CN110317752B - 一种脱氮菌剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种脱氮菌剂，该菌剂包括气单胞菌（Aeromonas sp.）PR‑DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR‑DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR‑DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR‑DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR‑DN5，将上述菌剂投入到含有硝态氮、亚硝态氮的废水中，混合均匀，即可用于废水处理；本发明所述的脱氮菌剂，是根据废水特性，经过大量筛选复配得到的高效菌剂，可有效去除废水中的硝态氮和亚硝态氮，操作简单，缩短治理周期，环境友好，运行成本低。

Description

一种脱氮菌剂及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种脱氮菌剂及其使用方法，涉及废水治理领域。
背景技术
地球上所有的氮化物主要来源为氮气。采矿、工业和农业固氮、含氮日用品等过量排入环境等人类活动，严重干扰大自然的氮素循环，造成氮素污染。所有氮素循环的中间产物均对人类和环境产生不良影响，其中，氨氮、硝态氮、亚硝态氮均可诱发水体富营养化，亚硝态氮为致癌物，并可通过亚硝酸氨化作用再次转化为氨氮，硝态氮可氧化亚铁离子成三价铁离子，引起婴儿高铁血红蛋白症。只有彻底去除水体中的氮素，才能避免氮素对人和生态环境的不利影响。氮素的去除方法分为物理化学法和生物法，生物法成本低，不产生二次污染，是脱氮的首选工艺。
羟乙基纤维素生产过程排放废水具有污染物成分复杂，废水浓度高，存在生物难降解物质等特点。废水中含有大量毒性含氮物质，尤其含有大量的硝态氮。目前羟乙基纤维素化工废水的方法主要有：厌氧+缺氧+好氧、SBR工艺等。羟乙基纤维素生产废水中含有的生物毒性物质对生化系统中的微生物的生命活动具有强烈的抑制作用，废水中含有的大量硝态氮，需要延长生化系统处理时间，因而降低了生化系统处理效率。
生物增效是通过添加具有某种特定降解能力的微生物菌株来增强原有微生物种群作用的方法。生物增效的微生物菌株通常从自然界筛选而来，加入系统后，不会产生环境危害。生物增效技术使用方法简单，不增加基建费用，可在短时间内提升废水处理效果。
发明内容
本发明提供了一种脱氮菌剂，以解决现有技术中，羟乙基纤维素生产废水生化系统脱氮效率低的问题。该菌剂由营养组分、微生物组分、载体组成。
为了实现本发明的目的，通过人工筛选出5株脱氮菌株，并复配成一种生物增效菌剂，并将其应用于羟乙基纤维素生产废水的处理，在不增加设备投资、基建成本的前提下，提高原有生化系统的处理能力。试验表明，用本发明菌剂对硝态氮、亚硝态氮含量为20~1000mg/L的废水进行处理，一般情况下，处理效果均可达90%以上，最高可接近100%，而且制备方法简单，运行费用不高，反应时间短。
本发明采用的技术方案如下：
一种脱氮菌剂，所述脱氮菌剂包括气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5；五种菌株分别于2019年4月15日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），PR-DN1的保藏编号为CCTCC NO:M2019255，PR-DN2的保藏编号为CCTCC NO:M2019372，PR-DN3的保藏编号为CCTCC NO:M2019373，PR-DN4的保藏编号为CCTCC NO:M2019374、PR-DN5的保藏编号为CCTCC NO:M2019413。
本发明的具体实施步骤为，首先获得生物增效菌剂的菌种气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5。
生物增效菌剂菌株PR-DN1、PR-DN2、PR-DN3分离自南京某污水处理厂活性污泥中，16S rDNA基因测序鉴定分别为气单胞菌、产碱杆菌、不动杆菌，分别于2019年4月15日、2019年5月20日、2019年5月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），PR-DN1的保藏编号为CCTCCM 2019255，PR-DN2的保藏编号为CCTCCM 2019372，PR-DN3的保藏编号为CCTCCM2019373。
作为本发明的一种改进，所述气单胞菌PR-DN1、产碱杆菌PR-DN2、不动杆菌PR-DN3的分离工艺，具体步骤如下：
（1）将活性污泥按106、107、108倍进行稀释；
（2）吸取0.1mL稀释液加入到筛选培养基上，用玻璃棒涂布均匀并进行培养，挑取长势最好的3株菌，分别命名为PR-DN1、PR-DN2、PR-DN3，分别扩增其16S rDNA并测定其16SrDNA序列，即可获得。
作为本发明的一种改进，所述步骤（2）中筛选培养基组成为：200mg/L硝态氮、磷酸二氢钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、琼脂20g/L。
作为本发明的一种改进，所述步骤（2）中培养的反应条件为：33℃培养48h-72h。
生物增效菌剂菌株PR-DN4、PR-DN5分离自南京江北某污水处理厂活性污泥中，16SrDNA基因测序鉴定分别为蜡样芽胞杆菌、微小杆菌，分别于2019年5月20日、2019年5月31日，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），PR-DN4的保藏编号为CCTCCM 2019374、PR-DN5的保藏编号为CCTCCM 2019413。
作为本发明的一种改进，所述蜡样芽孢杆菌PR-DN4、微小杆菌PR-DN5的分离工艺，具体步骤如下：
（1）将活性污泥按照106、107、108倍进行稀释；
（2）吸取0.1mL稀释液加入到筛选培养基上，用玻璃棒涂布均匀并进行培养，挑取长势最好的2株菌，分别命名为PR-DN4、PR-DN5，分别扩增其16S rDNA并测定其16S rDNA序列，即可获得。
作为本发明的一种改进，所述步骤（2）中筛选培养基组成为：150mg/L硝态氮、磷酸二氢钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、琼脂20g/L。
作为本发明的一种改进，所述步骤（2）中培养的反应条件为：33℃培养48h-72h。
本发明的另一个技术方案为，利用上述5种菌株制备微生物脱氮菌剂。
作为本发明的一种改进，所述制备工艺的步骤如下：
（1）将气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5分别接种到灭菌后的LB 培养基中，30℃培养24-28h，得到种子液；
