CN110257288A

CN110257288A - 一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用

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Publication number: CN110257288A
Application number: CN201910545931.2A
Authority: CN
Inventors: 李丽; 严月根; 吴华明; 张许阳; 袁妤; 刘芳蕾; 李�远
Original assignee: Puritek Environment Group Co ltd
Current assignee: Puritek Environment Group Co ltd
Priority date: 2019-06-23
Filing date: 2019-06-23
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-06-23
Also published as: CN110257288B

Abstract

本发明涉及一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用，复合菌培养基的成分为可溶性淀粉、玉米淀粉、硫酸铵、尿素、氯化钠、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等，使用本发明所述的复合菌的培养基培养获得的菌体数量是使用常规LB培养基的2‑3倍，培养出的混合菌性能稳定，生物活性高，对氨氮、硝态氮、亚硝态氮和COD均具有较好的降解能力，且成本为常规LB培养基的50%‑70%。

Description

一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用

技术领域

本发明涉及一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用，属于涉及微生物培养基技术领域。

背景技术

羟乙基纤维素生产过程排放废水具有污染物成分复杂，废水浓度高，存在生物难降解物质等特点。废水中含有大量毒性含氮物质，尤其含有大量的硝态氮。目前羟乙基纤维素化工废水的方法主要有：厌氧+缺氧+好氧、SBR工艺等。羟乙基纤维素生产废水中含有的生物毒性物质对生化系统中的微生物的生命活动具有强烈的抑制作用，废水中含有的大量硝态氮，需要延长生化系统处理时间，因而降低了生化系统处理效率。与物理、化学法相比，生物处理技术具有成本低、无二次污染的优点，因此，如何在现有生化处理工艺的基础上，高效去除含氮污染物，是羟乙基纤维素生产废水处理必须要解决的问题。将筛选获得的高活性菌种，以科学的配比复配成针对性强的微生物脱氮菌剂，将此菌剂投入生化处理系统，提升生化体统的处理效率，开发具有高生物活性特定培养基是保证该高效菌剂能够实现产业化应用的关键。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用，以解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基，所述复合菌培养基的成分为：可溶性淀粉5-15g/L、玉米淀粉5-15g/L、葡萄糖3-10g/L、甘油1-5g/L、尿素2-6g/L、(NH₄)₂SO₄ 1-3g/L、NaCl 1-5g/L、K₂HPO₄ 0.5-2g/L以及KH₂PO₄ 2-4g/L。

作为本发明的一种改进，所述复合菌培养基的pH 6.0-7.2。

作为本发明的一种改进，所述的培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基在制备复合菌剂中的应用。

作为本发明的一种改进，所述的复合菌剂的制备方法，步骤如下：

（1）各菌株的培养：将气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5五种菌种分别接种于LB培养基进行培养，将培养后的各菌株按比例混合；

（2）菌剂放大培养：将上述混合菌液接种于LB培养基中进行培养后，再将混合菌种液接种于复合菌培养基中，并放置于发酵罐中进行培养，加入消泡剂进行发酵，发酵完毕后出罐；

（3）复合菌剂制备方法：将发酵获得的菌液在5000r/min离心机离心15min后，去除上清液，加入9g/L的生理盐水在5000r/min离心机离心15min，去除上清液，获得的菌泥，加入9g/L的生理盐水配制成菌液悬浊液，加入营养剂、保藏助剂、载体等常规添加剂，制备成生物脱氮菌剂。

作为本发明的一种改进，所述步骤（2）中混合菌液的体积为LB培养基体积的1-5%；所述混合菌种液的体积为复合菌培养基的2-10%。

作为本发明的一种改进，所述气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5，五种菌株分别于2019年4月15日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），PR-DN1的保藏编号为CCTCC NO:M2019255，PR-DN2的保藏编号为CCTCC NO:M2019372，PR-DN3的保藏编号为CCTCC NO:M2019373，PR-DN4的保藏编号为CCTCC NO:M2019374，PR-DN5的保藏编号为CCTCC NO:M2019413。

