CN105199994B - 一种具有反硝化功能的除烃海杆菌stw2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有反硝化功能的除烃海杆菌STW2及其应用。除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2，其保藏编号为CCTCC NO：M 2014339。本发明的除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2具有反硝化和有机物多环芳烃降解功能，因此可以将其应用于反硝化进行脱氮中以及降解多环芳烃有机物，从而能够有效应用于海洋滨海湿地生态系统的修复和保护中，具有较好的应用前景。
Description
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一种具有反硝化功能的除烃海杆菌STW2及其应用。
背景技术：
由于经济的发展和城市化进程的推进，人类活动在滨海湿地生态系统区域日益频繁，使得越来越多的无机污染和有机污染物质进入到滨海湿地系统中，对生态系统造成严重的破坏，其中比较常见的是无机氮污染和多环芳烃、农药、多氯联苯、邻苯二甲酸酯等有机污染物等有机污染物。滨海生态系统中的氮素富集，常常蕴含着过量的高浓度氨氮和亚硝酸氮的积累，从而会对海洋生物产生直接的毒害作用，降低其免疫力，引发病原生物入侵从而造成，而好养反硝化功能菌介导的反硝化作用可以有效地缓解这一现象(Camargo andAlonso,2006)。好氧反硝化菌(Aerobic Denitrifier)是一类能够在有氧条件下，利用好氧反硝化酶进行反硝化作用的反硝化菌，在这个过程中通过它能够使硝酸盐(NO3 -)逐步转变为亚硝酸盐(NO2 -)、一氧化二氮(N2O)和氮气(N2),从而达到脱氮的目的。水体脱氮最有效且环保的方法即采用硝化反硝化微生物进行水体修复，且具有高效、价格低廉、安全性较高等特点。目前已有报道的好氧反硝化菌主要包括假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)和芽孢杆菌属(Bacillus)等,属好氧或兼性好氧异养微生物，而关于海杆菌的报道较少(Li et al.,2013)。
有机污染物多环芳烃具有致癌、致畸、致突变性、半挥发性、亲脂性、高生物蓄积性和难降解等特性，其能够在环境中长时间存在、长距离迁移并富集于生物体，给人类健康和生态系统安全造成长期而严重的危害，而在海洋湿地环境中的多环芳烃除较少部分通过光化学分解外，大多数还是依赖于生物降解的途径进行消除，微生物降解是一条高效途径。已有研究表明海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)在高达20％的盐浓度下仍能降解烃类，具有更为广泛的应用性。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种同时具有反硝化和有机物多环芳烃降解功能的除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2，该菌于2014年7月10号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014339。
本发明的除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2具有反硝化和有机物多环芳烃降解功能。
因此本发明的第二个目的是提供除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)STW2在通过反硝化进行脱氮中的应用或者在降解多环芳烃有机物中的应用。
本发明的除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2具有反硝化和有机物多环芳烃降解功能，因此可以将其应用于反硝化进行脱氮中以及降解多环芳烃有机物，从而能够有效应用于海洋滨海湿地生态系统的修复和保护中，具有较好的应用前景。
除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2于2014年7月10号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014339。
附图说明：
图1是除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2的16S rDNA的系统进化发育树，图中的STW2表示除烃海杆菌(M.hydrocarbonoclasticus)STW2；
图2是除烃海杆菌STW2的nosZ的系统进化发育树，图中的STW2表示除烃海杆菌(M.hydrocarbonoclasticus)STW2。
图3是好氧条件下除烃海杆菌STW2的反硝化效率测定。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2的分离和纯化.