（2）将5种菌株的种子液分别接种到灭菌后的LB培养基中进行发酵，30℃培养36h-60h，获取活菌数为109-1011cfu/mL的发酵液；
（3）将气单胞菌（Aeromonas sp.）、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）五种菌株的发酵液按照体积比5-50：5-20：5-20：5-50：5-20配制成混合液，离心收集菌体，然后用无机盐培养液适当稀释菌体，并使菌液浓度为1010-1011cfu/mL，得到脱氮菌剂。
作为本发明的一种改进，所述步骤（1）中LB培养基组成成分为胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2；所述步骤（2）中种子液的体积为LB培养基体积的1%-5%。无机盐培养基培养液的成分及浓度是本领域技术人员熟知的，例如可以含有K+、Ca2+、Na+、Mg2 +、Fe3+等离子。
作为本发明的一种改进，所述的脱氮菌剂在处理羟乙基纤维素生产过程中废水排放的应用。
上述含有5种菌的生物增效菌剂能够有效降解羟乙基纤维素生产废水中的难降解物质及硝态氮，因此本发明的技术方案还包括本发明的生物增效菌剂处理羟乙基纤维素生产废水的用途。
使用本发明的生物增效菌剂处理羟乙基纤维素生产废水，具体使用方法如下：
首先进行常规活性污泥驯化阶段：向缺氧池中加入30%的羟乙基纤维素废水处理厂活性污泥，进水为羟乙基纤维素生产外排废水，硝态氮浓度为200-2000mg/L，一般为200-900mg/L，进水充满缺氧池后，开始搅拌，24h-48h后，开始连续进水，水力停留时间为72h，连续循环20-30天，待缺氧池内活性污泥稳定生长到4000-6000mg/L时，并且出水硝态氮浓度稳定后，完成驯化阶段。
本发明方法中，脱氮菌剂生长迅速，投加后生物增效效果明显，故系统的活性污泥浓度低于6000 mg/L条件下投加，为保持生物增效效果，7天内不建议排泥。
本发明方法中，脱氮菌剂投加方式为一次性投加或分批投加。分批投加时，每隔1天投加1次，直至出水总氮浓度低于20 mg/L，优先低于10 mg/L，并能稳定运行10天以上，可停止投加。
本发明方法中，一次性投加，投加量为每小时污水处理体积的1%-10%。分批投加，首次投加量为污水处理体积的0.2%-1%，以后逐次递减，每次比上一次投加的菌体量减少20%-40%。投加后污水处理系统在1个月内不能排泥。对于间歇处理反应器，每小时处理污水体积为每个处理周期内平均每小时处理污水体积。
本发明方法中，羟乙基纤维素生产过程排放废水的生化处理系统为现有的活性污泥法生化处理系统，即A/O工艺。污水的处理温度为25-40℃，溶解氧为0.2-7mg/L，pH为6-10，优选pH为7-9。
本发明方法中，含氮废水为羟乙基纤维素生产过程排放废水，该废水中NH3-N浓度为1-20mg/L，NO3 --N浓度为200-800mg/L，NO2 --N浓度为10-50mg/L，CODCr浓度为900-2000mg/L，pH为6.0-9.0，不利于生物降解。
由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：
本发明所用的生物增效菌剂可以有效地提高缺氧反硝化池活性污泥降解硝态氮的能力，硝态氮去除率可达95%以上，同时改善污泥结构组成与生物活性。
本发明的实施无需建设新系统、投资新设备，大大降低了污水处理的运行成本，且不会造成二次污染。特别适合于羟乙基纤维素生产废水的处理。
本发明所述的脱氮菌剂，是根据废水特性，经过大量筛选复配得到的高效菌剂，可有效去除废水中的硝态氮和亚硝态氮，操作简单，缩短治理周期，环境友好，运行成本低。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。
实施例1：
生物增效菌剂菌株的获得
生物增效菌剂菌株PR-DN1、PR-DN2、PR-DN3分离自南京某污水处理厂活性污泥中，16S rDNA基因测序鉴定分别为气单胞菌、产碱杆菌、不动杆菌，分别于2019年4月15日、2019年5月20日、2019年5月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），PR-DN1的保藏编号为CCTCCM 2019255，PR-DN2的保藏编号为CCTCCM 2019372，PR-DN3的保藏编号为CCTCCM2019373。
筛选培养基组成为：200mg/L硝态氮、磷酸二氢钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，琼脂20g/L。将活性污泥进行梯度稀释（稀释106、107、108倍），吸取0.1mL稀释液加入到筛选培养基上，用玻璃棒涂布均匀，33℃培养48h-72h，挑取长势最好的3株菌，分别命名为PR-DN1、PR-DN2、PR-DN3，分别扩增其16S rDNA并测定其16S rDNA序列，在GenBank中对比后确定分别为气单胞菌、产碱杆菌、不动杆菌。
生物增效菌剂菌株PR-DN4、PR-DN5分离自南京江北某污水处理厂活性污泥中，16SrDNA基因测序鉴定分别为蜡样芽胞杆菌、微小杆菌，分别于2019年5月20日、2019年5月31日，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），PR-DN4的保藏编号为CCTCCM 2019374、PR-DN5的保藏编号为CCTCCM 2019413。
筛选培养基组成为：150mg/L硝态氮、磷酸二氢钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，琼脂20g/L。将活性污泥进行梯度稀释（稀释106、107、108倍），吸取0.1mL稀释液加入到筛选培养基上，用玻璃棒涂布均匀，33℃培养48h-72h，挑取长势最好的2株菌，分别命名为PR-DN4、PR-DN5，分别扩增其16S rDNA并测定其16S rDNA序列，在GenBank中对比后确定分别为蜡样芽孢杆菌、微小杆菌。
实施例2：
生物增效菌剂的制备
将实施例1获得的生物增效菌剂菌株，气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5，这5株菌分别接种到灭菌后的LB 培养基中进行活化，作为种子液，30℃培养24-28h，然后将5株菌的种子液分别接种到灭菌后的LB培养基（种子液的体积为LB培养基体积的1%-5%）中进行发酵0℃培养36h-60h，获取活菌数为109-1011cfu/mL的发酵液。将气单胞菌（Aeromonas sp.）、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）按照体积比30：17：17：20：16配制成混合液，离心收集菌体，然后用无机盐培养液适当稀释菌体，使菌液浓度在1010-1011cfu/mL，得到生物增效菌剂。
