CN101514329A - 具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌，它的16S rDNA具有SEQ ID No.1的序列，该菌株在固体培养基中呈淡桔红色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，直径为1－2mm；菌体的形态为稍粗杆菌，长度在10μm左右；形成芽孢，芽孢为椭圆形；好氧，革兰氏染色阳性，接触氧化酶阴性，能以BTEX混合物或其中的单一物质为唯一碳源，可实现高效降解BTEX混合物。

Description

具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及苯系化合物生物处理技术领域，尤其涉及一种具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

苯系化合物是一类易挥发的单环芳香类化合物，包括苯、甲苯、乙苯、二甲苯等，简称为BTEX，广泛应用于石油、化工、农药、纺织、造纸、油漆、制鞋等工业的生产过程，是环境中分布较广的一类有毒化合物。BTEX具有“三致效应”，被许多国家列入优先控制污染物，且已被确认为强致癌物质。研发废水、废气中BTEX的污染控制技术显得十分重要和迫切。目前，生物降解技术是降解这类物质的最有效方法之一。

采用生物法净化废水、废气中BTEX等有毒化合物的关键之一便是获得具有高效降解BTEX能力的优良菌株。人们已经分离出了多株单环芳香类化合物降解菌，主要有假单胞菌(Pseudomonas)、不动杆菌(Acinetobacter)、红球菌(Rhodococcus)、罗尔斯通氏菌(Ralstonia)、产碱杆菌(Alcaligenes)、黄杆菌属(Flavobacterium)、孢瓶霉属真菌(Cladophialophora)、诺卡氏菌(Nocardia)等。这些降解菌株仅能降解某一种或两种苯系化合物，且大多数菌株的降解效率有待进一步提高，而对BTEX混合物中各物质均能实现高效降解的菌株并不多见。

经检索有关专利文献，仅发现有关于芽孢杆菌(Bacillus bataviensis PBACGMCC No.1092)在厌氧条件下反硝化降解苯的报道，尚未见本发明中在好氧条件下应用Bacillus amyloliquefaciens降解BTEX的报道。该降解菌的发现对BTEX类污染物生物净化的工程实践具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：提供一种具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌，它的16S rDNA具有SEQ ID No.1的序列。该菌株在固体培养基中呈淡桔红色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，直径为1-2mm；菌体的形态为稍粗杆菌，长度在10μm左右；形成芽孢，芽孢为椭圆形；好氧，革兰氏染色阳性，接触氧化酶阴性，能以BTEX混合物或其中的单一物质为唯一碳源。

本发明的有益效果是：本发明的具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌可实现高效降解BTEX混合物。

本发明的具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌于2008年10月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NO：M 208181。

附图说明

图1为Bacillus amyloliquefaciens byf-5显微镜和扫描、透射电镜照片，其中，a为革兰氏染色显微镜图片，b为芽孢染色显微镜图片，c为扫描电镜图片，d为透射电镜图片；

图2为Bacillus amyloliquefaciens byf-5的系统发育树图；

图3为不同温度下菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对BTEX的降解曲线图；

图4为不同pH下菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对BTEX的降解曲线图；

图5为菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对不同初始浓度的苯的降解曲线图；

图6为菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对不同初始浓度的甲苯的降解曲线图；

图7为菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对不同初始浓度的乙苯的降解曲线图；

图8为菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对不同初始浓度的邻二甲苯的降解曲线图；

图9为菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对混合底物的降解曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，申请人将其编号为byf-5。

所述Bacillus amyloliquefaciens byf-5来源于中国石化浙江镇海炼化污水处理厂曝气池中的活性污泥中，经驯化、分离、纯化获得。

该菌株在固体培养基中呈淡桔红色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，直径为1-2mm；菌体的形态为稍粗杆菌，长度在10μm左右；形成芽孢，芽孢为椭圆形；好氧，革兰氏染色阳性，接触氧化酶阴性，能以BTEX混合物或其中的单一物质为唯一碳源，其生理生化特征如表1所示。Bacillus amyloliquefaciens byf-5的16S rDNA具有SEQ ID No.1的序列。

表1.Bacillus amyloliquefaciens byf-5的生理生化特征

其中，“+”表示能利用或反应阳性；“-”表示不能利用或反应阴性

所述Bacillus amyloliquefaciens byf-5的16S rDNA的Genebank的登录号为FJ169474，已于2008年10月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学内)，保藏编号为CCTCCNO：M 208181。

本发明的Bacillus amyloliquefaciens byf-5可用于污水体系中苯系化合物的高效降解，具体方法为将Bacillus amyloliquefaciens byf-5CCTCC M 208181悬浮于含有苯系化合物的污水中，在15-35℃，pH 5-9的条件下培养。

