将其置于100mL碘量瓶中，加入5mL72%浓硫酸，室温水解3h，再加去离子水45mL室温过夜；

（6）次日用抽滤机使用0.45μm滤膜过滤；

（7）滤液适当稀释后，取200μL加1mL蒽酮试剂，沸水浴10min，于625nm测OD由葡萄糖标准曲线求出糖量，乘上系数0.9即为半纤维素含量。

（8）葡萄糖标准曲线的制备

①精确称取分析纯葡萄糖0.400g，用1000mL容量瓶定容至1000mL；

②从中吸取200μL、400μL、600μL、800μL和1000μL，分别定容至1000μL，分别得到浓度为0.08μg/μL、0.16μg/μL、0.24μg/μL、0.32μg/μL、0.40μg/μL的葡萄糖浓度梯度；

③吸取不同浓度的葡萄糖溶液200μL，加入1000μL蒽酮试剂，沸水浴10min;

④测定625nm处吸光度（OD值）；以OD值为纵坐标，添加的葡萄糖浓度含量为横坐标绘制标准曲线吸光度（y）与葡萄糖浓度（x，μg/μL）之间的关系是y=4.1327x+0.0875，R²=0.9987（图8B）；

如图9B所示，在培养过程中，前60天消耗了251.81mg/g ，90天时消耗了纤维素462.89mg/g，最后30天增加了84%。

3.4木质素利用效率测定实验

（1）称取样品0.5g放入100mL碘量瓶中，量取50mL中性洗涤剂，加入100mL碘量瓶中，之后放入已沸的高压蒸汽消毒器中，100℃保温1h；

（2）取出后用抽滤机使用0.45μm滤膜过滤，残渣先后用去离子水、丙酮洗；

（3）残渣重新置于100mL碘量瓶中，量取50mL2mol/L盐酸溶液加入碘量瓶中，然后放入已沸的高压消毒器中，100℃准确保温50min；

（4）取出后用抽滤机使用0.45μm滤膜过滤，水洗残渣至pH6.5-7.0；

（5）将残渣再用丙酮清洗两次，60℃干燥至恒重，再将其置于100mL碘量瓶中，加入5mL72%浓硫酸，室温水解3h，再加去离子水45mL室温过夜；

（6）次日用抽滤机使用0.45μm滤膜过滤，水洗残渣至pH6.5；

（7）残渣置于20mL坩埚于60℃烘干，带坩埚一起称重（W）之后在550℃灰化，得灰分（W1），木质素计算公式：W-W1。

结果见图9C，虽然90天时的消耗的12.4mg/g与60天时消耗的11.9mg/g相差无几，但相较于纤维素和半纤维素的消耗量而言，几乎可以说没有消耗木质素，由此判断萌发菌对木质素的消耗能力较差。

实施例3：萌发菌菌种拌种栽培实验

1、天麻种子萌发实验

1.1萌发菌的培养

（1）萌发菌菌种保存在4℃的冷库中，首先将菌种接种在固体PDA的培养皿中25℃黑暗条件下培养10天至长满培养皿取出；

（2）挑取一定量的菌丝至装有150mL液体完全培养基的250mL锥形瓶中（25℃、150r、黑暗）继续培养10天，至有大量萌发菌菌球出现；

（3）使用匀浆机将在液体完全培养基中完成培养的萌发菌打碎，并将所制成的匀浆加入准备好的装有PDA固体培养基的培养瓶中，23℃黑暗条件下继续培养15天，至固体培养基上长出大量连续菌丝为止。

1.2共生环境的搭建

所需材料：灭菌培养皿、灭菌滤纸、灭菌苹果树叶（取自昭通）、灭菌水

（1）在超净工作台中小心用镊子将苹果树叶夹入培养好萌发菌的培养瓶中，培养（23℃、黑暗）10天，此过程的目的是将已培养好的萌发菌接种到苹果树叶上，并且苹果树叶也会吸收一部分培养基的营养；

（2）在超净工作台中，用镊子夹取3张与培养皿同样大小的滤纸放入培养皿中，并在培养皿中加入灭菌水，使灭菌滤纸浸湿，再将培养瓶中的苹果树叶小心取出平铺在浸湿的滤纸上，使沾有萌发菌的一面向上，将培养皿正放在23℃的黑暗培养环境中继续培养，直至苹果树叶上的萌发菌适应新环境长出连续的菌毛；

（3）在超净工作台中，将成熟的天麻种子均匀的洒在萌发菌长势较好的部位，并不定期在培养皿中喷水以保证萌发菌活力，并设置有天麻种子及培养环境而不接种萌发菌的天麻种子作为对照；

（4）每周使用显微镜观察一次天麻种子萌发情况并做好记录，结果如图10所示；

由图10A可知，天麻的种子像灰尘一样细小，形状呈纺锤形或新月形，长约0.6～1mm，宽约0.1～0.14mm；种皮呈白色半透明，种胚呈淡黄色，位于种子中部，老熟后逐渐变为暗褐色；种子之中没有暂时提供能量的胚乳，仅具约64个左右胚细胞；珠孔相近处有一突出的喙状柄。

由图10B-F可以看出，天麻种子的一端缠绕着萌发菌的菌丝，并且由图中菌丝与种子之间的拉扯感基本可以判断，经过一周的共生培养，萌发菌已经成功侵染了天麻种子；

天麻种子与萌发菌共生培养六周情况如图11，天麻种子共生六周时出现了直径约1mm的原球茎，说明天麻种子与萌发菌共生六周左右就可以萌发为原球茎，而没有接种萌发菌的天麻种子则没有萌发，以此可以证明萌发菌在天麻种子萌发的过程中确实起到了促进作用。

第八周天麻种子萌发情况如图12所示。如图12所示，萌发的天麻种子集中在圆圈的内部。由图可知，天麻种子在第一周完成了被萌发菌的侵染，第六周有种子开始萌发，直到第八周天麻种子萌发数量达到最大值；并且由图可知，即使是在同一个培养皿中，天麻种子萌发情况依然不是均匀的，而是选择性在某一个小区域的集中萌发。

最后，为证明该萌发菌的优良特性，我们找与另一株萌发菌（紫褐小菇， Mycena  purpureofusca）作为对照，用于与本发明菌种作对比，用同样的试验流程进行萌发菌伴栽，伴栽第八周的共生情况如图13所示，伴栽第八周时，才开始出现原球茎，并且出现的原球茎较小，数量也少，而本发明菌株MO-2在第六周就已经出现原球茎，第八周则已经达到萌发数量达到最大值，并且此时原球茎体积也显著大于对照菌株，三次重复的实验结果对照菌株促进每一培养皿（直径9cm）生产7.33±1.154个原球茎，本发明菌株MO-2为11.67±1.527个，本发明菌株MO-2每一培养皿比对照多萌发生成4.34个原球茎，比对照菌株多促进天麻种子萌发生长成原球茎率为59.2%，实验结果表明菌株MO-2对天麻种子萌发的促进作用比对照株的促进萌发效果好，具有促进天麻种子萌发快，生长快的优良特性。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一株天麻种子萌发菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

gctcgtccat ctatttatct tctct 25

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ccaagtgacg gtccacaa 18

Claims (2)

1.一株天麻种子萌发菌紫萁小菇（Mycena osmundicola）MO-2，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No:M 2020922。

2.权利要求1所述的天麻种子萌发菌紫萁小菇MO-2在促进天麻种子萌发和缩短天麻生产的周期中的应用。

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