CN113322199B - 一种美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌mhmj1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)MHMJ1，该菌株的保藏编号为GDMCC NO：61367，保藏日期为2020年12月11日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为中国广州。还公开了上述菌株在净化养殖水体中无机氮磷方面的应用。该菌MHMJ1对集约化养殖水体中无机氮磷的去除效果显著，且具有良好的环境适应性，适宜大部分的海水养殖池塘水体应用；可用于进一步开发海水集约化养殖水质净化的菌剂产品，具有广阔的应用前景。

Description

一种美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1及其应用

技术领域

本发明属于微生物控制养殖水质技术领域，具体涉及一种美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1及其在净化养殖水体中无机氮磷方面的应用。

背景技术

有学者报道了分离自海洋石油污染物、红树林沉积物、高盐碱废水、深海沉积物等海杆菌的生理生态特性，证实其具有良好的硝化或反硝化功能。但有关由南海岛礁泻湖海域鱼类组织中分离海杆菌，并根据对虾集约化养殖水环境净化需求将之科学应用于水体氮磷去除的相关研究还少见报道。

在集约化水产养殖过程中如果水中的氨氮、亚硝酸盐氮等对水产动物有严重毒害作用，且易在高密度集约化养殖水体中大量积累，危害养殖动物的健康。因此养殖水体氨氮、亚硝酸盐氮的去除技术研究已然成为了热点。目前常见的技术方法主要包括物理、化学和生物等三种途径。物理法通过利用比表面积较大的特定固体进行吸附净化，常用的如：沸石粉、白云石粉、珊瑚沙等，虽然价格不高但吸附能力尚有所限(饶力2016)，一般实际生产时多通过排换水缓解无机氮磷超富营养化的积累效应。化学法通过使用化学氧化剂等消除亚硝酸盐氮、氨氮等有害氮素的不良影响，但这也只是促使无机氮的化学形式发生改变而已，效果并无法稳定持续，反复使用的成本交高，如果操作不当还可能会造成水体的二次污染，潜在的生态安全风险相对较大(林虹2006)。生物法以特定的微生物对水体中的无机氮磷进行吸收转化，具有环境友好，效果持续稳定等优点(王战蔚等 2013)。然而，对集约化养殖水体中硝酸盐氮、总无机氮和磷酸盐的高效去除问题则相对有所忽视，尤其在中高盐度的海水养殖中相关技术更是相对匮乏。有学者尝试应用多营养级生物的混合生态养殖模式解决此类问题，通过海洋微藻+贝类的食物链方式去除水体中富余的氮磷营养盐；又或是利用碱蓬、红树等耐盐植物对养殖水体进行异位净化以去除水中的氮磷营养。总体而言，其氮磷的去除效率相对较低，无法切实满足类似于对虾的高密度集约化养殖生产的水体高效净化需求。

在利用微生物净化水体氮素方面，国内外大多采用培养活性污泥的方式，去除水体中的氨氮、亚硝酸盐氮等，而已纯菌扩大培养方式因其对菌株的要求较高，故少见大规模应用(杨宁2003；王娟2006)。金志刚等(1998)利用活性污泥富集培养硝化菌，温度30℃、pH6.5-8.0、DO 2.0mg/L条件下，硝化菌浓度提高了12.5-20倍。Shan和Obbard(2001)用硝化菌固定化技术净化龙虾养殖废水获得了理想的效果。刘伶俐(2012)富集的淡水型硝化菌对氨氮的去除速率为0.12 mg/g·h，海水型菌为0.13mg/g·h，两者差异不大。虽然微生物固定化技术备受关注也进行了不少的有益探索和尝试，但是目前多只停留在小规模、小范围的应用实验阶段，距离大规模产业化的高效应用还有一定的差距。

南海纵跨热带、亚热带，是世界最大的边缘海之一，但它却是一个典型的寡营养海区(袁梁英2005)。另一方面，南海生物资源丰富多样(王庆琳等2020)，其中的海洋微生物对该海区的营养水平和生物资源具有重要影响。由此，从南海远海岛礁海域的健康鱼体中筛选挖掘可高效去除水体无机氮磷的微生物菌株资源，更符合海水养殖水体净化中对菌株环境适应性、生态功能效率、养殖生物安全性等的实际要求。

