CN104371948A - 微杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开一种微杆菌菌株(Microbacterium sp.)、其生物学纯培养物，以及其在降解苯酚中的应用。所述微杆菌菌株为SY-PD-42，保藏编号为CCTCC NO：M2014101。本发明的微杆菌菌株可以高效降解废水中的酚类物质，并且能够耐受苯酚浓度高达2500mg/L的含酚溶液。

Description

微杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种微杆菌菌株，其生物学纯培养物，以及其在降解苯酚中的应用。 

背景技术

苯酚是一种常见的水溶性有机污染物，广泛存在于石油、化工、煤气、焦化、钢铁及酚类生产厂排放的废水中。含酚废水来源广、数量多、危害大，排放进水水体中，会对水体造成严重污染，是我国水污染控制中列为重点解决的有毒有害废水之一。 

目前国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、生物法等。其中生物法是利用微生物代谢活动，去除废水中的有毒物，具有无二次污染，经济，安全等优点。 

目前已报道多种苯酚降解菌，包括：假单胞菌(Pseudonomonas sp.)、根瘤菌(Rhizobia)、热带假丝酵母(Yeasttrichosporon)、醋酸钙不动杆菌(Acinctobacter calcoaceticus)、真养产碱菌(Alcaligeneseutrophus)、热葡糖苷酶芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、藻类(Ochromonas danica)、芽孢杆菌(Bacillus)、产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、红球菌(Rhodococcus)、贪噬菌属(Variovorax)和罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)等。 

然而，现有通过筛选获得的降解苯酚菌株，普遍存在对高浓度含酚废水耐受力较低的问题。一般地，苯酚降解菌株对酚的耐受浓度低于2000mg/L，在高浓度酚存在的情况下，苯酚降解率通常低于90％；在对含酚废水的生物处理过程中，若想实现高降解率的处理效果，则需要较长的周期，在处理实际废水时经济性低。 

因此，获得具有高苯酚耐受力的降解菌，对于处理实际含酚废水具有重要意义。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种具有高苯酚耐受力的降解菌。 

本发明一方面提供一种微杆菌属(Microbacterium sp.)，其分类命名为SY-PD42，2014年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCC NO：M 2014101。 

一些实施例中，所述微杆菌菌株的16S rRNA基因序列为SEQ ID NO:1。 

本发明另一方面提供该微杆菌菌株的生物学纯培养物。 

一些实施例中，本发明的生物学纯培养物为所述微杆菌菌株在以苯酚为碳源、(NH₄)₂SO₄为氮源的培养基中的生物学纯培养物。 

本发明再一方面提供一种降解含酚溶液中的苯酚的方法，使用本发明的所述微杆菌菌株，或生物学纯培养物，进行所述降解。 

一些实施例中，在所述含酚溶液中，苯酚的浓度可以在2500mg/L以下。一些实施例中，苯酚的浓度可以在2000mg/L以下。 

一些实施例中，可以在25至35℃的温度进行所述降解。 

一些实施例中，可以在6.5至9.5的pH进行所述降解。 

本发明通过筛选获得一种微杆菌菌株，其能够高效降解含酚溶液中的苯酚，可耐受高达2500mg/L的苯酚浓度，尤其适用于含高酚废水的生物处理。 

附图说明

图1不同苯酚浓度条件下微杆菌SY-PD-42对苯酚的降解率及菌株浓度。 

图2微杆菌SY-PD-42在苯酚浓度2000mg/L条件下对苯酚的降解曲线。 

保藏信息：微杆菌属(Microbacterium sp.)SY-PD42，2014年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO：M 2014101。 

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应理解，本发明并不限于这些具体实施例。 

实施例1：

微杆菌SY-PD-42菌株的分离和鉴定

(一)采用富集培养法从辽宁某石化厂生化好氧池活性污泥中分离得到，具体步骤如下。 

(1)配制培养基：在250mL三角瓶中装入100mL苯酚无机盐培养基混合体系，其中包括培养基溶液、无机盐微量元素溶液和苯酚。每1L培养基加入1mL微量元素溶液；苯酚先于45℃水浴中溶解，待无机盐培养基高压灭菌后加入体系。 

培养基溶液为(g/L)：0.9KH₂PO₄、6.5Na₂HPO₄·12H₂O、0.4(NH₄)₂SO₄、0.2MgSO₄·7H₂O；微量元素溶液为(g/L)：1g FeSO₄·7H₂O、1g MnSO₄·H₂O、0.25g Na₂MoO₄·2H₂O、0.1g H₃BO₄、0.25g CuCl₂·2H₂O、0.25g ZnCl₂、0.1gNH₄·VO₃、0.25g Co(NO₃)₂·6H₂O、0.1g NiSO₄·6H₂O，溶于900mL蒸馏水，加入5mL浓H₂SO₄，补蒸馏水至1000mL。 