作为本发明的一种改进，所述步骤（1）中气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5五种菌种的活菌数比例为1-10：1-5：1-5：1-10：1-5。

作为本发明的一种改进，所述步骤（3）中复合菌剂的总活菌数为1×10⁹cfu/g-4×10⁹cfu/g；所述步骤（3）制成的复合菌剂中，五种菌体的体积之和占复合菌剂总体积的20%-50%，优选为20%-40%。

作为本发明的一种改进，所述步骤（3）中添加剂为营养剂、保藏助剂、载体的混合物。

作为本发明的一种改进，所述步骤（1）中在LB培养基中进行培养的条件为：30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h；所述步骤（2）中在LB培养基中进行培养的条件为：30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h；所述步骤（2）中在复合菌培养基中进行培养的条件为：30℃、溶解氧40%-60%、pH为7.0条件下发酵罐培养36-60h。

作为本发明的一种改进，所述步骤（3）中添加剂为营养剂、保藏助剂、载体的混合物；所述步骤（2）中出罐时，发酵液中活菌数达到1×10¹⁰-2×10¹¹cfu/mL；所述步骤（2）中加入的消泡剂体积为2/10000发酵液体积；所述步骤（2）中，复合菌培养基的体积为发酵罐体积的75%，发酵过程通入的气体为空气。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

使用本发明所述的培养基培养获得的菌体数量是使用常规LB培养基的2-3倍，培养出的混合菌性能稳定，生物活性高，对氨氮、硝态氮、亚硝态氮和COD均具有较好的降解能力，且成本为常规LB培养基的50%-70%。

具体实施方式

下面仅用气单胞菌（Aeromonas sp.）、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）五种菌说明本发明的实施方案和效果，但本发明并不限于下述实施例。

实施例1：

培养基的配制

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，120℃灭菌20min。

复合菌培养基：溶性淀粉5g/L，玉米淀粉8g/L，葡萄糖5g/L，甘油2g/L，尿素3g/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，NaCl 1g/L，K₂HPO₄1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，pH 6.8。

将上述复合菌的培养基在制备复合菌剂中的应用，复合菌剂的制备方法，步骤如下：

（1）复合菌制备：将气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5分别接种于LB培养基中，在30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h，之后将培养后的气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5五种菌种按照活菌数比例为5：2：2：5：2的比例混合；

（2）复合菌剂放大培养：按上述混合菌液接种于LB培养基中（混合菌液的体积为LB培养基体积的3%），在30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h，之后再将混合菌种液接种于本发明的复合菌培养基中（混合菌种液的体积为复合菌培养基的6%），在30℃、溶解氧40%-60%、pH=7.0条件下发酵罐培养36h，发酵过程中约加入消泡剂（消泡剂体积为发酵液体积2/10000），下罐时，发酵液中活菌数达到1×10¹⁰-2×10¹¹cfu/mL。

各菌株初始发酵活菌数在1×10⁶-1×10⁷cfu/mL,培养48h后活菌数对比见表1。

表1 各菌株在本发明培养基与常规LB培养基培养48h后活菌数对比

	本发明培养基（cfu/mL）	LB培养基（cfu/mL）
			气单胞菌PR-DN1	5.1×10<sup>10</sup>	2.2×10<sup>10</sup>
产碱杆菌PR-DN2	3.7×10<sup>10</sup>	1.5×10<sup>10</sup>
			不动杆菌PR-DN3	2.8×10<sup>10</sup>	1.3×10<sup>10</sup>
蜡样芽孢杆菌PR-DN4	2.7×10<sup>10</sup>	1.2×10<sup>10</sup>
			微小杆菌PR-DN5	4.2×10<sup>10</sup>	1.4×10<sup>10</sup>

（3）复合菌剂制备方法：发酵获得的菌液在5000r/min离心机离心15min后，去除上清液，使用9g/L生理盐水在5000r/min离心机离心15min，去除上清液，获得的菌泥，采用9g/L生理盐水配制成菌液悬浊液，加入营养剂、保藏助剂、载体等常规添加剂，制备成复合菌剂，复合菌剂中上述五种菌体的体积之和占脱氮菌剂总体积的20%-50%，优选为20%-40%。

