CN107674846B - 一株沼泽红假单胞菌rp1及其应用 - Google Patents

一株沼泽红假单胞菌rp1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris strain)RP1,其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC:M 2017324,本发明的沼泽红假单胞菌是以甲醛驯化污水沟泥水中的微生物为材料,用光合菌的无机盐培养基分离而得的一种光合菌,为革兰氏阴性细菌,菌液为红色,菌体细胞中存在类胡萝卜素和细菌叶绿素a。在光照下能在含有4、6 mM甲醛的液体无机盐培养基中持续生长,对培养基中添加的甲醛有较好的去除效率。可将甲醛同化为谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、乙酸和乙醇等多种氨基酸和有机酸,甲醛同化为这些氨基酸和有机酸的途径是其甲醛脱毒的主要机制,这种机理的作用使RP1光合菌对甲醛有较强的抗性和吸收能力。

Description

一株沼泽红假单胞菌RP1及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域,具体的说,涉及一种具有特殊甲醛代谢途径且可以净化甲醛污染的澡泽红假单胞菌。
背景技术
甲醛是一种无色,有强烈刺激气味的气体,很多工业生产过程包括化工合成﹑工业制造、医药合成等都要使用甲醛,因此这些工业生产过程中会产生大量含甲醛的废水,这些废水直接排放不仅不符合环保要求,而且会对动植物和人类健康有危害。另一方面随着人们生活质量的不断提高,装修已成为现代人生活的一部分,而装修所用的材料如胶合板、细木工板、中密度纤维板和刨花板等含有大量HCHO,这是因为目前生产人造板材使用的多种胶粘剂比如脲醛树脂、三聚氰甲醛、胺基甲醛树酯、酚醛树脂等多以HCHO为主要成分,这些材料中未交联甲醛可以缓慢且持续地释放出来,使得HCHO成为装修室内空气污染的主要化学物质之一。室内空气污染HCHO严重危害人体健康,因此有很多研究致力于开发甲醛污染治理方法和技术,基于物理和化学原理的方法在去除HCHO污染方面虽然有一定成效,但存在成本高和治标不治本的缺点。利用生物的净化技术具有简单、自然,又经济、科学和环保的特点,生物能净化甲醛是因为有些生物特别是微生物具有应对HCHO的解毒机制。在生命诞生以前,HCHO是地球上原始汤的成分之一,能在原始地球环境上生存的微生物体内进化出应对HCHO毒性的不同机制,总体上可归纳为两种:一、氧化HCHO最终生成CO2;二、利用同化途径固定HCHO。在HCHO固定过程中,已知有核酮糖单磷酸途径(RuMP)、丝氨酸途径和木酮糖单磷酸途径(XuMP)起作用。前两者主要出现在原核生物中,后者在酵母中发现。
光合细菌能在厌氧光照下利用光能同化CO2,在某些特殊条件下通过固氮或丙酮酸代谢产氢。此外,在黑暗有氧条件下,光合细菌还能利用许多有机物质如有机酸、醇类、糖类物质作为碳源生长,同时以这些有机物质为共代谢底物转化某些有毒物质如 H2S和一些芳香族化合物。在水产养殖中,底层水质由于积累很多动物的排泄物及食物残料,导致微生物的大量繁殖,消耗水中大量的氧气,形成厌氧环境,硫酸盐、硝酸盐还原菌大量繁殖,产生对动物有毒害作用的硫化氢、氨态氮及酸性物质。养殖池底层的这种环境较适合光合细菌生存,因此光合细菌被广泛应用在净化鱼虾养殖池的水质,在底层环境中光合细菌利用鱼虾排泄物、残留食物以及硫化氢、酸性物质作为基质,同时可以利用氨态氮、亚硝酸态氮、硝态氮为氮源生长。光合细菌的菌体细胞富含蛋白质、维生素、促生长因子、免疫因子等营养成分,因此水产养殖中应用光合细菌不仅改善水中的生态环境,大量繁殖的光合菌细胞还为养殖业提供高质量的饲料添加剂。
光合细菌广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处,在黑暗有氧条件下光合细菌能利用有机物质为共代谢底物转化一些有毒有机物质为无毒、无副作用的细胞组分,因此有很多研究用固定化的光合菌构建反应器净化工业、农副产品加工及水产养殖的有机废水。栽培植物的土壤和水田、沼泽、湖泊、江海的污泥富含微生物,其中有些微生物拥有有甲醛代谢机理,因此很多研究尝试利用盆栽植物土壤或水中捞出的污泥组装生物反应器,研究结果证实这些生物反应器去除并降解各种有机污染物的效果非常好,但是活性污泥中的微生物种类很多,组成不明确,可能含有一些致病菌。
发明内容
针对以上技术问题,本发明的目的在于提供一株沼泽红假单胞菌RP1(Rhodopseudomonas palustris strain RP1),其对甲醛有较强的抗性和吸收能力,为净化甲醛提供新的微生物资源。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
一株沼泽红假单胞菌RP1 (Rhodopseudomonas palustris strain RP1),该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC:M 2017324,地址为:湖北省武汉市武昌区武汉大学,保藏日期:2017年6月9日,该菌株的基因序列如 SEQ ID NO.1 所示。