上述LB培养基组成成分为胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2。无机盐培养基培养液的成分及浓度是本领域技术人员熟知的，例如可以含有K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+等离子。
实施例3：
生物增效菌剂的制备
除上述5种菌株的发酵液按体积40：10：10：20：20配制成混合液外，制备方法同实施例2。
实施例4：
生物增效菌剂的制备
除上述5种菌株的发酵液按体积40：15：15：15：15配制成混合液外，制备方法同实施例2。
实施例5：
某羟乙基纤维素生产含氮废水采用A/O工艺进行处理。废水中的NH3-N浓度为20mg/L，NO3 --N浓度为397mg/L，NO2 --N浓度为5mg/L，CODCr浓度为1100 mg/L。处理后废水不能达标排放。采用本发明方法，向污水处理系统中投加实施例2所述的生物菌剂。投加过程中，系统内的温度为32℃，溶解氧为0.1-0.3mg/L，pH为7.8-8.5。首次投加量为所处理污水量的0.5%，每隔1天向污水处理系统中投加一次，每次投加比上次减少40%，共投加2次。两次投加后，排放出水硝态氮浓度低于5mg/L，总氮浓度低于5mg/L，连续运行25天，出水硝态氮浓度和总氮浓度均低于5mg/L。CODCr浓度低于60mg/L。
实施例6：
某羟乙基纤维素生产含氮废水中的NH3-N浓度为5mg/L，NO3 --N浓度为265mg/L，NO2 --N浓度为11mg/L，CODCr浓度为900 mg/L。处理后废水不能达标排放。采用本发明方法，向污水处理系统中投加实施例3所述的生物增效菌剂。投加过程中，系统内的温度为29℃，溶解氧为0.1-0.3mg/L，pH为7.2-7.6。首次投加量为所处理污水量的0.3%，每隔1天向污水处理系统中投加一次，每次投加比上次减少30%，共投加3次。两次投加后，排放出水硝态氮浓度低于5mg/L，总氮浓度低于5mg/L，连续运行25天，出水硝态氮和总氮均低于5mg/L。CODCr浓度低于60mg/L。
实施例7：
某羟乙基纤维素生产含氮废水中的NH3-N浓度为11mg/L，NO3 --N浓度为620mg/L，NO2 --N浓度为12mg/L，CODCr浓度为1530 mg/L。处理后废水不能达标排放。采用本发明方法，向污水处理系统中投加实施例4所述的生物增效菌剂。投加过程中，系统内的温度为33℃，溶解氧为0.1-0.3mg/L，pH为7.6-8.4。首次投加量为所处理污水量的0.3%，每隔1天向污水处理系统中投加一次，每次投加比上次减少30%，共投加5次。两次投加后，排放出水硝态氮浓度低于5mg/L，总氮浓度低于5mg/L，连续运行25天，出水硝态氮和总氮均低于5mg/L。CODCr浓度低于60mg/L。
附：气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1菌株序列（SEQ ID NO.1）
ATCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAACATTCTGATTTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGCGCTTTTTGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCAGCCCTCTGTACGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCCTTGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGGACAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCTGATTCCCGAAGGCACTCCCGCATCTCTGCAGGATTCCAGACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGTCTCAAGGACACAGCCTCCAAATCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCTGGACAGTTTTAAATGCAATTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCTAACTTATCCAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCACAGTCAGCAGATATTAGCTACTGACCTTTCCTCCTCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCCACCTGGGCATATCCAATCGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAGCAGTCGTTTCCAACTGTTATCCCCCTCGACTGGGCAATTTCCCAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGCCGGCAAAAGTAGCAAGCTACTTTC
产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2菌株序列（SEQ ID NO.2）
ACGGCAGCACGAGAGAGCTTGCTCTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATATATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATTCTTCGGAACCTCTCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTATGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTTGGCAGAGAAGAAAAGGTATCTCCTAATACGAGATACTGCTGACGGTATCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGTGTAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTGCCGAGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCAGACACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCGTTAGGCCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCCGAAGAGATTTGGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCTCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGTCGCGGTGAAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACC
不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3菌株序列（SEQ ID NO.3）
AGCTCGCTACTGGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTAGTATTAATACTACTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCCATTTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGATGGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACTAGAAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAATCTAGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTACTTGCCAGCATTTCGGATGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCGC
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4菌株序列（SEQ ID NO.4）
CCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAA
微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5菌株序列（SEQ ID NO.5）
CCGGCTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGAACGGCTTTATGGGATTGGCTCCACCTCGCGGTCTCGCTGCCCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAACTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCATTGTCCCCGAAGGGAAAACTTGATCTCTCAAGCGGTCAATGGGATGTCAAGAGTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTTCAGCACTGAGGGGCGGAAACCCCCCCAACACTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTTCTCTTCTGTACTCAAGCCTTCCAGTTTCCAATGGCCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAGGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCGTAAGGTACCGTCAAGGTACGAGCATTCCCTCTCGTACGTGTTCTTCCCTTACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCACCGCAAGGCCATCTCAAGGTGACGCCGGAGCGCCTTTCATCAGCGGACCATGCGGTCCGATGAACTATCCGGTATTAGCTCCGATTTCTCGGAGTTATCCCAATCCTTGAGGCAGGTTCCTTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTCATTCCGCTGCCTTCCCTCCGAAGAGTTCCGTC
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 博瑞德环境集团股份有限公司
<120> 一种脱氮菌剂及其使用方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1368
<212> DNA
<213> 气单胞菌 PR-DN1(Aeromonas sp.PR-DN1)
<400> 1
atctacttct ggtgcaaccc actcccatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga 60
acgtattcac cgcaacattc tgatttgcga ttactagcga ttccgacttc atggagtcga 120
gttgcagact ccaatccgga ctacgacgcg ctttttggga ttcgctcact atcgctagct 180
tgcagccctc tgtacgcgcc attgtagcac gtgtgtagcc ctggccgtaa gggccatgat 240
gacttgacgt catccccacc ttcctccggt ttatcaccgg cagtctccct tgagttccca 300
ccattacgtg ctggcaacaa aggacagggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat 360
ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtgt tctgattccc gaaggcactc 420
ccgcatctct gcaggattcc agacatgtca aggccaggta aggttcttcg cgttgcatcg 480
aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcatttg agttttaacc 540
ttgcggccgt actccccagg cggtcgattt aacgcgttag ctccggaagc cacgtctcaa 600
ggacacagcc tccaaatcga catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660
ttgctcccca cgctttcgca cctgagcgtc agtctttgtc cagggggccg ccttcgccac 720
cggtattcct ccagatctct acgcatttca ccgctacacc tggaattcta cccccctcta 780
caagactcta gctggacagt tttaaatgca attcccaggt tgagcccggg gctttcacat 840
ctaacttatc caaccgcctg cgtgcgcttt acgcccagta attccgatta acgcttgcac 900
cctccgtatt accgcggctg ctggcacgga gttagccggt gcttcttctg cgagtaacgt 960