目前未见关于以南海岛礁鱼源除烃海杆菌MHMJ1净化养殖水体无机氮磷的相关菌株的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1，该菌株 MHMJ1对养殖水体中的无机氮磷具有较强的净化能力，且环境适应性良好，对养殖鱼虾无不良影响。

本发明的目的还在于提供上述美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1在净化养殖水体中无机氮磷方面的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)MHMJ1，该菌株的保藏编号为GDMCC NO：61367，保藏日期为2020年12月11日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为中国广州。

本发明中养殖池塘环境与背景技术中的水体环境存在巨大差异，有必要以集约化海水池塘养殖生产实际需求，筛选具有无机氮磷去除功能的有益微生物菌株，并分析评估菌株的环境适应性、生态功能效率、应用安全性等特点研发适宜生产实际应用的菌剂产品和应用技术。而非简单套用污水处理工程技术中的相关细节，忽视养殖生物对安全、高效、生态功能稳定的具体需求。因此，本发明通过筛选的美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1对集约化养殖水体中的无机氮磷具有良好的去除作用，且对凡纳滨对虾无明显不良影响。

本发明中的美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1的筛选分离鉴定过程为：在南海美济礁泻湖内以游钓方式采集了多条体长为13-16cm的健康蜂巢石斑鱼(Epinephelusmerra)，将刚离水的鱼体样本进行解剖，取3-5尾鱼的鳃组织置于装有液体培养基的菌种培养管中，室温下振荡培养。待回到陆地实验室将微生物样品，置于光合细菌液体培养基中振荡培养3～5天，温度30～35℃，光照强度 3000～4000lx；将培养好的菌液在光合细菌固体平板培养基上进行划线培养，培养2～3天，挑选不同形态的单菌落，分离纯化获得生长性能好的菌株。然后把菌株接种至光合细菌液体培养基，30～35℃，光照强度3000～4000lx，200～300 rpm进行摇床扩大培养2～3天。选取生长性能良好，可有效降低水体中磷酸盐、氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和总无机氮浓度的菌株进行菌种鉴定和保种备用。综合16S rDNA基因序列分析、生化鉴定，以及形态特质等各项结果。认定该美济礁泻湖鱼源菌株MHMJ1为除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)。

该美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1在温度25～40℃、盐度20～40、 pH8～10、溶解氧含量3.5mg/L以上时菌株可良好生长并能有效去除水体中的无机氮磷。在最佳条件下与集约化养殖水体营养环境中生长1～2天可达到10⁹ CFU/mL数量水平，到12天时仍可达到10⁸CFU/mL，该菌株适宜在大部分海水集约化养殖池塘应用。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1在净化养殖水体中无机氮磷方面的应用。

该美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1按1.2×10⁴CFU/mL接种至灭菌养殖池塘水中，24h后的菌浓度一直稳定在10⁹CFU/mL数量水平，到6-12天时菌量还可保持在10⁸CFU/mL数量水平。该菌株适宜在大部分海水养殖池塘应用，当水体盐度为22～40、温度30℃时，第3天时菌株对磷酸盐(DIP)、氨氮(NH₃-N)、亚硝酸盐氮(NO₂ ^--N)、硝酸盐氮(NO₃ ^--N)和总无机氮(TIN)的去除率分别可达73.8-93.8％、93.4-96.0％、98％以上、92％以上、90％以上。在对虾集约化养殖池塘使用含有上述除烃海杆菌MHMJ1菌株的菌剂，养殖110天平均单产4.52kg/m³，菌株对养殖对虾无明显不良影响。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明中的除烃海杆菌MHMJ1筛选自南海美济礁泻湖蜂巢石斑鱼的鳃组织，对养殖生物无不良影响；