本发明还公开了沼泽红假单胞菌RP1(Rhodopseudomonas palustris strainRP1)将甲醛同化为谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、乙酸和乙醇等多种氨基酸和有机酸的机制。
本发明还公开了利用沼泽红假单胞菌RP1(Rhodopseudomonas palustris strainRP1)对甲醛有较强的抗性和持续吸收能力的特性,作为生物资源在净化甲醛污染中的应用。
本发明的沼泽红假单胞菌RP1(Rhodopseudomonas palustris strain RP1)的获得步骤为:首先采集河道污泥水,用纱布过滤去除大颗粒杂物,在滤出液中添加甲醛驯化污泥水中的微生物,然后利用光合菌的无机盐培养基分离生长快对甲醛抗性强的光合菌。
本发明的有益效果:
本发明的沼泽红假单胞菌是以甲醛驯化污水沟泥水中的微生物为材料,用光合菌的无机盐培养基分离而得的一种光合菌,为革兰氏阴性细菌,菌液为红色。菌体细胞中存在类胡萝卜素和细菌叶绿素a。在光照下能在含有4、6 mM甲醛的液体无机盐培养基中持续生长,对培养基中添加的甲醛有较好的去除效率。可将甲醛同化为谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、乙酸和乙醇等多种氨基酸和有机酸,甲醛同化为这些氨基酸和有机酸的途径是其甲醛脱毒的主要机制,这种机理的作用使RP1光合菌对甲醛有较强的抗性和吸收能力。
附图说明
图1:菌株RP1与菌株Rhodopseudomonas palustris rrnc的16S rRNA 序列同源性分析;
图2:4mM(左)和6mM(右)甲醛处理1-8天对沼泽红假单胞菌RP1和DC-2生长的影响;
图3为沼泽红假单胞菌RP1和DC-2对4mM(左)和6mM(右)甲醛吸收效率的比较;
图4为沼泽红假单胞菌RP1和DC-2甲醛代谢谱的比较。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1菌株的筛选、鉴定及检测
本发明的沼泽红假单胞菌是以甲醛驯化污水沟泥水中的微生物为材料,用光合菌的无机盐培养基分离而得的一种光合菌,其具体筛选步骤为:
1.活性污泥的驯化
采集河道污泥水,用纱布过滤去除大颗粒杂物,在滤出液中添加甲醛驯化污泥水中的微生物,甲醛浓度从起始的0.5mM,逐天递增至最终的10mM,连续处理20天。
2.光合菌的分离
驯化处理结束后,取适量污泥水溶液接种入500mL光合菌培养基(1L培养基组分为CH3CH2COONa 5g、NaHCO3 3.0g、NH4Cl 1.5g,MgSO4•7H2O 0.5g、K2HPO4 2.8 g、NaCl 2.5g, 酵母粉1.5g)的矿泉水瓶中,混合均匀盖瓶口;置于28℃,60W白炽灯下光照培养7-8天;待培养液变成红色或者血红色,吸出50mL红色液体,倒入装有新鲜培养液的矿泉水瓶中,连续富集培养2-3次。采用双层平板法进行分离纯化获得单菌落,对平板上的单菌株进行菌落形态观察及后续鉴定。
3.分离菌株的鉴定
用灭菌的牙签挑取平板上的纯培养物,转入装有培养液的25mL厌氧管中,混合均匀,装满密封,置于25℃,60W白炽灯下光照培养7-8天;待培养液变成血红色。对平板上纯化的单菌株进行菌落形态观察,取菌体涂片,进行革兰氏染色,并在显微镜下观察菌体形态,结果说明分离菌为革兰氏阴性细菌,菌体细胞大小为0.2~0.8μm。取2mL培养液转移至离心管中,8000转离心15分钟,用生理盐水将活细胞离心洗涤2-3次后,重新悬浮于60%(600g/L)的蔗糖溶液中。用60%的蔗糖溶液作空白对照,在波长200-800nm范围内测定该细菌的吸光度值,结果说明分离菌株在200-800nm波长范围内有4个特征吸收峰,分别位于375、475、509、590nm处。在475nm和509nm处有一个特殊吸收双峰,说明菌体细胞中存在类胡萝卜素;在375nm和590nm处也有吸收峰,说明菌体细胞中存在细菌叶绿素a。PCR 扩增16S rDNA产物经1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测正确后进行测序,获得的DNA序列数据如SEQ ID NO.1 所示。
将所测得的16S rDNA序列在GenBank 数据库中进行同源比对,确定分离的菌株与报道的菌株Rhodopseudomonas palustris rrnc的16S rRNA 序列同源性为100%(图1),因此将该菌株鉴定为红螺菌科的沼泽红假单胞菌,简称为沼泽红假单胞菌RP1(Rhodopseudomonas palustris strain RP1)。
实施例2 RP1对甲醛的抗性与吸收甲醛的效率分析