cacagtcagc agatattagc tactgacctt tcctcctcgc tgaaagtgct ttacaacccg 1020
aaggccttct tcacacacgc ggcatggctg catcagggtt tcccccattg tgcaatattc 1080
cccactgctg cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag ttccagtgtg gctgatcatc 1140
ctctcagacc agctagggat cgtcgccttg gtgagccatt acctcaccaa ctagctaatc 1200
ccacctgggc atatccaatc gcgcaaggcc cgaaggtccc ctgctttccc ccgtagggcg 1260
tatgcggtat tagcagtcgt ttccaactgt tatccccctc gactgggcaa tttcccaggc 1320
attactcacc cgtccgccgc tcgccggcaa aagtagcaag ctactttc 1368
<210> 2
<211> 1382
<212> DNA
<213> 产碱杆菌 PR-DN2(Alcaligenes sp.PR-DN2)
<400> 2
acggcagcac gagagagctt gctctcttgg tggcgagtgg cggacgggtg agtaatatat 60
cggaacgtgc ccagtagcgg gggataacta ctcgaaagag tggctaatac cgcatacgcc 120
ctacggggga aaggggggga ttcttcggaa cctctcacta ttggagcggc cgatatcgga 180
ttagctagtt ggtggggtaa aggctcacca aggcaacgat ccgtagctgg tttgagagga 240
cgaccagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300
attttggaca atgggggaaa ccctgatcca gccatcccgc gtgtatgatg aaggccttcg 360
ggttgtaaag tacttttggc agagaagaaa aggtatctcc taatacgaga tactgctgac 420
ggtatctgca gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt 480
gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgtgta ggcggttcgg aaagaaagat 540
gtgaaatccc agggctcaac cttggaactg catttttaac tgccgagcta gagtatgtca 600
gaggggggta gaattccacg tgtagcagtg aaatgcgtag atatgtggag gaataccgat 660
ggcgaaggca gccccctggg ataatactga cgctcagaca cgaaagcgtg gggagcaaac 720
aggattagat accctggtag tccacgccct aaacgatgtc aactagctgt tggggccgtt 780
aggccttagt agcgcagcta acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 840
taaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga 900
tgcaacgcga aaaaccttac ctacccttga catgtctgga atcccgaaga gatttgggag 960
tgctcgcaag agaaccggaa cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcatt agttgctacg caagagcact 1080
ctaatgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc 1140
ccttatgggt agggcttcac acgtcataca atggtcggga cagagggtcg ccaacccgcg 1200
agggggagcc aatctcagaa acccgatcgt agtccggatc gcagtctgca actcgactgc 1260
gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagaatgtcg cggtgaaata cgttcccggg 1320
tcttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggtttc accagaagta ggtagcctaa 1380
cc 1382
<210> 3
<211> 1369
<212> DNA
<213> 不动杆菌 PR-DN3(Acinetobacter sp.PR-DN3)
<400> 3
agctcgctac tggacctagc ggcggacggg tgagtaatgc ttaggaatct gcctattagt 60
gggggacaac attccgaaag gaatgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagcaggg 120
gaccttcggg ccttgcgcta atagatgagc ctaagtcgga ttagctagtt ggtggggtaa 180
aggcctacca aggcgacgat ctgtagcggg tctgagagga tgatccgcca cactgggact 240
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atggggggaa 300
ccctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttat ggttgtaaag cactttaagc 360
gaggaggagg ctactagtat taatactact ggatagtgga cgttactcgc agaataagca 420
ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcgagcgtt aatcggattt 480
actgggcgta aagcgtgcgt aggcggccat ttaagtcaaa tgtgaaatcc ccgagcttaa 540