本发明的Bacillus amyloliquefaciens byf-5在污水中的最佳培养温度为30℃，最佳pH为8。

下面根据实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1.Bacillus amyloquefaciens byf-5的分离、纯化及其鉴定

1.Bacillus amyloquefaciens byf-5的分离及纯化

Bacillus amyloquefaciens byf-5是从浙江镇海炼化污水处理厂曝气池的活性污泥中取样，经驯化、分离及纯化得到的革兰氏阳性菌。具体步骤如下：

(1)污泥定向驯化

取浙江镇海炼化污水处理厂曝气池的活性污泥。活性污泥进行苯系化合物(BTEX)定向驯化，每5天为一驯化周期，驯化3个月，直至活性污泥对苯系化合物实现稳定高效降解。

(2)菌株的筛选与纯化

利用苯系物降解菌筛选培养基对活性污泥进行菌株筛选。苯系物降解菌筛选培养基成分：KH₂PO₄，0.5g；K₂HPO₄，0.5g；NaCL，0.01g；NH₄CL，1g；MgCl₂·6H₂O，0.2g；CaCL₂，0.02g；MnSO₄，0.339mg；ZnSO₄，0.428mg；钼酸铵，0.347mg；琼脂，15g；蒸馏水，1000ml；pH 7.2-7.4。苯系物另外分别添加：苯，200mg/l；甲苯，200mg/l；乙苯，200mg/l；邻二甲苯：200mg/l。

按照菌株分离纯化的常规方法，在恒温培养箱28℃培养2-3天，挑取平板上长出的单菌落，得到多株纯菌落。

将筛选到的多株苯系物降解菌在含有苯系化合物为唯一碳源的无机盐培养基中考察菌株对苯系化合物的去除效果，通过同空白实验的对照，结果得到了高效降解苯系化合物的菌株byf-5。所用的培养基成分为：苯0.1g/L，甲苯0.1g/L，乙苯0.1g/L，邻二甲苯0.1g/L，NH₄Cl 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O 0.08g/L，K₂HPO₄0.25g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，pH 7.2-7.4。

2.Bacillus  amyloquefaciens byf-5的16S rDNA鉴定

通过16S rRNA序列分析和Biolog微生物鉴定系统鉴定，确定byf-5菌为Bacillus amyloquefaciens。具体步骤如下：

采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取Bacillus amyloquefaciens byf-5的DNA，4℃保存。然后作为PCR反应的模板，设计引物，扩增Bacillus amyloquefaciens byf-5的全序列DNA，上下游引物序列分别如下：

BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′

BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3′

PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序(上海英骏)，测序得到SEQ ID No.1的序列。

将byf-5的16S rDNA序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号FJ169474，同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Bacillus属，然后通过系统发育树的建立，byf-5可能为Bacillus amyloquefaciens，图2为该菌的系统发育树图。为了进一步确定鉴定结果，通过各项生理生化实验以及Biolog微生物鉴定系统的分析，最终确定byf-5为Bacillus amyloquefaciens。

实施例2.Bacillus amyloquefaciens byf-5对BTEX生物降解性能检测

1.不同温度下菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对BTEX的生物降解特性

在不同温度下实施Bacillus amyloliquefaciens byf-5对BTEX的降解实验，发现其在25-30℃具有较高的降解苯系化合物的能力，从实际应用角度看，30℃为最为适宜的温度，此时去除率最高，具体实施步骤如下：

在含有苯系化合物为唯一碳源的无机培养基中，苯系物的终浓度为苯50mg/L、甲苯50mg/L、乙苯50mg/L、邻二甲苯50mg/L，加入新鲜培养的h1-4的菌悬液，OD₆₀₀为0.2，接种量为1ml/50ml，分取50ml培养基分装至5个250ml的盐水瓶中，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的摇床中160rpm培养；另外准备5个同样的未接菌的培养基分别置于对应的温度同时培养，作为空白对照。培养48h后，取样气相检测苯系化合物的浓度，同时测定菌株的菌密度(OD₆₀₀)，绘制苯系物去除率曲线图。

结果如图3所示，结果表明在温度为15℃时，菌株对苯系化合物的去除率最低。随着温度的逐渐提高，菌株对苯系化合物的去除率也随之提高；在温度为25～30℃时，菌株的生长和对苯系物的去除率都达到了较高的值；温度30℃时达到了最大值，48h对苯系物的去除率分别为苯，97.5％；甲苯，93.2％；乙苯，76.7％；邻二甲苯，67.5％。随着温度的进一步提高，菌株的生长和降解能力开始下降。