专利号201710038574.1公开了一株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonas palustris)DC-2,其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M2016677,该菌株对甲醛有去除能力,可用于处理甲醛污染的污水。为了和该菌株的生理生化特性进行比较,在装有25ml光合菌液体培养基的厌氧管中接入RP1和DC-2,待OD375为 0.5-0.6时加入4mM、6 mM的甲醛,23-25℃光照下培养,接种1、2、3、4、5、6、7、8天时测定菌体的OD375,观察菌体的生长状况。结果说明RP1和DC-2的 OD375在第1-2天无显著差异,呈现逐渐升高的趋势(图2左);此后在第3-4天呈现快速升高的趋势(图2左),但RP1上升的幅度大于DC-2,在5-8天基本维持不变(图2左),这些数据说明在4 mM甲醛胁迫3-8天期间,RP1的生长状况优于DC-2,其对4 mM甲醛抗性大于DC-2。在6 mM甲醛胁迫1-4天,RP1和DC-2的 OD375呈现缓慢升高的趋势(图2右),但RP1上升的幅度大于DC-2;此后在第4-8天DC-2呈现缓慢下降的趋势(图2右),而RP1呈现先缓慢升高后基本维持不变的趋势(图2右),因此在整个6 mM甲醛胁迫的1-8天内,RP1的OD375均大于DC-2(图2右),这些数据说明在6 mM甲醛胁迫期间,RP1的生长状况优于DC-2,其对6 mM甲醛的抗性也大于DC-2。
在装有25ml光合菌液体培养基的厌氧管中接入DC-2及RP1,待每种菌的OD375为0.5-0.6时分别加入4 mM、6 mM甲醛,25℃光照下培养,接种1、2、3、4、5、6、7、8天时测定处理液剩余甲醛的浓度,用不加菌液但含有相同浓度的甲醛溶液检测处理系统甲醛的挥发量,甲醛去除率按照公式:100%(处理液起始甲醛)-处理液剩余甲醛%-挥发甲醛%计算。结果说明用RP1对4 mM(图3左)、6 mM(图3右)甲醛的吸收效率在所有时间点都大于DC-2,在第8天RP1对4 mM甲醛的吸收效率达到100%时(图3左),DC-2的甲醛吸收效率仅有~70%(图3左);在第8天RP1对6mM的吸收效率达到~60%时(图3右),DC-2的甲醛吸收效率仅有~40%(图3右)。这些数据说明RC1对4 mM、6 mM甲醛的吸收效率显著大于DC-1。
实施例3
1.RP1与DC-2代谢转化甲醛机制的比较
用离心的方法收集DC-2和RP1菌体细胞2g,用4mM的H13CHO溶液(5ml,含有5 mMNaHCO3, 0.1% MES (2-N-Morpholino ethanesulfonic acid, W/V)在60W白炽灯光照下处理24 h,以不处理样品作为背景对照。处理结束后离心收集菌体,加入3ml无菌水悬浮,超声破碎抽提可溶性代谢产物,13C-NMR核磁共振分析H13CHO代谢谱(图4)。通过和已知化合物13C-NMR谱进行比较推测共振峰的归属。以甲酰胺为内参对目标共振峰进行积分,计算不同样品中各代谢物的相对含量。结果说明DC-2和RP1的甲醛代谢机制不同,经过4mM H13CHO处理 24 h 后DC-2 H13CHO代谢谱中仅出现2种甲醛同化产物,其中一种为谷氨酰胺(Gln),另一种为未鉴定归属的化合物U1。RP1的H13CHO代谢谱中出现多种甲醛同化产物,包括 [5-13C]Glu(谷氨酸)、[1-13C]Gly(甘氨酸)、[2-13C]Ala和[1-13C]Ala(丙氨酸)、[1-13C]PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)、[1-13C]Ac(乙酸)和[2-13C]Et和[1-13C]Et(乙醇)。根据共振峰进行积分计算结果说明RP1同化H13CHO的能力比DC-2大4倍,因而使RP1对甲醛的抗性和吸收甲醛的效率显著大于DC-2。
本发明的沼泽红假单胞菌是以甲醛驯化污水沟泥水中的微生物为材料,用光合菌的无机盐培养基分离而得的一种光合菌,为革兰氏阴性细菌,菌液为红色,菌体细胞中存在类胡萝卜素和细菌叶绿素a。在光照下能在含有4、6 mM甲醛的液体无机盐培养基中生长,对培养基中添加的甲醛有较好的去除效率。可将甲醛同化为谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、乙酸和乙醇等多种氨基酸和有机酸,甲醛同化为这些氨基酸和有机酸的途径是其甲醛脱毒的主要机制,这种机理的作用使RP1光合菌对甲醛有较强的抗性和吸收能力。
最终,以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 云南万魁生物科技有限公司
<120> 一株沼泽红假单胞菌RP1及其应用
<141> 2017-07-26
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1319
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌RP1(Rhodopseudomonas palustris strain)