cttgggaatt gcattcgata ctggatggct agagtatggg agaggatggt agaattccag 600
gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgga ggaataccga tggcgaaggc agccatctgg 660
cctaatactg acgctgaggt acgaaagcat ggggagcaaa caggattaga taccctggta 720
gtccatgccg taaacgatgt ctactagccg ttggggcctt tgaggcttta gtggcgcagc 780
taacgcgata agtagaccgc ctggggagta cggtcgcaag actaaaactc aaatgaattg 840
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt 900
acctggcctt gacatactag aaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaatctaga 960
tacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1020
cgagcgcaac ccttttcctt acttgccagc atttcggatg ggaactttaa ggatactgcc 1080
agtgacaaac tggaggaagg cggggacgac gtcaagtcat catggccctt acggccaggg 1140
ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgctac ctagcgatag gatgctaatc 1200
tcaaaaagcc gatcgtagtc cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc 1260
gctagtaatc gcggatcaga atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1320
ccgtcacacc atgggagttt gttgcaccag aagtaggtag tctaaccgc 1369
<210> 4
<211> 1377
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌 PR-DN4(Bacillus cereus.PR-DN4)
<400> 4
ccaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg 60
gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct tcatgtaggc 120
gagttgcagc ctacaatccg aactgagaac ggttttatga gattagctcc acctcgcggt 180
cttgcagctc tttgtaccgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg 240
atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc 300
caacttaatg atggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat 360
ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgctccc gaaggagaag 420
ccctatctct agggttttca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg 480
aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcagcc 540
ttgcggccgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttaa cttcagcact aaagggcgga 600
aaccctctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg 660
tttgctcccc acgctttcgc gcctcagtgt cagttacaga ccagaaagtc gccttcgcca 720
ctggtgttcc tccatatctc tacgcatttc accgctacac atggaattcc actttcctct 780
tctgcactca agtctcccag tttccaatga ccctccacgg ttgagccgtg ggctttcaca 840
tcagacttaa gaaaccacct gcgcgcgctt tacgcccaat aattccggat aacgcttgcc 900
acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ttaggtaccg 960
tcaaggtgcc agcttattca actagcactt gttcttccct aacaacagag ttttacgacc 1020
cgaaagcctt catcactcac gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat 1080
tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca 1140
ccctctcagg tcggctacgc atcgttgcct tggtgagccg ttacctcacc aactagctaa 1200
tgcgacgcgg gtccatccat aagtgacagc cgaagccgcc tttcaatttc gaaccatgcg 1260
gttcaaaatg ttatccggta ttagccccgg tttcccggag ttatcccagt cttatgggca 1320
ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc gctaacttca taagagcaag ctcttaa 1377
<210> 5
<211> 1382
<212> DNA
<213> 微小杆菌 PR-DN5(Exiguobacterium sp.PR-DN5)
<400> 5
ccggcttcgg gtgttgcaaa ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa gacccgggaa 60
cgtattcacc gcagtatgct gacctgcgat tactagcgat tccgacttca tgcaggcgag 120