2.不同pH下菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对BTEX的降解特性

在不同pH下实施Bacillus amyloliquefaciens byf-5对BTEX的降解实验，结果表明其最佳的生长降解pH值为8，具体实施方案如下：

在5个250ml的盐水瓶中加入50ml等量的无机盐培养基，苯系化合物作为唯一碳源，最终浓度同上，分别调节pH至5、6、7、8、9；同时准备5瓶相同的培养基作为空白对照。均接种1ml新鲜培养的byf-5菌悬液，OD₆₀₀为0.2，在30℃，160rpm下培养。分别在0h，48h取样，检测培养基中的苯系化合物浓度变化和菌株的菌密度(OD₆₀₀)，绘制苯系物去除率曲线图。

结果如图4所示，在pH为5、9时，byf-5对苯系物去除效率较差。在pH为5的培养液中，溶液较澄清，表明菌株生长不好。在pH为5～9的条件下，细菌都能以苯系化合物为唯一碳源生长，只是生长和降解速率有所不同，在pH为8时，菌株byf-5的生长和降解速率最快，对苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯48h的去除率分别为99.5％、97％、70.1％、67.5％。

3.菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对不同初始浓度的BTEX的降解情况

在不同苯系物初始浓度下，实施byf-5对苯、甲苯、乙苯和邻二甲苯四种苯系物的降解，结果发现byf-5对苯、甲苯、乙苯和邻二甲苯的耐受浓度为500mg/l、300mg/l、125mg/l、200mg/l。具体实施方案如下：

在250ml的盐水瓶中加入50ml的无机盐培养基，苯系化合物作为唯一碳源。苯的最终浓度为25、50、150、300、500mg/l；甲苯的终浓度为25、50、150、200、300mg/l；乙苯的总浓度为25、50、75、100、125mg/l；邻二甲苯的终浓度为25、50、100、150、200mg/l。分别接种等量1ml OD₆₀₀为0.2的菌悬液，30℃，160rpm培养，间隔一段时间取样，绘制byf-5对苯系物的降解曲线图。

从图5-图8可以看出在苯浓度低于500mg/l时，byf-5可快速地降解苯，细菌生长良好，而高于500mg/l时，菌株受到强烈抑制；由于受甲苯在水中的溶解度限制，甲苯的最高浓度只做到300mg/l，当甲苯浓度在300mg/l以内时，byf-5都可快速地降解甲苯，细菌生长良好；byf-5对乙苯、邻二甲苯的降解速度要慢于苯和甲苯，当乙苯、邻二甲苯浓度分别大于125mg/l、150mg/l时，byf-5的生长降解受到抑制，不能高效降解。

4.菌Bacillus amyloliquefaciens byf-5对混合底物的降解情况

在以苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯四种苯系物为混合底物，实施菌Bacillusamyloliquefaciens byf-5对BTEX的降解特性，结果表明其对三种物质的降解难易程度为邻二甲苯＞乙苯＞甲苯＞苯。具体实施方案如下：

在250ml的盐水瓶中加入50ml的无机盐培养基，苯系化合物作为唯一碳源，总浓度分别都为50mg/L。接种1ml OD₆₀₀为0.2的菌悬液，30℃，160rpm培养。每隔一段时间取样，检测培养基中的苯系化合物浓度和菌密度(OD₆₀₀)，直到降解完全。绘制苯系物的降解曲线和菌株生长图。

结果如图9所示，在降解初期，菌株对苯系物的降解有15-20h左右的延滞期，同时菌株生长缓慢；在20h后，菌株开始适应该环境，进入对数生长期，苯系物被快速降解，从图中可以看出，byf-5对苯和甲苯的去除速率要明显快于乙苯和邻二甲苯，苯略快于甲苯；在45h时，苯被降解完全，甲苯、乙苯、邻二甲苯先后在52h、60h、65h被降解完。菌株的菌密度在45～50h达到最大值，50h后菌株进入衰退期。

具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌的16s rRNA基因序列SEQ IDNo.1表

SEQUENCE LISTING

<110>浙江工业大学

<120>具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌及其应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1464

<212>DNA

<213>Bacillus amyloliquefaciens

<400>1

cctaatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac     60

gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc    120

taataccgga tgcttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca    180

cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac    240

gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact    300

cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc    360

cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc    420

gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc    480

agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct    540

cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg    600

aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc    660

gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga    720

ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga    780

tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact    840

ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa    900

gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc     960

ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg    1020

ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga    1080

tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga    1140

aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa    1200

tgggcagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca    1260

gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc    1320

agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag    1380

tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc tttttggagc cagccgccga aggtgggaca    1440

gatgattggg gtgaagtcga acaa                                           1464

Claims (4)

1、一种具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，它的16SrDNA具有SEQ ID No.1的序列。保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208181。

2、权利要求1所述具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢杆菌在降解BTEX混合物中的应用。

3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体方法为将解淀粉芽孢杆菌悬浮于含有BTEX的污水中，在15-35℃，pH5-9的条件下培养。

4、根据权利要求2所述的应用，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌在污水中的最佳培养温度为30℃，最佳pH为8。

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