CN110257288B - 一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用 - Google Patents

一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用，复合菌培养基的成分为可溶性淀粉、玉米淀粉、硫酸铵、尿素、氯化钠、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等，使用本发明所述的复合菌的培养基培养获得的菌体数量是使用常规LB培养基的2‑3倍，培养出的混合菌性能稳定，生物活性高，对氨氮、硝态氮、亚硝态氮和COD均具有较好的降解能力，且成本为常规LB培养基的50%‑70%。

Description

一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养 基及其应用
技术领域
本发明涉及一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用，属于涉及微生物培养基技术领域。
背景技术
羟乙基纤维素生产过程排放废水具有污染物成分复杂，废水浓度高，存在生物难降解物质等特点。废水中含有大量毒性含氮物质，尤其含有大量的硝态氮。目前羟乙基纤维素化工废水的方法主要有：厌氧+缺氧+好氧、SBR工艺等。羟乙基纤维素生产废水中含有的生物毒性物质对生化系统中的微生物的生命活动具有强烈的抑制作用，废水中含有的大量硝态氮，需要延长生化系统处理时间，因而降低了生化系统处理效率。与物理、化学法相比，生物处理技术具有成本低、无二次污染的优点，因此，如何在现有生化处理工艺的基础上，高效去除含氮污染物，是羟乙基纤维素生产废水处理必须要解决的问题。将筛选获得的高活性菌种，以科学的配比复配成针对性强的微生物脱氮菌剂，将此菌剂投入生化处理系统，提升生化体统的处理效率，开发具有高生物活性特定培养基是保证该高效菌剂能够实现产业化应用的关键。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用，以解决现有技术中存在的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基，所述复合菌培养基的成分为：可溶性淀粉5-15g/L、玉米淀粉5-15g/L、葡萄糖3-10g/L、甘油1-5g/L、尿素2-6g/L、(NH4)2SO41-3g/L、NaCl 1-5g/L、K2HPO40.5-2g/L以及KH2PO42-4g/L。
作为本发明的一种改进，所述复合菌培养基的pH 6.0-7.2。
作为本发明的一种改进，所述的培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基在制备复合菌剂中的应用。
作为本发明的一种改进，所述的复合菌剂的制备方法，步骤如下：
（1）各菌株的培养：将气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5五种菌种分别接种于LB培养基进行培养，将培养后的各菌株按比例混合；
（2）菌剂放大培养：将上述混合菌液接种于LB培养基中进行培养后，再将混合菌种液接种于复合菌培养基中，并放置于发酵罐中进行培养，加入消泡剂进行发酵，发酵完毕后出罐；
（3）复合菌剂制备方法：将发酵获得的菌液在5000r/min离心机离心15min后，去除上清液，加入9g/L的生理盐水在5000r/min离心机离心15min，去除上清液，获得的菌泥，加入9g/L的生理盐水配制成菌液悬浊液，加入营养剂、保藏助剂、载体等常规添加剂，制备成生物脱氮菌剂。
作为本发明的一种改进，所述步骤（2）中混合菌液的体积为LB培养基体积的1-5%；所述混合菌种液的体积为复合菌培养基的2-10%。
作为本发明的一种改进，所述气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5，五种菌株分别于2019年4月15日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），PR-DN1的保藏编号为CCTCC NO:M2019255，PR-DN2的保藏编号为CCTCC NO:M2019372，PR-DN3的保藏编号为CCTCC NO:M2019373，PR-DN4的保藏编号为CCTCCNO:M2019374，PR-DN5的保藏编号为CCTCC NO:M2019413。
作为本发明的一种改进，所述步骤（1）中气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5五种菌种的活菌数比例为1-10：1-5：1-5：1-10：1-5。
作为本发明的一种改进，所述步骤（3）中复合菌剂的总活菌数为1×109cfu/g-4×109cfu/g；所述步骤（3）制成的复合菌剂中，五种菌体的体积之和占复合菌剂总体积的20%-50%，优选为20%-40%。
作为本发明的一种改进，所述步骤（3）中添加剂为营养剂、保藏助剂、载体的混合物。
作为本发明的一种改进， 所述步骤（1）中在LB培养基中进行培养的条件为：30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h；所述步骤（2）中在LB培养基中进行培养的条件为：30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h；所述步骤（2）中在复合菌培养基中进行培养的条件为：30℃、溶解氧40%-60%、pH为7.0条件下发酵罐培养36-60h。
作为本发明的一种改进，所述步骤（3）中添加剂为营养剂、保藏助剂、载体的混合物；所述步骤（2）中出罐时，发酵液中活菌数达到1×1010-2×1011cfu/mL；所述步骤（2）中加入的消泡剂体积为2/10000发酵液体积；所述步骤（2）中，复合菌培养基的体积为发酵罐体积的75%，发酵过程通入的气体为空气。
由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：
使用本发明所述的培养基培养获得的菌体数量是使用常规LB培养基的2-3倍，培养出的混合菌性能稳定，生物活性高，对氨氮、硝态氮、亚硝态氮和COD均具有较好的降解能力，且成本为常规LB培养基的50%-70%。
具体实施方式
下面仅用气单胞菌（Aeromonas sp.）、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）五种菌说明本发明的实施方案和效果，但本发明并不限于下述实施例。
实施例1：
培养基的配制
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，120℃灭菌20min。
复合菌培养基：溶性淀粉5g/L，玉米淀粉8g/L，葡萄糖5g/L，甘油2g/L，尿素3g/L，(NH4)2SO42g/L，NaCl 1g/L，K2HPO41g/L，KH2PO42g/L，pH 6.8。
将上述复合菌的培养基在制备复合菌剂中的应用，复合菌剂的制备方法，步骤如下：
（1）复合菌制备：将气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5分别接种于LB培养基中，在30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h，之后将培养后的气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5五种菌种按照活菌数比例为5：2：2：5：2的比例混合；