(2)驯化培养：向培养基中接入5mL从辽宁省某石化厂采集的生化好氧池活性污泥，于30℃在转速150r/min的摇床中振荡培养2天，取5mL菌液接种到100mL新培养基中，重复转接7次。新培养基中苯酚的浓度依次递增。起始浓度为500mg/L，以后每次转接苯酚浓度增加500mg/L，直到第7次转接的4000mg/L。 

(3)分离纯化：驯化培养好的菌液按10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7稀释，取0.1mL10^-5稀释液涂在含有2000mg/L苯酚的无机盐培养基平板上，30℃倒置培养2至3天，挑取单菌落，进行3次划线分离纯化，得到纯化的菌株SY-PD-42。 

(二)采用16S rRNA基因测序法对微杆菌SY-PD-42菌株进行分类鉴定，具体步骤如下。 

(1)细菌总DNA的制备：用天根公司基因组提取试剂盒提取SY-PD-42菌株的基因组DNA，作为PCR反应的模板。 

(2)16S rRNA基因的PCR扩增： 

使用如下扩增引物 

27F：5’-AgAgTTTgATCMTggCTCAg-3’[M＝C,A] 

1492R：5’-CggYTACCTTgTTACgACTT-3’[Y＝T,C] 

中间引物：533F：5’-gTgCCAgCMgCCgCggTAA-3’ 

PCR反应体系如下表所示： 

PCR反应条件为：(94℃3分钟)-(94℃1分钟-55℃30秒-72℃1分钟)×30个循环-(72℃1分钟)。 

(3)PCR产物的纯化、克隆、测序和分析： 

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α，然后提取重组质粒，测定16S rRNA基因序列。将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行核苷酸序列Blast比对，得到与相关菌株的16S rRNA基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明SY-PD-42菌株与微杆菌属(Microbacterium)的16SrRNA基因序列的同源性在99％以上，因此将分离菌株鉴定为微杆菌(Microbacterium sp.)。 

(三)微杆菌SY-PD-42菌株的形态鉴定特征如下： 

菌体细胞呈杆状，属于革兰氏阴性菌类，菌落乳白色、隆起、边缘光滑齐整，菌株在生长过程中能耐受2500mg/L的苯酚，最适生长条件为：pH7.0，温度30℃。 

实施例2：

微杆菌SY-PD-42对不同浓度的苯酚降解率及菌体浓度(OD600值)

在pH7.0，温度30℃，苯酚初始浓度分别为500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L、3000mg/L、3500mg/L、4000mg/L，将SY-PD-42菌株的培养物接种于100mL上述以苯酚为唯一碳源的无机盐培养 基中，150r/min振荡培养48h后取样。 

用4-氨基安替比林萃取光度法，测定样品中残留苯酚含量，计算降解率。以苯酚初始浓度为横坐标，以苯酚降解率及OD600值(菌体浓度)为纵坐标，绘制降解及菌体浓度曲线，结果示于图1。 

从图1可见，微杆菌SY-PD-42菌株在苯酚浓度低于2000mg/L时，对苯酚有很好的降解效果，降解率可达到99％以上；在苯酚浓度为2000mg/L时，菌体生长最好，即菌体浓度达到最高值；即使在苯酚浓度高达2500mg/L时，降解率仍可以达到95％以上；而当苯酚初始浓度高于3000mg/L时，微杆菌SY-PD-42对苯酚的降解率逐渐降低，但仍有一定的降解能力。 

现有技术已知的苯酚降解菌株对酚的耐受浓度通常低于2000mg/L，并且在高浓度酚存在的情况下，苯酚降解率通常低于90％。因此本发明的微杆菌SY-PD-42菌株具有很好的苯酚降解能力及苯酚耐受力。 

实施例3：

微杆菌SY-PD-42菌株对苯酚的降解曲线

将微杆菌SY-PD-42菌株的培养物接种于100mL的上述以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中，培养基pH为7.0，苯酚初始浓度为2000mg/L，于30℃、150r/min振荡培养，每隔6h取样。 

用4-氨基安替比林萃取光度法，测定样品中残留苯酚含量，以时间为横坐标，苯酚残留浓度为纵坐标，绘制降解曲线，结果示于图2。从图2可见，培养基初始苯酚浓度为2000mg/L时，本发明的微杆菌SY-PD-42菌株可在48h内，将培养基中苯酚降解99％以上，最终培养液中苯酚浓度低于1mg/L。 