实施例2：

将上述经实施例1制备的复合菌剂，以1%投加量加入到某羟乙基纤维素生产外排废水中，废水中的NH₃-N浓度为4mg/L，NO₃ ^--N浓度为280mg/L，NO₂ ^--N浓度为10mg/L，COD_Cr浓度为900 mg/L。系统内的温度为29℃，溶解氧为0.1-0.3mg/L，pH为7.2-7.6。未添加复合菌剂前，处理后废水中的NO₃ ^--N浓度为50mg/L，不能达标排放。投加复合菌剂后，排放出水硝态氮浓度低于5mg/L，总氮浓度低于5mg/L，连续运行25天，出水硝态氮和总氮均低于5mg/L。COD_Cr浓度低于60mg/L。

实施例3：

将上述经实施例1制备的复合菌剂，以5%投加量加入到某羟乙基纤维素生产外排废水中，某羟乙基纤维素生产含氮废水中的NH₃-N浓度为8mg/L，NO₃ ^--N浓度为590mg/L，NO₂ ^--N浓度为12mg/L，COD_Cr浓度为1450 mg/L。系统内的温度为33℃，溶解氧为0.1-0.3mg/L，pH为7.6-8.4。未添加复合菌剂前，处理后废水中的NO₃ ^--N浓度为110mg/L，不能达标排放。处理后废水不能达标排放。投加复合菌剂后，排放出水硝态氮浓度低于5mg/L，总氮浓度低于5mg/L，连续运行25天，出水硝态氮和总氮均低于5mg/L。COD_Cr浓度低于60mg/L。

附：气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1菌株序列（SEQ ID NO.1）

ATCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAACATTCTGATTTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGCGCTTTTTGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCAGCCCTCTGTACGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCCTTGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGGACAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCTGATTCCCGAAGGCACTCCCGCATCTCTGCAGGATTCCAGACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGTCTCAAGGACACAGCCTCCAAATCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCTGGACAGTTTTAAATGCAATTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCTAACTTATCCAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCACAGTCAGCAGATATTAGCTACTGACCTTTCCTCCTCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCCACCTGGGCATATCCAATCGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAGCAGTCGTTTCCAACTGTTATCCCCCTCGACTGGGCAATTTCCCAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGCCGGCAAAAGTAGCAAGCTACTTTC

产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2菌株序列（SEQ ID NO.2）

ACGGCAGCACGAGAGAGCTTGCTCTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATATATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATTCTTCGGAACCTCTCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTATGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTTGGCAGAGAAGAAAAGGTATCTCCTAATACGAGATACTGCTGACGGTATCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGTGTAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTGCCGAGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCAGACACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCGTTAGGCCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCCGAAGAGATTTGGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCTCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGTCGCGGTGAAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACC

不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3菌株序列（SEQ ID NO.3）

AGCTCGCTACTGGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTAGTATTAATACTACTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCCATTTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGATGGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACTAGAAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAATCTAGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTACTTGCCAGCATTTCGGATGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCGC

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4菌株序列（SEQ ID NO.4）

CCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAA

微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5菌株序列（SEQ ID NO.5）

CCGGCTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGAACGGCTTTATGGGATTGGCTCCACCTCGCGGTCTCGCTGCCCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAACTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCATTGTCCCCGAAGGGAAAACTTGATCTCTCAAGCGGTCAATGGGATGTCAAGAGTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTTCAGCACTGAGGGGCGGAAACCCCCCCAACACTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTTCTCTTCTGTACTCAAGCCTTCCAGTTTCCAATGGCCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAGGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCGTAAGGTACCGTCAAGGTACGAGCATTCCCTCTCGTACGTGTTCTTCCCTTACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCACCGCAAGGCCATCTCAAGGTGACGCCGGAGCGCCTTTCATCAGCGGACCATGCGGTCCGATGAACTATCCGGTATTAGCTCCGATTTCTCGGAGTTATCCCAATCCTTGAGGCAGGTTCCTTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTCATTCCGCTGCCTTCCCTCCGAAGAGTTCCGTC

