CN103756947B - 一种不动杆菌及其菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不动杆菌及其菌剂的制备方法。其技术方案是：所提供的不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3于2013年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013445。本发明提供的不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3为异养硝化菌，是将不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3接种到硝化培养基中发酵，通过发酵扩大培养得到，菌剂制备方法简单，易于规模化生产。该菌能在较高浓度含酚工业废水环境中顺利进行硝化反应，并以苯酚为碳源进行同时硝化和反硝化，将氨氮和有机氮转化为氮气，无亚硝酸盐氮积累，实现废水中的氨氮和苯酚的同时高效降解，在含酚工业废水的生物脱氮处理中展现出良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于环境污染物生物脱氮技术领域。具体涉及一种不动杆菌及其菌剂的制备方法。
背景技术
近年来，为了提高废水生物系统的处理能力，通过向系统中投加高效优势菌种或通过基因工程产生的工程菌，即所谓的高效菌技术（生物强化技术）得到了迅速的发展，成为该领域的研究热点。
在国外特别是发达国家，环境微生物菌剂更是受到人们的普遍关注和重视，已成为一种新的发展趋势。丹麦的诺维信、美国Bioform公司所售的硝化菌均为复合菌剂，菌剂中含有大量的自养硝化菌，同时还含有一定数量的异养硝化好氧反硝化菌。硝化菌剂目前已经形成一定规模的产业，并已在发展中国家得到应用。与自养硝化菌相比，异养硝化细菌对培养条件的要求比较宽松，许多异养硝化细菌在低温以及高C/N条件下仍能够较好地进行硝化作用，适用的溶解氧和pH值范围也更为宽泛。异养硝化好氧反硝化菌可以在同一反应器中，同时进行硝化和反硝化，有效降低废水的总氮。含有异养硝化好氧反硝化菌的硝化菌剂，不仅可以提高富含有机成分废水的硝化能力，同时还有较好的总氮脱除能力，从而为满足更高环保要求的废水排放标准提供菌剂保证。
目前文献已报道了粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、泛养硫球菌(Thiosphaera pantotropha)具有较好的好氧反硝化能力，但对含酚废水中氨氮的降解效率较低，致使难以在焦化、焦油加工等实际废水处理中得到应用。
发明内容
本发明旨在解决普通异养硝化菌对含酚工业废水中氨氮降解效率低的问题，目的是提供一种不动杆菌及其菌剂的制备方法，为焦化和焦油加工等实际废水生物脱氮处理提供菌剂。
本发明所提供的不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3源于武钢焦化公司废水生物处理系统的活性污泥。该菌是以氨氮为氮源，以苯酚和丁二酸钠为碳源和能源进行生长繁殖，利用硝化培养基进行驯化培养，并通过平板划线分离纯化得到。
其中，硝化培养基的成分是：丁二酸钠为9.8g/L，磷酸氢二钠为7.85g/L，磷酸二氢钾为1.45g/L，硫酸镁为0.2g/L，硫酸铵为1.0g/L，硫酸亚铁为0.01g/L；硝化培养基的pH值用1mol/L的氢氧化钠调至9.0。培养基灭菌条件是：温度为121~126℃，时间为25min。
该菌为革兰氏阴性，经16S rDNA鉴定为不动杆菌（Acinetobacter sp.），编号为Y3。该菌于2013年9月25日保藏于中国典型微生物保藏中心（武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:M2013445。该菌菌落呈乳白色，圆形，中间凸起，表面光滑湿润，边缘整齐。具有同时硝化和反硝化能力，能以苯酚作为碳源和能源进行生长繁殖。
该菌较优的培养条件是：温度为30℃，初始pH值为9.0，接种量为3 vol%，摇床转速为150r/min，碳氮质量比（C︰N）为12︰1。
本发明还涉及所述不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3菌剂的制备方法：先向发酵罐装入3/4体积的硝化培养基，用蒸汽在线灭菌；再将不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3接种到硝化培养基中发酵，发酵条件为：温度为30℃，pH值为9.0，接种量为3vol%，转速为150r/min，通气量为0.5（V/V·min），发酵时间为24h，发酵过程中加入0.05 vol%的陶氏消泡剂。
由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下积极效果：
本发明提供的不动杆菌菌剂不但制备方法简单，易于规模化生产，而且降解效率高，环境适应能力强。所提供的不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3为异养硝化菌，能在大量有机物存在的条件下顺利进行硝化反应，并能将硝化的产物同时进行反硝化，将氨氮和有机氮转化为氮气，无亚硝酸盐氮积累。特别突出的优势是，该菌能耐受酚浓度高达1000mg/L的工业废水环境，并以苯酚作为碳源进行同时硝化和反硝化，实现废水中的氨氮和苯酚的同时高效降解，在含酚工业废水的生物脱氮处理中展现出良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3的菌落图；