(2)本发明中的菌株MHMJ1对集约化养殖水体中无机氮磷的去除效果显著，且具有良好的环境适应性，适宜大部分的海水养殖池塘水体应用；

(3)本发明中的菌株MHMJ1应用于集约化对虾养殖的水质净化可达到良好的生产应用效果，可在无需配置价格昂贵的水质净化设备的条件下大幅降低水体中亚硝酸盐氮、氨氮、TIN、磷酸盐等无机氮磷的浓度，达到养殖水质净化，减少生产中水体更换的良好效果；可用于进一步开发海水集约化养殖水质净化的菌剂产品，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例3中MHMJ1菌株的生长曲线；

图2是实施例3中不同盐度下水体磷酸盐浓度的变化，图中0为没加菌前， 3为加菌后的第3天，6为加菌后的第6天，12为加菌后的第12天，下同；

图3是实施例3中不同盐度下水体氨氮浓度的变化；

图4是实施例3中不同盐度下水体亚硝酸氮盐浓度的变化；

图5是实施例3中不同盐度下水体硝酸氮盐浓度的变化；

图6是实施例3中不同盐度下水体TIN浓度的变化；

图7是实施例3中不同pH下水体磷酸盐浓度的变化；

图8是实施例3中不同pH下水体氨氮浓度的变化；

图9是实施例3中不同pH下水体亚硝酸盐氮浓度的变化；

图10是实施例3中不同pH下水体硝酸盐氮浓度的变化；

图11是实施例3中不同pH下水体TIN浓度的变化；

图12是实施例3中不同温度下水体磷酸盐浓度的变化；

图13是实施例3中不同温度下水体氨氮浓度的变化；

图14是实施例3中不同温度下水体亚硝酸盐氮浓度的变化；

图15是实施例3中不同温度下水体硝酸盐氮浓度的变化；

图16是实施例3中不同温度下水体TIN浓度的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1的筛选与培养

1、材料准备

1.1、菌源

在南海美济礁泻湖内以游钓方式采集了多条体长为13-16cm的健康蜂巢石斑鱼(Epinephelusmerra)，将刚离水的鱼体样本进行解剖，取3-5尾鱼的鳃组织至于装有液体培养基的菌种培养管中，室温下振荡培养。待回到陆地实验室再以光合细菌培养基平板进行菌落分离、纯化培养。

1.2、培养基

(1)光合细菌液体培养基：CH₃COONa：3g、酵母膏：1g、MgSO₄·7H₂O： 0.2g、NH₄Cl：0.05g、NaCl：28g、NaNO₂：0.05g、KNO₃：0.18g、KH₂PO₄：0.01g、生长因子溶液1mL，以上药品分别溶于蒸馏水中，并定溶至1000mL，pH7.0。

生长因子溶液：MnSO₄·H₂O：0.25g、FeSO₄·7H₂O：7g、CaCl₂：5g、谷氨酸：0.02g，以上药品分别溶于蒸馏水中，并定溶至100mL，pH7.0。

(2)光合细菌固体平板培养基：在光合细菌液体培养基的基础上加入琼脂粉20g/L，制备成固体平板培养基。

2、菌株的筛选培养

在实验室条件下将采集自南海美济礁泻湖蜂巢石斑鱼鳃组织的微生物样品，置于光合细菌液体培养基中振荡培养3～5天，温度30～35℃，光照强度3000～ 4000lx；将培养好的菌液在光合细菌固体平板培养基上进行划线培养，培养2～3 天，挑选不同形态的单菌落，分离纯化获得生长性能好的菌株。然后把菌株接种至光合细菌液体培养基，30～35℃，光照强度3000～4000lx，200～300rpm进行摇床扩大培养2～3天。选取可有效降低水体中磷酸盐、氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和总无机氮(TIN)浓度的菌株进行菌种鉴定和保种备用。其中，菌株 MHMJ1在初筛过程中体现了良好的生长性能，且对磷酸盐、氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和总无机氮(TIN)均具有良好的去除效果。

实施例2美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1的鉴定

本实施例对美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1进行了16S rDNA分子的鉴定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。 16S rDNA序列分析主要按照以下步骤：

1、细菌基因组DNA的提取：

(1)用无菌牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养；

(2)取细菌培养液1.5mL，10000rpm(11,500g)离心1分钟，尽量吸净上清；

(3)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，加入180μL 终浓度为20mg/mL的溶菌酶，37℃处理30分钟以上；