（2）复合菌剂放大培养：按上述混合菌液接种于LB培养基中（混合菌液的体积为LB培养基体积的3%），在30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h，之后再将混合菌种液接种于本发明的复合菌培养基中（混合菌种液的体积为复合菌培养基的6%），在30℃、溶解氧40%-60%、pH=7.0条件下发酵罐培养36h，发酵过程中约加入消泡剂（消泡剂体积为发酵液体积2/10000），下罐时，发酵液中活菌数达到1×1010-2×1011cfu/mL。
各菌株初始发酵活菌数在1×106-1×107cfu/mL,培养48h后活菌数对比见表1。
表1 各菌株在本发明培养基与常规LB培养基培养48h后活菌数对比
本发明培养基（cfu/mL） LB培养基（cfu/mL）
气单胞菌PR-DN1 5.1×1010 2.2×1010
产碱杆菌PR-DN2 3.7×1010 1.5×1010
不动杆菌PR-DN3 2.8×1010 1.3×1010
蜡样芽孢杆菌PR-DN4 2.7×1010 1.2×1010
微小杆菌PR-DN5 4.2×1010 1.4×1010
（3）复合菌剂制备方法：发酵获得的菌液在5000r/min离心机离心15min后，去除上清液，使用9g/L生理盐水在5000r/min离心机离心15min，去除上清液，获得的菌泥，采用9g/L生理盐水配制成菌液悬浊液，加入营养剂、保藏助剂、载体等常规添加剂，制备成复合菌剂，复合菌剂中上述五种菌体的体积之和占脱氮菌剂总体积的20%-50%，优选为20%-40%。
实施例2：
将上述经实施例1制备的复合菌剂，以1%投加量加入到某羟乙基纤维素生产外排废水中，废水中的NH3-N浓度为4mg/L，NO3 --N浓度为280mg/L，NO2 --N浓度为10mg/L，CODCr浓度为900 mg/L。系统内的温度为29℃，溶解氧为0.1-0.3mg/L，pH为7.2-7.6。未添加复合菌剂前，处理后废水中的NO3 --N浓度为50mg/L，不能达标排放。投加复合菌剂后，排放出水硝态氮浓度低于5mg/L，总氮浓度低于5mg/L，连续运行25天，出水硝态氮和总氮均低于5mg/L。CODCr浓度低于60mg/L。
实施例3：
将上述经实施例1制备的复合菌剂，以5%投加量加入到某羟乙基纤维素生产外排废水中，某羟乙基纤维素生产含氮废水中的NH3-N浓度为8mg/L，NO3 --N浓度为590mg/L，NO2 --N浓度为12mg/L，CODCr浓度为1450 mg/L。系统内的温度为33℃，溶解氧为0.1-0.3mg/L，pH为7.6-8.4。未添加复合菌剂前，处理后废水中的NO3 --N浓度为110mg/L，不能达标排放。处理后废水不能达标排放。投加复合菌剂后，排放出水硝态氮浓度低于5mg/L，总氮浓度低于5mg/L，连续运行25天，出水硝态氮和总氮均低于5mg/L。CODCr浓度低于60mg/L。
附：气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1菌株序列（SEQ ID NO.1）
ATCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAACATTCTGATTTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGCGCTTTTTGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCAGCCCTCTGTACGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCCTTGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGGACAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCTGATTCCCGAAGGCACTCCCGCATCTCTGCAGGATTCCAGACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGTCTCAAGGACACAGCCTCCAAATCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCTGGACAGTTTTAAATGCAATTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCTAACTTATCCAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCACAGTCAGCAGATATTAGCTACTGACCTTTCCTCCTCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCCACCTGGGCATATCCAATCGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAGCAGTCGTTTCCAACTGTTATCCCCCTCGACTGGGCAATTTCCCAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGCCGGCAAAAGTAGCAAGCTACTTTC
产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2菌株序列（SEQID NO.2）
ACGGCAGCACGAGAGAGCTTGCTCTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATATATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATTCTTCGGAACCTCTCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTATGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTTGGCAGAGAAGAAAAGGTATCTCCTAATACGAGATACTGCTGACGGTATCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGTGTAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTGCCGAGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCAGACACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCGTTAGGCCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCCGAAGAGATTTGGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCTCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGTCGCGGTGAAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACC
不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3菌株序列（SEQID NO.3）
AGCTCGCTACTGGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTAGTATTAATACTACTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCCATTTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGATGGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACTAGAAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAATCTAGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTACTTGCCAGCATTTCGGATGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCGC
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4菌株序列（SEQID NO.4）
CCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAA
微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5菌株序列（SEQID NO.5）
CCGGCTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGAACGGCTTTATGGGATTGGCTCCACCTCGCGGTCTCGCTGCCCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAACTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCATTGTCCCCGAAGGGAAAACTTGATCTCTCAAGCGGTCAATGGGATGTCAAGAGTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTTCAGCACTGAGGGGCGGAAACCCCCCCAACACTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTTCTCTTCTGTACTCAAGCCTTCCAGTTTCCAATGGCCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAGGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCGTAAGGTACCGTCAAGGTACGAGCATTCCCTCTCGTACGTGTTCTTCCCTTACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCACCGCAAGGCCATCTCAAGGTGACGCCGGAGCGCCTTTCATCAGCGGACCATGCGGTCCGATGAACTATCCGGTATTAGCTCCGATTTCTCGGAGTTATCCCAATCCTTGAGGCAGGTTCCTTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTCATTCCGCTGCCTTCCCTCCGAAGAGTTCCGTC
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
序列表
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<210> 1
<211> 1368
<212> DNA
<213> 气单胞菌 PR-DN1(Aeromonas sp.PR-DN1)
<400> 1
atctacttct ggtgcaaccc actcccatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga 60
acgtattcac cgcaacattc tgatttgcga ttactagcga ttccgacttc atggagtcga 120
gttgcagact ccaatccgga ctacgacgcg ctttttggga ttcgctcact atcgctagct 180
tgcagccctc tgtacgcgcc attgtagcac gtgtgtagcc ctggccgtaa gggccatgat 240
gacttgacgt catccccacc ttcctccggt ttatcaccgg cagtctccct tgagttccca 300
ccattacgtg ctggcaacaa aggacagggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat 360
ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtgt tctgattccc gaaggcactc 420
ccgcatctct gcaggattcc agacatgtca aggccaggta aggttcttcg cgttgcatcg 480
aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcatttg agttttaacc 540
ttgcggccgt actccccagg cggtcgattt aacgcgttag ctccggaagc cacgtctcaa 600
ggacacagcc tccaaatcga catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660
ttgctcccca cgctttcgca cctgagcgtc agtctttgtc cagggggccg ccttcgccac 720
cggtattcct ccagatctct acgcatttca ccgctacacc tggaattcta cccccctcta 780
caagactcta gctggacagt tttaaatgca attcccaggt tgagcccggg gctttcacat 840
ctaacttatc caaccgcctg cgtgcgcttt acgcccagta attccgatta acgcttgcac 900
cctccgtatt accgcggctg ctggcacgga gttagccggt gcttcttctg cgagtaacgt 960
cacagtcagc agatattagc tactgacctt tcctcctcgc tgaaagtgct ttacaacccg 1020
aaggccttct tcacacacgc ggcatggctg catcagggtt tcccccattg tgcaatattc 1080
cccactgctg cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag ttccagtgtg gctgatcatc 1140