本发明的微杆菌菌株SY-PD-42可以被用于处理含酚溶液，以降解其中的苯酚，例如可以用于生物处理含酚工业废水。该微杆菌SY-PD-42可以高效降解苯酚，在以苯酚为碳源(例如，其浓度可以为2000mg/L)、(NH₄)₂SO₄为氮源(例如，其浓度可以为400mg/L)的无机盐培养液体培养基中接种该微杆菌SY-PD-42菌株后，30℃，pH为6.5-9.5范围内可高效降解苯酚，48h内苯酚降解率达到99％以上。 

具体的应用方法为：在以苯酚为碳源、(NH₄)₂SO₄为氮源的无机盐培养液体培养基中，将微杆菌SY-PD-42于25-35℃振荡培养36-60h，然后将菌 液接种到含酚量低于2500mg/L的工业废水(例如，可以按5％的接种量接种)，于25-35℃震荡培养48h以后，可以去除90％以上的酚。 

下面通过三个应用实施例(实施例4至6)进一步详细阐述本发明的微杆菌SY-PD-42在处理含酚溶液(在这些实施例中为含酚工业废水)中的应用。 

实施例4：

微杆菌SY-PD-42菌株在含酚工业废水处理中的应用1

将微杆菌SY-PD-42在以苯酚为碳源(2000mg/L)、(NH₄)₂SO₄为氮源(400mg/L)的无机盐培养液体培养基中30℃振荡培养48h，然后按5％的接种量将菌液接种到挥发酚含量为1300mg/L的辽宁某石化厂废水中，30℃振荡培养48h后，挥发酚残留量为4.2mg/L，挥发酚去除率达到99％。出水达到我国污水综合排放标准(GB8978-1996)规定的挥发酚三级标准(5.0mg/L)。 

而不添加微杆菌SY-PD-42的对照组挥发酚残留量为1114mg/L，挥发酚去除率仅为14％。 

实施例5：

微杆菌SY-PD-42菌株在含酚工业废水处理中的应用2

将微杆菌SY-PD-42在以苯酚为碳源(2000mg/L)、(NH₄)₂SO₄为氮源(400mg/L)的无机盐培养液体培养基中30℃振荡培养48h，然后按5％的接种量将菌液接种到挥发酚含量为2500mg/L的河北某焦化厂废水中，30℃振荡培养48h后，挥发酚残留量为157mg/L，挥发酚去除率达到93.7％。 

而不添加微杆菌SY-PD-42的对照组挥发酚残留量为2120mg/L，挥发酚去除率仅为18.4％。 

实施例6：

微杆菌SY-PD-42菌株在含酚工业废水处理中的应用3

将微杆菌SY-PD-42在以苯酚为碳源(2000mg/L)、(NH₄)₂SO₄为氮源(400mg/L)的无机盐培养液体培养基中30℃振荡培养48h，然后按5％的接种量将菌液接种到挥发酚含量为740mg/L的黑龙江某焦化厂废水中，30℃振荡培养48h后，挥发酚残留量为0.4mg/L，挥发酚去除率达到99.9％。出水达到我国污水综合排放标准(GB8978-1996)规定的挥发酚一级标准 (0.5mg/L)。 

而不添加微杆菌SY-PD-42的对照组挥发酚残留量为672mg/L，挥发酚去除率仅为10％。 

综上，本发明获得一种可高效降解苯酚的菌株，以及其生物学纯培养物，将它们应用于处理含高酚的工业废水，可以解决现有技术中，在生物处理含高酚实际废水时酚降解率低的问题。本发明的微杆菌菌株SY-PD-42能耐受高达2500mg/L苯酚，并且在2000mg/L苯酚的含酚溶液中能够高效降解苯酚，这对于生物处理含酚废水具有重要的实际意义。 

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。 

Claims (9)

1.一种微杆菌菌株(Microbacterium sp.)，其特征在于，所述微杆菌菌株为SY-PD-42，保藏号为CCTCC NO：M2014101。 

2.如权利要求1所述的微杆菌菌株，其特征在于，所述微杆菌菌株的16S rRNA基因序列为SEQ ID NO:1。 

3.权利要求1或2所述的微杆菌菌株的生物学纯培养物。 

4.权利要求3所述的生物学纯培养物，其特征在于，为微杆菌菌株在以苯酚为碳源、(NH₄)₂SO₄为氮源的培养基中的生物学纯培养物。 

5.一种降解含酚溶液中的苯酚的方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述的微杆菌菌株，或权利要求3或4所述的生物学纯培养物进行所述降解。 

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述含酚溶液中，苯酚的浓度在2500mg/L以下。 

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述含酚溶液中，苯酚的浓度在2000mg/L以下。 

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在25至35℃的温度进行所述降解。 

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在6.5至9.5的pH进行所述降解。