(4)向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；

(5)加入220μL缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(6)加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(8)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm(13,400g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(9)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm(13,400g)离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；

(10)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm(13,400g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13,400g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12000rpm(13,400g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中；

(13)DNA浓度及纯度检测

回收得到的DNA片段用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。

2、16S rDNA基因的PCR扩增

16S rDNA的扩增所采用的细菌通用引物由(生工生物工程(上海)股份有限公司合成，正向引物(8F)为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物(1492R)为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。50μL PCR反应体系包括：灭菌双蒸水37μL，引物各1μL，dNTPs(2.5mmol/L)，Tap酶1μL，10×PCR buffer 5μL， DNA模板1μL。PCR反应条件：95℃3分钟，95℃1分钟，48℃1分钟，72℃2分钟，共30个循环；72℃10分钟。

3、16S rDNA序列测定

扩增结束，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，送生工生物工程(上海) 股份有限公司测序。测得其序列如下，具体如SEQ ID NO：1所示： tcccatgggcaaggtcgagcggtaacaggggaagcttgcttcccgctgacgagcggcggacgggtgagtaatgcttagg aatctgcccagtagtgggggatagcccggggaaacccggattaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggatc ttcggaccttgcgctattggatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccgtag ctggtctgagaggatgatcagccacatcgggactgagacacggcccgaactcctacgggaggcagcagtggggaatatt ggacaatgggggcaaccctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggctttcgggttgtaaagcactttcagtaggga ggaaaaccttatggttaatacccatgaggcttgacgttacctacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcg gtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttggtaagcgagatgtgaaa gccccgggcttaacctgggaacggcatttcgaactgtcagactagagtgtggtagagggtagtggaatttcctgtgtagcg gtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcggctacctggaccaacactgacactgaggtgcgaaa gcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttgggactcttgaagtc ttagtggcgcagctaacgcactaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacggggg cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgacgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatccagagaactttc cagagatggattggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggccgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggtta agtcccgtaacgagcgcaacccctatccctggttgctagcaggtaatgctgagaactccagggagactgccggtgacaaa ccggaggaaggtggggatgacgtcaggtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggcgcgtaca gagggctgccaactcgcgagagtgagccaatcccttaaaacgcgtcgtagtccggatcggagtctgcaactcgactccgt gaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac catgggagtggattgcaccagaagtagttagtctaaccttcgggaggacgataccaccggtggt。

4、美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1的菌落形态、生理特征

菌株MHMJ1的菌落形态、生理特征见下表1。

表1菌株MHMJ1的菌落形态、生理特征

5、菌株MHMJ1的鉴定

将该菌16S rDNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对分析，综合16SrDNA基因序列分析、生化鉴定，以及形态特质等各项结果。认定该美济礁泻湖鱼源菌株MHMJ1为除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)。查阅有关资料，尚无研究报道以采集美济礁泻湖鱼类机体的除烃海杆菌 (Marinobacterhydrocarbonoclasticus)用于净化对集约化对虾养殖水体无机氮磷。该菌株已于2020年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号： GDMCC NO：61367，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院广东省微生物研究所广东省微生物菌种保藏中心。

实施例3除烃海杆菌MHMJ1的小规模应用

1、菌株的生长

将实施例1获得的菌株MHMJ1按1.2×10⁴CFU/mL接种至灭菌养殖池塘水中，24h后的菌浓度一直稳定在10⁹CFU/mL数量水平，菌株MHMJ1的生长曲线如图1中所示。

2、不同盐度下MHMJ1对水体中无机氮磷的去除效果

将灭菌对虾集约化养殖池塘水体(水体盐度22)作为基础测试水体对照，测试过程中不添加MHMJ1。加菌组以蒸馏水和海盐调节水体盐度为4、22、40，将实施例1获得的MHMJ1按10⁵-10⁶CFU/mL接种至不同盐度的测试水体中，于30℃，光照强度3000-6000Lx，水体pH值7.8-8.5，200-300rpm进行摇床培养 12天，每组测试样品设置3个平行。每3天监测水体中磷酸盐(DIP)、氨氮(NH₃-N)、亚硝酸盐氮(NO₂ ^--N)、硝酸盐氮(NO₃ ^--N)和总无机氮(TIN)浓度的变化状况。盐度4-40时测试期间的菌量为1.2×10⁶CFU/mL～5.0×10⁸CFU/mL。

