CN106676044A

CN106676044A - 一株沼泽红假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN106676044A
Application number: CN201710038574.1A
Authority: CN
Inventors: 李昆志; 雷玉珠; 包燚; 唐彧文; 陈丽梅; 徐慧妮
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2017-01-19
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2037-01-19
Also published as: CN106676044B

Abstract

本发明公开了一株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)DC‑2，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2016677，本发明菌株为能高效降解苯系物和甲醛的光合细菌，可用于处理苯系物和甲醛污染的污水，对苯系物的耐受浓度高，降解作用强；对甲醛有去除能力，且此菌株培养条件简单，易于工业产业化实施。

Description

一株沼泽红假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株光合细菌沼泽红假单胞菌DC-2及其应用，属于污水处理领域。

背景技术

苯系物是环境中常见的污染物，有致癌、致畸、致突变毒性，国家有关饮用水的水质标准均将其列为监测项目。长期接触苯即可能慢性中毒，导致再生障碍性贫血以及白血病。其主要污染来源于装潢材料及油漆等行业排放的废气，作为消毒剂应用于医疗卫生、水产行业产生的废水等。目前，净化苯系物的方法主要有化学反应方法、物理吸附技术、植物净化等，但是这些方法存在成本高，处理时间长等缺点。相比之下，微生物对污染物有较强的降解能力、成本低，效果好，而且无二次污染等优点，利用微生物治理苯系物污染已成为了目前重点研究的方向。光合细菌(Photosynthetic Bacteria，简称PSB)是一类以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物的总称。光合细菌广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处，主要分布于水生环境中光线能透射到的缺氧区。相比真菌来说，光合细菌可在恶劣条件下处理有机物，并且其生命力强，营养要求低，容易培养，生长繁殖速度快，本身无毒，富含蛋白质、类胡萝卜素、维他命，在分解有机物的同时并不会对环境造成二次污染等特点，为微生物治理苯系物污染方面提供了广泛的应用前景。目前国内外关于能降解苯系物的光合细菌报道很少。

发明内容

本发明目的在于提供了一株从昆明滇池湿地公园入口处污水中分离筛选得到的光合细菌沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）DC-2，其于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址: 中国.武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M2016677。

本发明另一目的是将上述菌种应用在处理苯系物污染水体中。

本发明另一目的是将上述菌种应用在处理甲醛污染水体中

本发明中沼泽红假单胞菌DC-2具有以下微生物学特性：

1、本发明沼泽红假单胞菌DC-2最适生长的培养基组分为CH₃CH₂COONa·3H₂O8.29g/L、NH₄HCO₃2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、NaH₂PO₄·H₂O 0.5g/L、K₂HPO₄ 0.66g/L、CaCl₂·2H₂O 0.1g/L。

2、形态学特征

本发明菌株DC-2的菌落呈红色、其边缘整齐、表面较光滑湿润，菌落较小且呈圆形；菌株的菌体细胞呈稍弯曲的杆状，且为革兰氏阴性菌，菌体大小为(0.5～0.7)μm×(2～2.5)μm；

3、生理生化特征

菌株DC-2最适温度为30℃，最适pH值为7～8，最适接种量为20％～25％，且在微氧条件下更适合菌株DC-2的生长；菌株DC-2的生理生化特征如下(见表1)；

表1本发明菌株的生理生化特征

实验项目	结果
		运动性	+
接触酶试验	+
		吲哚试验	+
明胶液化试验	+
		H₂S生成试验	+
硝酸盐还原试验	+
		淀粉水解试验	+

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

4、本发明菌种在200-800nm波长范围内有4个特征吸收峰，分别位于375、475、509、590nm处；说明该菌种中含有细菌叶绿素a和类胡萝卜素。

5、本发明中所述菌株DC-2能够利用乙醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、丙酸钠、硫代硫酸钠、碳酸氢钠、L-苹果酸、L-谷氨酸等为碳源来进行生长繁殖；能够利用蛋白胨、酵母膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、碳酸氢铵、硝酸钠等为氮源来进行生长繁殖，菌株DC-2可利用碳源和氮源范围广。

6、本发明中所述菌株DC-2，其16SrDNA序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，将所测得的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行同源比对，比对结果显示和Rhodopseudomonas palustris DX-1CP002418.1的相似性99％，确定该菌种为沼泽红假单胞菌，命名为DC-2。

本发明的优点及效果：

通过对该菌株的生理活性进行研究，用分子生物学方法确定它的分类地位；证明本发明提供的沼泽红假单胞菌具有以下优点：生长速度快、生长力强、可利用碳源和氮源范围广等优点；并且该菌株对苯和甲醛的耐受浓度及去除效果较好，能将8mM/L的苯和4mM/L的甲醛全部降解；可用于处理苯系物和甲醛污染的污水，且此菌株培养条件简单，易于工业产业化实施。