ctctcagacc agctagggat cgtcgccttg gtgagccatt acctcaccaa ctagctaatc 1200
ccacctgggc atatccaatc gcgcaaggcc cgaaggtccc ctgctttccc ccgtagggcg 1260
tatgcggtat tagcagtcgt ttccaactgt tatccccctc gactgggcaa tttcccaggc 1320
attactcacc cgtccgccgc tcgccggcaa aagtagcaag ctactttc 1368
<210> 2
<211> 1382
<212> DNA
<213> 产碱杆菌 PR-DN2(Alcaligenes sp.PR-DN2)
<400> 2
acggcagcac gagagagctt gctctcttgg tggcgagtgg cggacgggtg agtaatatat 60
cggaacgtgc ccagtagcgg gggataacta ctcgaaagag tggctaatac cgcatacgcc 120
ctacggggga aaggggggga ttcttcggaa cctctcacta ttggagcggc cgatatcgga 180
ttagctagtt ggtggggtaa aggctcacca aggcaacgat ccgtagctgg tttgagagga 240
cgaccagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300
attttggaca atgggggaaa ccctgatcca gccatcccgc gtgtatgatg aaggccttcg 360
ggttgtaaag tacttttggc agagaagaaa aggtatctcc taatacgaga tactgctgac 420
ggtatctgca gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt 480
gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgtgta ggcggttcgg aaagaaagat 540
gtgaaatccc agggctcaac cttggaactg catttttaac tgccgagcta gagtatgtca 600
gaggggggta gaattccacg tgtagcagtg aaatgcgtag atatgtggag gaataccgat 660
ggcgaaggca gccccctggg ataatactga cgctcagaca cgaaagcgtg gggagcaaac 720
aggattagat accctggtag tccacgccct aaacgatgtc aactagctgt tggggccgtt 780
aggccttagt agcgcagcta acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 840
taaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga 900
tgcaacgcga aaaaccttac ctacccttga catgtctgga atcccgaaga gatttgggag 960
tgctcgcaag agaaccggaa cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcatt agttgctacg caagagcact 1080
ctaatgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc 1140
ccttatgggt agggcttcac acgtcataca atggtcggga cagagggtcg ccaacccgcg 1200
agggggagcc aatctcagaa acccgatcgt agtccggatc gcagtctgca actcgactgc 1260
gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagaatgtcg cggtgaaata cgttcccggg 1320
tcttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggtttc accagaagta ggtagcctaa 1380
cc 1382
<210> 3
<211> 1369
<212> DNA
<213> 不动杆菌 PR-DN3(Acinetobacter sp.PR-DN3)
<400> 3
agctcgctac tggacctagc ggcggacggg tgagtaatgc ttaggaatct gcctattagt 60
gggggacaac attccgaaag gaatgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagcaggg 120
gaccttcggg ccttgcgcta atagatgagc ctaagtcgga ttagctagtt ggtggggtaa 180
aggcctacca aggcgacgat ctgtagcggg tctgagagga tgatccgcca cactgggact 240
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atggggggaa 300
ccctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttat ggttgtaaag cactttaagc 360
gaggaggagg ctactagtat taatactact ggatagtgga cgttactcgc agaataagca 420
ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcgagcgtt aatcggattt 480
actgggcgta aagcgtgcgt aggcggccat ttaagtcaaa tgtgaaatcc ccgagcttaa 540
cttgggaatt gcattcgata ctggatggct agagtatggg agaggatggt agaattccag 600
gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgga ggaataccga tggcgaaggc agccatctgg 660
cctaatactg acgctgaggt acgaaagcat ggggagcaaa caggattaga taccctggta 720
gtccatgccg taaacgatgt ctactagccg ttggggcctt tgaggcttta gtggcgcagc 780
taacgcgata agtagaccgc ctggggagta cggtcgcaag actaaaactc aaatgaattg 840
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt 900