如图2中所示，对照组和盐度4组的DIP浓度与初始值相比变化不大，保持在7.541-7.917mg/L；盐度22和40组的DIP去除效果明显，第3天两组的浓度值分别从初始的7.643mg/L降低至2.002mg/L和0.472mg/L，其平均去除率分别为73.8％和93.8％，第6-12天时其DIP浓度略有升高。

如图3中所示，对照组和盐度4组的NH₃-N浓度与初始值相比变化不大，保持在19.121-21.972mg/L；盐度22和40组的NH₃-N去除效果明显，第3天两组的浓度值分别从初始的20.596mg/L降低至1.368mg/L和1.189mg/L，其平均去除率分别为93.4％和94.2％，但到低12天时其NH₃-N浓度略有升高。

如图4中所示，对照组和盐度4组的NO₂ ^--N与初始值相比均略有升高，保持在8.515-9.902mg/L；盐度22和40组的NO₂ ^--N去除效果明显且稳定，第3-12 天期间它们的浓度值均低于0.1mg/L，去除率为99.2％-99.7％。

如图5中所示，对NO₃ ^--N的去除效果与NO₂ ^--N的类似，对照组和盐度4 组的浓度值无明显变化，盐度22和40组NO₃ ^--N的去除效果明显且稳定，第3-12 天期间它们的浓度值均低于0.15mg/L，去除率为99.4％-99.6％。

如图6中所示，对照组和盐度4组的TIN浓度值无明显变化，第3-12天期间盐度22和40组的TIN由初始的52.245mg/L下降了90％以上，第3天时两个组的净化效果最佳，其去除率分别达为97.3％和97.6％。

可见，菌株MHMJ1虽然在盐度小于5的水体中也可存活，但其对无机氮磷的去除效果受到了明显的抑制，只有在盐度大于20以上的海水环境中才能具有良好的无机氮磷净化功能。一般用菌第3天水体氮磷去除效果较好，在使用时应注意控制用菌效应时间，或在第3天时重复用菌，以强化或稳定氮磷去除效果。

3、不同pH下MHMJ1对水体中无机氮磷的去除效果

将灭菌对虾集约化养殖池塘水体(水体盐度22，pH值为8.0)作为基础测试水体对照，置于30℃下恒温培养，其中不添加菌株MHMJ1。加菌组则将实施例1获得的菌株MHMJ1按10⁵-10⁶CFU/mL接种至不同pH值的测试水体中，pH 值为分别设置为6、8、10，光照强度3000-6000Lx，200-300rpm进行摇床恒温 30℃培养12天，每组测试样品设置3个平行。每3天监测水体中磷酸盐(DIP)、氨氮(NH₃-N)、亚硝酸盐氮(NO₂ ^--N)、硝酸盐氮(NO₃ ^--N)和总无机氮(TIN) 浓度的变化状况。各个组测试期间的菌量为1.72×10⁶CFU/mL～6.77×10⁸CFU/mL，无明显差异。

如图7中所示，对照组DIP浓度与初始值相比变化不大，保持在7.662-7.884 mg/L；pH8组和pH10组的DIP去除率在第6天使即可达到57-60％，随后降低至33％-35％；pH6组的DIP去除效果起效较慢，直到第12天时其去除率才达到 47％。

如图8中所示，对照组NH₃-N浓度保持在18.628-20.337mg/L；pH8组和pH10 组的NH₃-N去除率在第3天使即可达到最高，分别为91.7％和99.2％，随后不断降低，第12天时分别为74.5％和85.9％；pH6组的起效相对延迟，直到第12天时其去除率才达到62.1％。

如图9中所示，对照组NO₂ ^--N浓度保持在9.471-9.787mg/L；pH8组和pH10 组的NO₂ ^--N去除率在监测期间多保持在99.5％以上；pH6组的起效相对延迟，但到第12天时其去除率也达到99.6％。表明菌株MHMJ1对NO₂ ^--N具有良好的去除效果。