附图说明

图1为本发明菌株形态学示意图；

图2为本发明菌株DC-2的显微示意图；

图3为菌株DC-2吸收光谱；

图4为不同碳源对菌株DC-2生长的影响；

图5为不同氮源对菌株DC-2生长的影响；

图6为菌株DC-2根据16SrDNA序列所作的系统进化树；

图7为温度对菌株DC-2生长的影响；

图8为pH值对菌株DC-2生长的影响；

图9为接种量对菌株DC-2生长的影响；

图10为氧气对菌株DC-2生长的影响；

图11为不同苯浓度下菌株DC-2的生长情况；

图12为不同苯浓度下菌株DC-2净化苯的能力。

图13为不同甲醛浓度下菌株DC-2的生长情况；

图14为不同甲醛浓度下菌株DC-2净化甲醛的能力。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：沼泽红假单胞菌DC-2的分离、纯化和鉴定

1、将从昆明滇池湿地公园入口处采集到污水除杂后，倒入装有500mL富集培养液(配方NaCl 2.5g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、NH4Cl 1.0g、NaHCO₃ 2.5g、KH₂PO₄ 2.75g、CH₃COONa6g、酵母粉2g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0)的矿泉水瓶中，混合均匀，封口；最后置于28℃，60W白炽灯下光照培养7-8天；待培养液变成红色或者血红色，吸出50mL红色液体，倒入装有新鲜富集培养液的矿泉水瓶中，连续富集培养2-3次；用RCVBN培养液(配方为CH₃COONa5.0g、CH₃CH₂COONa 3.0g、NaCl 2.5g、MgSO₄·7H₂O 1.5g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g、KH₂PO₄ 1.5g、K₂HPO₄ 0.6g、CaCl₂ 0.05g、MnSO₄ 5mg、FeSO₄ 5mg、酵母膏0.5g、蛋白胨20mg、谷氨酸0.5mg、H₂O 1000mL、pH7.0)对富集液中的光合细菌进行筛选分离；用1mL移液管取不同稀释度的样品菌液(10^－5、10^－6、10^－7、10^－8CFU/mL)加到灭菌的试管中，后加入15mL灭菌的45℃光合细菌分离培养基(乙酸钠3.0g、酵母膏3.0g、氯化钙0.3g、硫酸镁0.5g、调节pH值至7.4，底层培养基：琼脂0.8％、上层培养基：琼脂1％)，混合均匀后，倒入平皿；待培养基冷凝后，上层加5mL分离培养基，冷却后置于28℃60W的白炽灯照射下培养7天，如果菌落不明显，则继续培养；挑取红色不同形态菌落，采用双层平板法，用纯化培养基反复划线纯化2～3次，将获得了纯净单菌落(见图1)。图为菌株DC-2双层平层法照片，由图可以看出菌株DC-2的菌落，呈红色、其边缘整齐、表面较光滑湿润，菌落较小且呈圆形。

2、用灭菌的牙签挑取平板上的纯培养物，转入装有RCVBN培养液的25mL厌氧管中，混合均匀，装满密封，置于28℃，60W白炽灯下光照培养7-8天；待培养液变成血红色。

3、对平板上纯化的单菌株进行菌落形态观察，取菌体涂片，进行革兰氏染色，并在显微镜下观察菌体形态(见图2)；图2为菌株DC-2的显微观察，由图可以看出菌株DC-2的菌体细胞呈稍弯曲的杆状，且为革兰氏阴性菌，菌体大小为(0.5～0.7)μm×(2～2.5)μm。

4、生理生化特征

菌株DC-2的生理生化参照常见细菌系统鉴定手册方法进行，结果见下表：

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

5、光合细菌吸光度的测定

将光合细菌种子液接种于含有RCVBN培养液的厌氧管中，培养至液体颜色变红。无菌条件下用移液管取2mL培养液至离心管中，8000转每分钟离心15分钟，用生理盐水将活细胞离心洗涤2～3次后，重新悬浮于60％(600g/L)的蔗糖溶液中。用60％的蔗糖溶液作空白对照，在波长200-800nm范围内测定该细菌的吸光度值，绘制吸光度曲线。图3为菌株DC-2吸收光谱，由图可以看出菌株DC-2在200-800nm波长范围内有4个特征吸收峰，分别位于375、475、509、590nm处。在475nm和509nm处有一个特殊吸收双峰，说明活细胞中存在类胡萝卜素；在375nm和590nm处都有吸收峰，说明活细胞中存在细菌叶绿素a。光合细菌的吸收光谱主要受类胡萝卜素和细菌叶绿素a成分的影响；通过光合细菌吸光度的测定来确定该菌株的最大吸收峰值。