acctggcctt gacatactag aaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaatctaga 960
tacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1020
cgagcgcaac ccttttcctt acttgccagc atttcggatg ggaactttaa ggatactgcc 1080
agtgacaaac tggaggaagg cggggacgac gtcaagtcat catggccctt acggccaggg 1140
ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgctac ctagcgatag gatgctaatc 1200
tcaaaaagcc gatcgtagtc cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc 1260
gctagtaatc gcggatcaga atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1320
ccgtcacacc atgggagttt gttgcaccag aagtaggtag tctaaccgc 1369
<210> 4
<211> 1377
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌 PR-DN4(Bacillus cereus.PR-DN4)
<400> 4
ccaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg 60
gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct tcatgtaggc 120
gagttgcagc ctacaatccg aactgagaac ggttttatga gattagctcc acctcgcggt 180
cttgcagctc tttgtaccgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg 240
atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc 300
caacttaatg atggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat 360
ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgctccc gaaggagaag 420
ccctatctct agggttttca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg 480
aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcagcc 540
ttgcggccgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttaa cttcagcact aaagggcgga 600
aaccctctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg 660
tttgctcccc acgctttcgc gcctcagtgt cagttacaga ccagaaagtc gccttcgcca 720
ctggtgttcc tccatatctc tacgcatttc accgctacac atggaattcc actttcctct 780
tctgcactca agtctcccag tttccaatga ccctccacgg ttgagccgtg ggctttcaca 840
tcagacttaa gaaaccacct gcgcgcgctt tacgcccaat aattccggat aacgcttgcc 900
acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ttaggtaccg 960
tcaaggtgcc agcttattca actagcactt gttcttccct aacaacagag ttttacgacc 1020
cgaaagcctt catcactcac gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat 1080
tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca 1140
ccctctcagg tcggctacgc atcgttgcct tggtgagccg ttacctcacc aactagctaa 1200
tgcgacgcgg gtccatccat aagtgacagc cgaagccgcc tttcaatttc gaaccatgcg 1260
gttcaaaatg ttatccggta ttagccccgg tttcccggag ttatcccagt cttatgggca 1320
ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc gctaacttca taagagcaag ctcttaa 1377
<210> 5
<211> 1382
<212> DNA
<213> 微小杆菌 PR-DN5(Exiguobacterium sp.PR-DN5)
<400> 5
ccggcttcgg gtgttgcaaa ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa gacccgggaa 60
cgtattcacc gcagtatgct gacctgcgat tactagcgat tccgacttca tgcaggcgag 120
ttgcagcctg caatccgaac tgggaacggc tttatgggat tggctccacc tcgcggtctc 180
gctgcccttt gtaccgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc aactcataag gggcatgatg 240
atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtctcccta gagtgcccaa 300
ctgaatgctg gcaactaagg ataggggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 360
acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcacca ttgtccccga agggaaaact 420
tgatctctca agcggtcaat gggatgtcaa gagttggtaa ggttcttcgc gttgcttcga 480
attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gtccccgtca attcctttga gtttcagcct 540
tgcggccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc ttcagcactg aggggcggaa 600
acccccccaa cactagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660
ttgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc agttacagac caaagagtcg ccttcgccac 720
tggtgttcct ccacatctct acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctcttctctt 780
ctgtactcaa gccttccagt ttccaatggc cctccccggt tgagccgggg gctttcacat 840
cagacttaaa aggccgcctg cgcgcgcttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca 900
cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctcgt aaggtaccgt 960
caaggtacga gcattccctc tcgtacgtgt tcttccctta caacagagtt ttacgatccg 1020
aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt tcgtccattg tggaagattc 1080
cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc 1140
ctctcaggtc ggctatgcat cgtcgccttg gtgggccgtt accccaccaa ctagctaatg 1200
caccgcaagg ccatctcaag gtgacgccgg agcgcctttc atcagcggac catgcggtcc 1260
gatgaactat ccggtattag ctccgatttc tcggagttat cccaatcctt gaggcaggtt 1320
ccttacgtgt tactcacccg tccgccgctc attccgctgc cttccctccg aagagttccg 1380
tc 1382

Claims (6)

1.一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基在制备复合菌剂中的应用，其特征在于：所述复合菌培养基的成分为：可溶性淀粉5g/L、玉米淀粉8g/L、葡萄糖5g/L、甘油2g/L、尿素3g/L、(NH4)2SO4 2g/L、NaCl 1g/L、K2HPO4 1g/L以及KH2PO4 2g/L；
复合菌剂为气单胞菌（Aeromonassp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus .）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5；五种菌株分别于2019年4月15日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，PR-DN1的保藏编号为CCTCC NO:M2019255，PRDN2的保藏编号为CCTCC NO: M2019372，PR-DN3的保藏编号为CCTCC NO:M2019373，PR-DN4的保藏编号为CCTCC NO:M2019374、PR-DN5的保藏编号为CCTCC NO:M2019413；
所述复合菌培养基pH为 6.0-7 .2；
所述复合菌剂的制备步骤如下：
（1）各菌株的培养：将气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp .）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus .）PRDN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp .）PR-DN5五种菌种分别接种于LB培养基进行培养，将培养后的各菌株按比例混合；
（2）菌剂放大培养：将步骤（1）得到的混合菌液接种于LB培养基中进行培养后，再将混合菌种液接种于复合菌培养基中，并放置于发酵罐中进行培养，加入消泡剂进行发酵，发酵完毕后出罐；
（3）复合菌剂制备方法：将发酵获得的菌液在5000r/min离心机离心15min后，去除上清液，加入生理盐水在5000r/min离心机离心15min，去除上清液，获得菌泥，加入生理盐水配制成菌液悬浊液，再加入添加剂，制备成复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）中混合菌液的体积为LB培养基体积的1-5%；所述混合菌种液的体积为复合菌培养基的2-10%。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤（1）中气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp .）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus .）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5五种菌种的活菌数比例为1-10：1-5：1-5：1-10：1-5。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤（3）中复合菌剂的总活菌数为1×109cfu/g-4× 109cfu/g；所述步骤（3）制成的复合菌剂中，五种菌体的体积之和占复合菌剂总体积的20%-50%。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤（1）中在LB培养基中进行培养的条件为：30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h；所述步骤（2）中在LB培养基中进行培养的条件为：30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h；所述步骤（2）中在复合菌培养基中进行培养的条件为：30℃、溶解氧40%-60%、pH为7 .0条件下发酵罐培养36-60h。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤（3）中添加剂为营养剂、保藏助剂、载体的混合物；所述步骤（2）中出罐时，发酵液中活菌数达到1× 1010-2×1011cfu/mL；所述步骤（2）中加入的消泡剂体积为2/10000发酵液体积；所述步骤（2）中，复合菌培养基的体积为发酵罐体积的75%，发酵过程通入的气体为空气。
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滇池可培养好氧反硝化细菌多样性及其脱氮特性;王永霞等;《微生物学报》;20180126;第58卷(第10期);摘要、第1766-1769页 *

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