样品采集：2012年4月于中国海南省新村湾海草生态系统海菖蒲(Enhalusacodoides)根际沉积物，取1g沉积物样品于装有100mL无机盐培养基并含有一定量PAHs(萘、芴和芘各含量为100mg/L)的三角瓶中，以多环芳烃(奈、芴和芘)为唯一碳源，采用定向富集法、逐级驯化获得菌株，用锡箔纸包裹遮光置于摇床中30℃，200rpm震荡培养，然后进一步通过反硝化培养基培养进行筛选、分离和纯化，最终筛选出一株具有兼具有好氧反硝化和多环芳烃降解能力的菌株，命名为：菌株STW2。
反硝化培养基：pH：7.0，含KNO32.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，K2HPO4.3H2O 0.5g，C4O6H2KNa 20.0g，去离子水1L。灭菌消毒备用。
无机盐培养基(MSM)的组分为：(NH4)2SO4,1,000mg/L、Na2HPO4,800mg/L、KH2PO4,200mg/L、MgSO4·7H2O,200mg/L、Ca(NO3)2·4H2O,50mg/L；其中微量元素：FeCl3·3H2O,5mg/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O,1mg/L、MnCl2,0.2mg/L、CuSO4,0.02mg/L、CoCl2,0.02mg/L。灭菌消毒备用
实施例2：除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2的鉴定
1、形态学特征：
菌株STW2，为革兰氏阴性，杆状，在LB或2216E培养基上，菌落均呈灰白色，不透明，表面光滑湿润，边缘比较规则，中央微凸起，菌落形态大小1-3mm，NaCl的生长范围为0-22％，最适浓度为5％，能够进行硝酸盐还原，利用七叶苷、葡萄糖、麦芽糖和木糖。
2、16S rDNA和功能基因序列鉴定：
选择实施例1分离纯化得到的菌株STW2进行基因组DNA提取和纯化，其操作方法参考东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》P409。采用细菌的通用引物16SF/16SR(Weisenburg etal.,1991，16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.，Journal ofbacteriology,1991,173(2):697-703)和nosZ的引物(Rich J,et al.Communitycomposition and functioning of denitrifying bacteria from adjacent meadow andforest soils.Applied and Environmental Microbiology,2003,69(10):5974-5982.)作为引物，以菌株STW2基因组DNA作为模板，进行16S rDNA的PCR扩增，具体的PCR反应体系如下：16S rDNA PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性60sec，退火温度55℃复性90sec，72℃延伸60sec，进行35个循环后；72℃延伸10min；nosZ的PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性30sec，退火温度55℃复性40sec，72℃延伸40sec，进行40个循环后；72℃延伸10min。取5μL的扩增产物进行电泳，电压为100V，琼脂糖凝胶为1％，EB泡胶，用凝胶成像系统观察泳结果并拍照，若有目的条带的出现，则将剩余的PCR产物直接交与Invitrogen生物技术有限公司用ABI Prism 3730XL DNA分析系统测序，并将测序分析得到的16S rDNA(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和一氧化氮还原酶nosZ(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)通过Extaxon Cloud或者GenBank中的BLAST与GenBank数据库中的序列进行比对，对其种属鉴定进行初步的确定。建立系统发育树，系统发育树如图1，从图1的系统发育树可以看出与菌株STW2的16S rDNA序列具有较近亲缘关系的序列均来自Marinobacter属，其与Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 49840的相似度为97.70％；图2中菌株STW2的nosZ基因与NCBI数据库中的海杆菌M.pelagius R42的相似度为85％。由此表明菌株STW2的为一株潜在新种，命名为：除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2，于2014年7月10号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014339。
实施例3：菌株STW2的反硝化功能效率测定
将待测菌株-除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2接种到反硝化液体培养基中，于30℃,180rpm过夜培养，待菌液浑浊后取适量分别接种到24个含有60mL反硝化液体培养基的100mL锥形瓶中，并保证每个瓶中的初始接种量是相同的。分别在0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h(每个时间点3个重复)，取出上清液，测定其NO3-N和NO2-N的含量(NO3-N采用GB7480-87酚二磺酸紫外分光光度法(Gihring et al.,2010)；NO2-N采用GB7493-87N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(Fan et al.,2006)，功能菌株的反硝化速率的计算公式如下：
反硝化液体培养基：pH：7.0，含KNO32.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，K2HPO4.3H2O 0.5g，C4O6H2KNa 20.0g，去离子水1L。灭菌消毒备用。
反硝化速率(mg·L-1·h-1)＝([NO3-N]initial-[NO3-N]final-[NO2-N]final)/t.
其中：[NO3-N]initial：反应前硝态氮浓度；
[NO3-N]final；反应后硝态氮浓度；
[NO2-N]final：反应后硝态氮浓度.
结果如图3所示，从图3中可以看出，在前24h内，硝酸盐浓度由145mg/L降至58mg/L，脱氮效率高达为60％，而48h内，脱氮效率高达74％，整个反应过程中，脱氮效率约为86％，而且在整个反应过程中没有亚硝酸盐的积累，因而没有氮素富集效应，对于环境中的其他生物不会产生毒害效应，具有生态修复的巨大潜力。
Claims (2)
1.除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2，其保藏编号为CCTCCNO：M 2014339。
2.权利要求1所述的除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2在通过反硝化进行脱氮中的应用或者在降解多环芳烃有机物中的应用。
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