如图10中所示，对照组NO₃ ^--N浓度保持在23.156-23.910mg/L；12天时3 个测试组的NO₃ ^--N去除率均达到99.5％以上，相较而言pH8组和pH10组起效时间更快，第3天即可达到99.0％以上，pH6组到第12天时才达到该水平。

如图11中所示，对照组TIN浓度值无明显变化，保持在50.880-53.533mg/L，测试期间pH8组和pH10组的TIN去除率均达到90.3％-99.6％，起效快效果好， pH6组到第12天时才达到85.5％。

可见，菌株MHMJ1虽然在pH6-10的水体中均可良好存活和生长，达到10⁸ CFU/mL数量水平，但其对无机氮磷的去除效果而言，pH8组和pH10组的总体起效时间更快，效果也更佳。一般用菌第3-6天水体氮磷去除效果较好，其后 DIP和NH₃-N的浓度会略有升高，因此，在使用时应注意控制用菌效应时间，或在第3-6天时重复用菌，以强化或稳定氮磷去除效果。

4、不同温度下MHMJ1对水体中无机氮磷的去除效果

将灭菌对虾集约化养殖池塘水体(水体盐度22，pH值为8.0)作为基础测试水体对照，置于30℃下恒温培养，其中不添加菌株MHMJ1。加菌组则将实施例1获得的菌株MHMJ1按10⁵-10⁶CFU/mL接种至不同温度的测试水体中，培养温度分别设置为10℃、20℃、30℃、，水体盐度22，pH值为8.0，光照强度 3000-6000Lx，200-300rpm进行摇床恒温培养12天，每组测试样品设置3个平行。每3天监测水体中磷酸盐(DIP)、氨氮(NH₃-N)、亚硝酸盐氮(NO₂ ^--N)、硝酸盐氮(NO₃ ^--N)和总无机氮(TIN)浓度的变化状况。测试期间10℃组的菌量一直维持在10⁶CFU/mL数量水平，20-40℃组的菌量第3天后的菌量即可生长维持在10⁸-10⁹CFU/mL数量水平。

如图12中所示，对照组和10℃组的DIP浓度与初始值相比变化不大,保持在7.903-9.914mg/L；20℃组和30℃组在第3天时的DIP去除率达到最高分别为 93.0％和87.3％，随后降低至33.2％-61.0％；40℃组在测试期间维持在62.8％-73.8％。

如图13中所示，对照组和10℃组的NH₃-N浓度与初始值相比变化不大,保持在20.357-28.350mg/L；20℃组和30℃组在第3天时的NH₃-N去除率达到最高分别为96.0％和94.8％，随后逐渐降低至51.9％-56.7％；40℃组在测试期间维持在78.1％-86.9％。

如图14中所示，对照组和10℃组的NO₂ ^--N浓度与初始值相比变化不大,保持在8.991-10.825mg/L；其余三个温度组在测试期间的NO₂ ^--N去除率多稳定在 98％以上，表明菌株MHMJ1对NO₂ ^--N具有良好的去除效果。

如图15中所示，测试过程中对照组和10℃组的NO₃ ^--N浓度始终保持在7.359-13.637mg/L的较高水平，30℃组和40℃组的NO₃ ^--N去除率均达稳定维持在92％以上，20℃组的起效时间相对有所延迟，到第9天之后NO₃ ^--N去除率才达到60.1％-71.5％。

如图16中所示，对照组和10℃组的TIN浓度值变化不大，一直维持在36.756-51.979mg/L的较高水平窄幅波动，30℃组和40℃组的TIN去除率第3天时达到最高分别为95.6％和92.5％，随后降低至77.6％-88.5％；20℃组的TIN去除效果略低于前两组，其去除率维持在60.8％-71.6％范围内小幅波动。

可见，菌株MHMJ1在10℃时只能存活但无法生产和发挥氮磷去除功能，在20℃-40℃时菌株MHMJ1生长良好，总体而言30℃-40℃时菌株的氮磷去除效果更佳，考虑到第6天后水体中的DIP和NH₃-N的浓度会略有升高，因此，在使用时应注意控制用菌效应时间，或在第3-6天时重复用菌，以强化或稳定氮磷去除效果。