<400> 1
GTCGACGAAC TCTTCGGAGT TAGTGGCGGA CGGGTGAGTA ACACGTGGGA ACGTGCCTTT 60
AGGTTCGGAA TAACTCAGGG AAACTTGTGC TAATACCGAA TGTGCCCTTC GGGGGAAAGA 120
TTTATCGCCT TTAGAGCGGC CCGCGTCTGA TTAGCTAGTT GGTGAGGTAA AGGCTCACCA 180
AGGCGACGAT CAGTAGCTGG TCTGAGAGGA TGATCAGCCA CATTGGGACT GAGACACGGC 240
CCAAACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATCTTGCGCA ATGGGCGAAA GCCTGACGCA 300
GCCATGCCGC GTGAATGATG AAGGTCTTAG GATTGTAAAA TTCTTTCACC GGGGACGATA 360
ATGACGGTAC CCGGAGAAGA AGCCCCGGCT AACTTCGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGA 420
AGGGGGCTAG CGTTGCTCGG AATTACTGGG CGTAAAGGGA GCGTAGGCGG ACATTTAAGT 480
CAGGGGTGAA ATCCCGGGGC TCAACCTCGG AATTGCCTTT GATACTGGGT GTCTTGAGTA 540
TGAGAGAGGT GTGTGGAACT CCGAGTGTAG AGGTGAAATT CGTAGATATT CGGAAGAACA 600
CCAGTGGCGA AGGCGACACA CTGGCTCATT ACTGACGCTG AGGCTCGAAA GCGTGGGGAG 660
CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGATTGCTA GTTGTCGGGA 720
TGCATGCATT TCGGTGACGC AGCTAACGCA TTAAGCAATC CGCCTGGGGA GTACGGTCGC 780
AAGATTAAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA 840
TTCGAAGCAA CGCGCAGAAC CTTACCACCT TTTGACATGC CTGGACCGCC AGAGAGATCT 900
GGCTTTCCCT TCGGGGACTA GGACACAGGT GCTGCATGGC TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG 960
AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTCGCC ATTAGTTGCC ATCATTTAGT 1020
TGGGAACTCT AATGGGACTG CCGGTGCTAA GCCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC 1080
CTCATGGCCC TTACAGGGTG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGCGACTACA GAGGGTTAAT 1140
CCTTAAAAGT CGTCTCAGTT CGGATTGTCC TCTGCAACTC GAGGGCATGA AGTTGGAATC 1200
GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC 1260
CCGTCACACC ATGGGAGTTG GTTCTACCCG AAGGCGCTGC GCTGACCGCA AGGAGGCAG 1319

Claims (5)

1.一株沼泽红假单胞菌RP1(Rhodopseudomonas palustris strain RP1),其特征在于:该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC:M 2017324。
2.如权利要求1所述的沼泽红假单胞菌RP1,其特征在于:该菌株的16SrRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的沼泽红假单胞菌RP1,其特征在于:RP1的甲醛同化物包括谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、乙酸和乙醇。
4.如权利要求1所述的沼泽红假单胞菌RP1,其特征在于:该菌株对甲醛有具有抗性和吸收能力。
5.如权利要求1所述的沼泽红假单胞菌RP1,其特征在于:该菌株在净化甲醛污染中作为生物资源的应用。
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