6、碳源和氮源的利用情况

6.1碳源利用试验基础培养基：(NH₄)₂SO₄ 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、NaH₂PO₄·H₂O0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、CaCl₂·2H₂O 0.1g、蒸馏水1000mL、调节pH值至7.0。

分别加入碳源：乙醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、丙酸钠、硫代硫酸钠、碳酸氢钠、L-苹果酸、L-谷氨酸，其中糖醇类添加量为0.5％，其他碳源添加量为0.2％；利用25mL的厌氧管，接种量为20％、pH为7、温度为28℃，60W白炽灯下培养7d，实验设置3个重复，在375nm下测定菌液的吸光度值；图4为不同碳源对菌株DC-2生长的影响，由图可以看出菌株DC-2较适宜的碳源为丙酸钠或者乙酸钠。

6.2氮源利用试验基础培养基：KH₂PO₄ 1.36g、CaCl₂·2H₂O 0.5g、Na₂HPO₄2.13g、葡萄糖10g、MgSO₄·7H₂O0.2g、FeSO4·7H₂O 0.05g蒸馏水1000mL、pH值调节至7.0；分别加入氮源(浓度为0.1％)蛋白胨、酵母膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、碳酸氢铵、硝酸钠。

利用25mL的厌氧管，接种量为20％、pH为7、温度为28℃，60W白炽灯下培养7d，实验设置3个重复，在375nm下测定菌液的吸光度值；图5为不同氮源对菌株DC-2生长的影响，由图可以看出菌株DC-2较适宜的氮源为酵母膏，其次为蛋白胨，但考虑到酵母膏、蛋白胨使生产成本高，营养丰富易造成染菌等因素，因此选择碳酸氢铵为氮源。

5、沼泽红假单胞菌DC-2的分子鉴定

PCR引物由昆明硕擎生物科技有限公司提供，其中上游引物27F:5-agagtttgatcctggctcag-3；下游引物1492R：5-ggttaccttgttacgactt-3；

扩增体系(47μl):27F 1μl、1492R 1μl，金牌Mix 45μl，加入光合细菌单菌落量(直接用牙签挑取细菌菌落)。

扩增条件：98℃2min；(98℃10s，58℃15s，72℃，30s)30个循环；72℃5min；

16S rDNA PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测正确后，将PCR产物交由昆明硕擎生物科技有限公司进行测序，将所测得的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行同源比对，比对结果显示和Rhodopseudomonas palustris DX-1 CP002418.1的相似性99％，确定该菌种为沼泽红假单胞菌，命名为DC-2，系统进化树见图6。

实施例2：光合细菌培养条件的优化

液体培养基：CH₃CH₂COONa·3H₂O 8.29g/L、NH₄HCO₃2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、NaH₂PO₄·H₂O 0.5g/L、K₂HPO₄ 0.66g/L、CaCl₂·2H₂O 0.1g/L。

1、温度的确定在25mL的厌氧管中接入20％的种子液，用液体培养基装满厌氧管，在pH为7的条件下，将培养温度分别设定为20、25、30、35℃；光照培养7d,实验设置3个重复，每隔24h测定菌体培养液在375nm下的OD值，来确定最佳培养温度。图7为温度对菌株DC-2生长的影响，由图7可以看出菌株DC-2最佳培养温度为30℃。

2、pH的确定在25mL的厌氧管中接入20％的种子液、用液体培养基装满厌氧管，在温度为30℃的条件下，将培养pH值分别设定为5、6、7、8、9。光照培养7d,实验设置3个重复，每隔24h测定菌体培养液在375nm下的OD值，来确定最佳培养pH。图8为pH值对菌株DC-2生长的影响，由图8可以看出菌株DC-2最佳培养pH7～8。

3、接种量的确定在温度为30℃、pH值为7的条件下，分别在25mL的厌氧管中接入10％、15％、20％、25％、30％种子液，用液体培养基装满厌氧管，光照培养7d实验设置3个重复，每隔24h测定菌体培养液在375nm下的OD值，来确定菌种最佳接种，由图9可以看出菌株DC-2最佳接种量为20％～25％。

4、氧气对光合细菌生长情况的影响

A组(好氧)：在25mL的厌氧管中装1/3容量的接种液体培养基，在厌氧管外罩有黑色塑料袋，摇床振荡培养(120r/min)；B组(微氧)：在25mL的厌氧管中装1/2容量的接种液体培养基；C组(厌氧)：在25mL的厌氧管中接种的液体培养基，密封，静置培养，5d后取样，在375nm下测定培养物的OD值，来确定菌种需氧条件。图10为氧气对菌株DC-2生长的影响，由图可以看出菌株DC-2在微氧条件下生长较好。