ttgcagcctg caatccgaac tgggaacggc tttatgggat tggctccacc tcgcggtctc 180
gctgcccttt gtaccgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc aactcataag gggcatgatg 240
atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtctcccta gagtgcccaa 300
ctgaatgctg gcaactaagg ataggggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 360
acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcacca ttgtccccga agggaaaact 420
tgatctctca agcggtcaat gggatgtcaa gagttggtaa ggttcttcgc gttgcttcga 480
attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gtccccgtca attcctttga gtttcagcct 540
tgcggccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc ttcagcactg aggggcggaa 600
acccccccaa cactagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660
ttgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc agttacagac caaagagtcg ccttcgccac 720
tggtgttcct ccacatctct acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctcttctctt 780
ctgtactcaa gccttccagt ttccaatggc cctccccggt tgagccgggg gctttcacat 840
cagacttaaa aggccgcctg cgcgcgcttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca 900
cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctcgt aaggtaccgt 960
caaggtacga gcattccctc tcgtacgtgt tcttccctta caacagagtt ttacgatccg 1020
aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt tcgtccattg tggaagattc 1080
cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc 1140
ctctcaggtc ggctatgcat cgtcgccttg gtgggccgtt accccaccaa ctagctaatg 1200
caccgcaagg ccatctcaag gtgacgccgg agcgcctttc atcagcggac catgcggtcc 1260
gatgaactat ccggtattag ctccgatttc tcggagttat cccaatcctt gaggcaggtt 1320
ccttacgtgt tactcacccg tccgccgctc attccgctgc cttccctccg aagagttccg 1380
tc 1382

Claims (4)

1.一种脱氮菌剂，其特征在于：所述脱氮菌剂包括气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）PR-DN4和微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5；五种菌株分别于2019年4月15日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月20日和2019年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，PR-DN1的保藏编号为CCTCC NO：M 2019255，PR-DN2的保藏编号为CCTCC NO：M 2019372，PR-DN3的保藏编号为CCTCC NO：M 2019373，PR-DN4的保藏编号为CCTCC NO：M 2019374，PR-DN5的保藏编号为CCTCC NO：M 2019413。
2.根据权利要求1所述的一种脱氮菌剂，其特征在于，所述脱氮菌剂制备工艺的步骤如下：
（1）将气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）PR-DN4和微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5分别接种到灭菌后的LB 培养基中，30℃培养24-28h，得到种子液；
（2）将步骤（1）得到的5种菌株的种子液分别接种到灭菌后的LB培养基中进行发酵，30℃培养36h-60h，获取活菌数为109-1011cfu/mL的发酵液；
（3）将气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）PR-DN4和微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5五种菌株的发酵液按照体积比5-50：5-20：5-20：5-50：5-20配制成混合液，离心收集菌体，然后用无机盐培养液适当稀释菌体，并使菌液浓度为1010-1011cfu/mL，得到脱氮菌剂。
3.根据权利要求2所述的一种脱氮菌剂，其特征在于：所述步骤（1）中LB培养基组成成分为胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2；所述步骤（2）中种子液的体积为LB培养基体积的1%-5%。
4.根据权利要求1或3所述的脱氮菌剂在处理羟乙基纤维素生产过程中排放的废水中的应用。
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滇池可培养好氧反硝化细菌多样性及其脱氮特性;王永霞等;《微生物学报》;20180126;第58卷(第10期);第1764-1775页，参见摘要、第1765页左栏第1段、第1766页右栏第3段-第1767页右栏第1段、第1769页左栏第1段-右栏第1段、表1、图1 *

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