5、菌株MHMJ1在凡纳滨对虾高密度零换水养殖生产的应用效果

在广东省汕尾甲西镇养殖基地、广东冠利达海洋生物有限责任公司茂名岭门镇的凡纳滨对虾高密度集约化养殖生产中对菌株MHMJ1进行了应用测试。先依照实施例1中所述培养基和培养方法，将菌株接种至液体发酵罐中，30～35℃下培养2～3天，获得菌量约为10⁹CFU/mL的MHMJ1菌剂，以甲西镇养殖基地的应用为例，一般用菌浓度为10⁴-10⁶CFU/mL，其流程为在放苗15d内适量添加红糖和MHMJ1菌剂至水体中，反复使用3～4次。其后养殖期间每6d定期添加MHMJ1菌剂，菌剂使用前利用适量红糖和粉状对虾饲料对菌剂进行活化扩大培养，再将扩陪的菌液进行全池均匀泼洒；同时，利用生石灰水等稳定调节水体总碱度与pH值。全程利用水车式增氧机和鼓风机充气保持水体流动和强化增氧。结果显示，该菌剂的养殖应用效果良好，集约化养殖凡纳滨对虾110天平均单产 4.52kg/m³，表明其对养殖生物无不良影响；虾池水体盐度25-34，水温25-32℃、 DO>7.2mg/L、pH 7.7-8.5，测定水体的氨氮浓度为1.72mg/L、亚硝酸盐氮 0.066mg/L、硝酸盐氮0.394mg/L、无机磷0.152mg/L。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

广东冠利达海洋生物有限责任公司

<120> 一种美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1427

<212> DNA

<213> Marinobacter hydrocarbonoclasticus

<400> 1

tcccatgggc aaggtcgagc ggtaacaggg gaagcttgct tcccgctgac gagcggcgga 60

cgggtgagta atgcttagga atctgcccag tagtggggga tagcccgggg aaacccggat 120

taataccgca tacgtcctac gggagaaagc aggggatctt cggaccttgc gctattggat 180

gagcctaagt cggattagct agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga cgatccgtag 240

ctggtctgag aggatgatca gccacatcgg gactgagaca cggcccgaac tcctacggga 300

ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggg gcaaccctga tccagccatg ccgcgtgtgt 360

gaagaaggct ttcgggttgt aaagcacttt cagtagggag gaaaacctta tggttaatac 420

ccatgaggct tgacgttacc tacagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgcg cgtaggtggt 540

ttggtaagcg agatgtgaaa gccccgggct taacctggga acggcatttc gaactgtcag 600

actagagtgt ggtagagggt agtggaattt cctgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatag 660

gaaggaacac cagtggcgaa ggcggctacc tggaccaaca ctgacactga ggtgcgaaag 720

cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgtcaactag 780

ccgttgggac tcttgaagtc ttagtggcgc agctaacgca ctaagttgac cgcctgggga 840

gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900

tgtggtttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac cttacctggc cttgacatcc agagaacttt 960

ccagagatgg attggtgcct tcgggaactc tgagacaggt gctgcatggc cgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg taacgagcgc aacccctatc cctggttgct 1080

agcaggtaat gctgagaact ccagggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140

tgacgtcagg tcatcatggc ccttacggcc agggctacac acgtgctaca atggcgcgta 1200

cagagggctg ccaactcgcg agagtgagcc aatcccttaa aacgcgtcgt agtccggatc 1260

ggagtctgca actcgactcc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcgaat cagaatgtcg 1320

cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtggattgca 1380

ccagaagtag ttagtctaac cttcgggagg acgataccac cggtggt 1427

Claims (2)

1.一种美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)MHMJ1，其特征是：该菌株的保藏编号为GDMCC NO：61367，保藏日期为2020年12月11日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为中国广州。

2.权利要求1所述的美济礁泻湖鱼源除烃海杆菌MHMJ1在净化养殖水体中无机氮磷方面的应用。

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