实施例3：菌株DC-2净化苯系物的能力

菌株DC-2浓度为20％的液体培养物分别接种于含有2mM、6mM、10mM、14mM苯的液体培养基中，30℃，60W白炽灯下光照培养0、1、2、3、4、5、6、7、8d，实验设置3个重复，分别测定其各个时间点菌株DC-2的菌体浓度及剩余液体苯浓度。苯含量测定的具体步骤如下：

1、甲醛-硫酸溶液的配制：在100mL优级浓硫酸中加0.1mL 10％甲醛溶液混合，冰冷保存(用时制备)；

(在硫酸存在下，苯系物与甲醛反应生成黄棕色二苯基甲烷聚合体，该有色化合物的最大吸收波长为465nm，用1cm比色皿，以纯水为参比，测其吸光值。)

2、苯标准溶液的配制：在50mL容量瓶中加25mL乙醇，准确称重之后，加入约0.5mL新蒸馏过的苯，再准确称重，两次重量之差即为苯的重量，用纯水稀释至刻度，计算其浓度。使用时用纯水配成100，200，300，500，1000μg/mL的苯标准溶液；

3、5mL的反应体系包括甲醛-硫酸溶液4.9mL，苯标准溶液0.1mL，反应体系混匀后，在水中放置5min，在波长465nm处，用1cm比色皿，以纯水为参比，测定其吸光度，以标准曲线计算苯的浓度；计算苯的浓度。

图11为不同苯浓度下菌株DC-2的生长情况，由图可以看出菌株DC-2在苯浓度为2-10mM/L时，菌体浓度随着培养时间的增加而增加；当苯浓度为14mM/L时，菌体浓度随着培养时间的增加而减少，所以菌株DC-2对苯的耐受浓度为14Mm/L。

图12不同苯浓度下菌株DC-2净化苯的能力,由图可以看出菌株DC-2,8d可将8mM/L的苯全部降解，6d可将6mM/L的苯全部降解，3d可将2mM/L的苯全部降解；菌株DC-2对苯的降解作用比较强。

实施例4：菌株DC-2净化甲醛的能力

菌株DC-2浓度为20％的液体培养物分别接种于含有2mM、4mM、6mM、8mM甲醛的液体培养基中，30℃，60W白炽灯下光照培养0、1、2、3、4、5、6、7、8d，实验设置3个重复，分别测定其各个时间点剩余液体甲醛浓度。液体甲醛浓度的测定方法：按照宋中邦等人文献中所报道的方法来测定。

图13为不同甲醛浓度下菌株DC-2的生长情况，由图可以看出菌株DC-2在苯浓度为2～8mM/L时，菌体浓度随着培养时间的增加而增加；当苯浓度为8Mm/L时，菌体浓度随着培养时间的增加而减少，所以菌株DC-2对苯的耐受浓度为8Mm/L。

图14不同甲醛浓度下菌株DC-2净化甲醛的能力,由图可以看出菌株DC-2,7d可将2mM/L的甲醛全部降解，8d可将4mM/L的甲醛全部降解，菌株DC-2对甲醛具有一定的降解作用。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一株沼泽红假单胞菌及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 977

<212> DNA

<213> Rhodopseudomonas palustris

<400> 1

ggctaccata caactcgaac gggcgtagca atacgtcagt ggcagacggg tgagtaacgc 60

gtgggaacgt accttttggt tcggaacaac acagggaaac ttgtgctaat accggataag 120

cccttacggg gaaagattta tcgccgaaag atcggcccgc gtctgattag ctagttggtg 180

aggtaatggc tcaccaaggc gacgatcagt agctggtctg agaggatgat cagccacatt 240

gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg 300

gggcaaccct gatccagcca tgccgcgtga gtgatgaagg ccctagggtt gtaaagctct 360

tttgtgcggg aagataatga cggtaccgca agaataagcc ccggctaact tcgtgccagc 420

agccgcggta atacgaaggg ggctagcgtt gctcggaatc actgggcgta aagggtgcgt 480

aggcgggttt ctaagtcaga ggtgaaagcc tggagctcaa ctccagaact gcctttgata 540

ctggaagtct tgagttcggg agaggtgagt ggaactgcga gtgtagaggt gaaattcgta 600

gatattcgca agaacaccag tggcgaaggc ggctcactgg cccgatactg acgctgaggc 660

acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga 720

atgccagccg ttagtgggtt tactcactag tggcgcagct aacgctttaa gcattccgcc 780

tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt 840

ggagcatgtg gtttaattcg acgcaacgcg cagaacctta ccagcccttg acatgtccag 900

gaccggtcgc agagacgcaa ccttctcttc ggagcctgga gcacaggtgc tgcatggctg 960

tcctcacctc gtgccgt 977

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)DC-2，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2016677。

2.权利要求1所述光合细菌在处理苯系物污染水体中的应用。

3.权利要求1所述光合细菌在处理甲醛污染水体中的应用。