图2为本发明的不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3的革兰氏染色效果图；
图3为本发明的不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3的生长特性曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步描述，并非对其保护范围的限制。
实施例1、菌株的分离纯化
（1）菌株来源
菌源采自武钢焦化公司废水生物处理系统的活性污泥。
（2）菌株的分离纯化
将采集到的活性污泥混匀，取2mL接种于100mL已灭菌的LB培养基中，所述LB培养基的成分是：蛋白胨为1wt%，氯化钠为1 wt%，酵母提取物为0.5 wt%；再置于温度为30℃和150r/min的恒温摇床培养15h；然后取5mL培养液转接至已灭菌的硝化培养基中，转接4次，转接过程中逐渐增大硫酸铵的浓度，浓度依次为：300mg/L，600mg/L，900mg/L，1200mg/L。驯化期间，同时向硝化培养基中加入苯酚使得其最终浓度为500mg/L。驯化结束后，将菌液做梯度稀释（10-1~10-8），涂布于固体的硝化培养基上，置于30℃恒温培养箱培养2天，然后挑取单菌落，平板划线（重复2~3次），得到纯化后的菌株，将每株菌试管斜面保存。最后进行硝化性能、反硝化性能及苯酚降解性能的测定，挑选综合性能最优的菌株Y3斜面保种，并保藏于中国典型微生物保藏中心（武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：M2013445。
实施例2、菌株的鉴定
（1）菌株的形态学观察
将菌株Y3培养液梯度稀释后，均匀涂布于固体硝化培养基上面，置于30℃恒温箱培养22h，进行形态学观察，结果如图1所示。由图1可以看出，该菌菌落呈乳白色，圆形，中间凸起，表面光滑湿润，边缘整齐。挑取菌落少许，经革兰氏染色之后，在光学显微镜的油镜下观察，结果如图2所示，能够清楚看到保藏编号为CCTCC NO：M2013445的菌株单个菌为短杆状，呈红色，为革兰氏阴性菌。
（2）菌株的16S rDNA鉴定
用DNA 提取试剂盒提取菌株Y3的基因组DNA，然后进行16S rDNA基因克隆、测序，其16SrDNA序列见序列表。之后在GenBank中进行Blast比对，结果显示，与其序列相似度达到99%的均为Acinetobacter sp。结合菌株Y3的特性，将其归属为不动杆菌（Acinetobacter sp）。
实施例3、不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3菌剂的制备
配制3L的硝化培养基，加入到5L的发酵罐中，并加入1.5mL的陶氏消泡剂，然后置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃下湿热灭菌25min，待灭菌的培养基冷却后，将不动杆菌
（Acinetobacter sp.）Y3以3vol%的量接种到硝化培养基，在30℃、150r/min和0.5（V/V·min）通气量的条件下发酵培养，24h后停止发酵，并加入25vol%的甘油作为保护剂后，进行低温保藏。
实施例4、不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3的生长及其对氨氮和苯酚的降解
将不动杆菌（Acinetobacter sp.）Y3菌株接种于无菌、含氨氮为212mg/L和苯酚为200mg/L的异养硝化培养基中，在30℃和150r/min的条件下培养，测定菌体的菌密度（OD600）、氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和苯酚的浓度，结果如图3所示。结果表明：初始浓度为212mg/L的氨氮经过24h被完全降解，期间并未检测到亚硝酸盐氮和硝酸盐氮，菌体的生长与氨氮的降解趋势基本同步，苯酚经过20h被完全降解，该菌株对氨氮和苯酚具有很好的降解效果，并展现出良好的同时硝化和反硝化能力。
上述具体实施方式为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的。
Claims (2)
1.一种不动杆菌菌剂的制备方法，其特征在于将所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)Y3接种到硝化培养基中发酵，发酵条件是：温度为30℃，pH值为9.0，接种量为3vol％，转速为150r/min，通气量为0.5(V/V·min)，发酵时间为24h，发酵过程中加入0.05vol％的陶氏消泡剂；所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)Y3的保藏编号为CCTCC NO:M2013445。
2.如权利要求1所述不动杆菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的硝化培养基的成分是：丁二酸钠为9.8g/L，磷酸氢二钠为7.85g/L，磷酸二氢钾为1.45g/L，硫酸镁为0.2g/L，硫酸铵为1.0g/L，硫酸亚铁为0.01g/L；硝化培养基的pH值用1mol/L的氢氧化钠调至9.0。
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