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 博瑞德环境集团股份有限公司

<120> 一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1368

<212> DNA

<213> 气单胞菌 PR-DN1(Aeromonas sp.PR-DN1)

<400> 1

atctacttct ggtgcaaccc actcccatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga 60

acgtattcac cgcaacattc tgatttgcga ttactagcga ttccgacttc atggagtcga 120

gttgcagact ccaatccgga ctacgacgcg ctttttggga ttcgctcact atcgctagct 180

tgcagccctc tgtacgcgcc attgtagcac gtgtgtagcc ctggccgtaa gggccatgat 240

gacttgacgt catccccacc ttcctccggt ttatcaccgg cagtctccct tgagttccca 300

ccattacgtg ctggcaacaa aggacagggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat 360

ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtgt tctgattccc gaaggcactc 420

ccgcatctct gcaggattcc agacatgtca aggccaggta aggttcttcg cgttgcatcg 480

aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcatttg agttttaacc 540

ttgcggccgt actccccagg cggtcgattt aacgcgttag ctccggaagc cacgtctcaa 600

ggacacagcc tccaaatcga catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660

ttgctcccca cgctttcgca cctgagcgtc agtctttgtc cagggggccg ccttcgccac 720

cggtattcct ccagatctct acgcatttca ccgctacacc tggaattcta cccccctcta 780

caagactcta gctggacagt tttaaatgca attcccaggt tgagcccggg gctttcacat 840

ctaacttatc caaccgcctg cgtgcgcttt acgcccagta attccgatta acgcttgcac 900

cctccgtatt accgcggctg ctggcacgga gttagccggt gcttcttctg cgagtaacgt 960

cacagtcagc agatattagc tactgacctt tcctcctcgc tgaaagtgct ttacaacccg 1020

aaggccttct tcacacacgc ggcatggctg catcagggtt tcccccattg tgcaatattc 1080

cccactgctg cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag ttccagtgtg gctgatcatc 1140

ctctcagacc agctagggat cgtcgccttg gtgagccatt acctcaccaa ctagctaatc 1200

ccacctgggc atatccaatc gcgcaaggcc cgaaggtccc ctgctttccc ccgtagggcg 1260

tatgcggtat tagcagtcgt ttccaactgt tatccccctc gactgggcaa tttcccaggc 1320

attactcacc cgtccgccgc tcgccggcaa aagtagcaag ctactttc 1368

<210> 2

<211> 1382

<212> DNA

<213> 产碱杆菌 PR-DN2(Alcaligenes sp.PR-DN2)

<400> 2

acggcagcac gagagagctt gctctcttgg tggcgagtgg cggacgggtg agtaatatat 60

cggaacgtgc ccagtagcgg gggataacta ctcgaaagag tggctaatac cgcatacgcc 120

ctacggggga aaggggggga ttcttcggaa cctctcacta ttggagcggc cgatatcgga 180

ttagctagtt ggtggggtaa aggctcacca aggcaacgat ccgtagctgg tttgagagga 240

cgaccagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300

attttggaca atgggggaaa ccctgatcca gccatcccgc gtgtatgatg aaggccttcg 360

ggttgtaaag tacttttggc agagaagaaa aggtatctcc taatacgaga tactgctgac 420

ggtatctgca gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt 480

gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgtgta ggcggttcgg aaagaaagat 540

gtgaaatccc agggctcaac cttggaactg catttttaac tgccgagcta gagtatgtca 600

gaggggggta gaattccacg tgtagcagtg aaatgcgtag atatgtggag gaataccgat 660

ggcgaaggca gccccctggg ataatactga cgctcagaca cgaaagcgtg gggagcaaac 720

aggattagat accctggtag tccacgccct aaacgatgtc aactagctgt tggggccgtt 780

aggccttagt agcgcagcta acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 840

taaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga 900

tgcaacgcga aaaaccttac ctacccttga catgtctgga atcccgaaga gatttgggag 960

tgctcgcaag agaaccggaa cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020

tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcatt agttgctacg caagagcact 1080

ctaatgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc 1140

ccttatgggt agggcttcac acgtcataca atggtcggga cagagggtcg ccaacccgcg 1200

agggggagcc aatctcagaa acccgatcgt agtccggatc gcagtctgca actcgactgc 1260

gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagaatgtcg cggtgaaata cgttcccggg 1320

tcttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggtttc accagaagta ggtagcctaa 1380

cc 1382

<210> 3

<211> 1369

<212> DNA

<213> 不动杆菌 PR-DN3(Acinetobacter sp.PR-DN3)

<400> 3

agctcgctac tggacctagc ggcggacggg tgagtaatgc ttaggaatct gcctattagt 60

gggggacaac attccgaaag gaatgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagcaggg 120

gaccttcggg ccttgcgcta atagatgagc ctaagtcgga ttagctagtt ggtggggtaa 180

aggcctacca aggcgacgat ctgtagcggg tctgagagga tgatccgcca cactgggact 240

gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atggggggaa 300

ccctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttat ggttgtaaag cactttaagc 360

gaggaggagg ctactagtat taatactact ggatagtgga cgttactcgc agaataagca 420

ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcgagcgtt aatcggattt 480

actgggcgta aagcgtgcgt aggcggccat ttaagtcaaa tgtgaaatcc ccgagcttaa 540

cttgggaatt gcattcgata ctggatggct agagtatggg agaggatggt agaattccag 600

gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgga ggaataccga tggcgaaggc agccatctgg 660

cctaatactg acgctgaggt acgaaagcat ggggagcaaa caggattaga taccctggta 720

gtccatgccg taaacgatgt ctactagccg ttggggcctt tgaggcttta gtggcgcagc 780

taacgcgata agtagaccgc ctggggagta cggtcgcaag actaaaactc aaatgaattg 840

acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt 900

acctggcctt gacatactag aaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaatctaga 960

tacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1020

cgagcgcaac ccttttcctt acttgccagc atttcggatg ggaactttaa ggatactgcc 1080

agtgacaaac tggaggaagg cggggacgac gtcaagtcat catggccctt acggccaggg 1140

ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgctac ctagcgatag gatgctaatc 1200

tcaaaaagcc gatcgtagtc cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc 1260

gctagtaatc gcggatcaga atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1320

ccgtcacacc atgggagttt gttgcaccag aagtaggtag tctaaccgc 1369

<210> 4

<211> 1377

<212> DNA

<213> 蜡样芽孢杆菌 PR-DN4(Bacillus cereus.PR-DN4)

<400> 4

ccaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg 60

gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct tcatgtaggc 120

gagttgcagc ctacaatccg aactgagaac ggttttatga gattagctcc acctcgcggt 180

cttgcagctc tttgtaccgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg 240

atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc 300

caacttaatg atggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat 360

ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgctccc gaaggagaag 420

ccctatctct agggttttca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg 480

aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcagcc 540

ttgcggccgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttaa cttcagcact aaagggcgga 600

aaccctctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg 660

tttgctcccc acgctttcgc gcctcagtgt cagttacaga ccagaaagtc gccttcgcca 720

ctggtgttcc tccatatctc tacgcatttc accgctacac atggaattcc actttcctct 780

tctgcactca agtctcccag tttccaatga ccctccacgg ttgagccgtg ggctttcaca 840

tcagacttaa gaaaccacct gcgcgcgctt tacgcccaat aattccggat aacgcttgcc 900

acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ttaggtaccg 960

tcaaggtgcc agcttattca actagcactt gttcttccct aacaacagag ttttacgacc 1020

cgaaagcctt catcactcac gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat 1080

tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca 1140

ccctctcagg tcggctacgc atcgttgcct tggtgagccg ttacctcacc aactagctaa 1200

tgcgacgcgg gtccatccat aagtgacagc cgaagccgcc tttcaatttc gaaccatgcg 1260

gttcaaaatg ttatccggta ttagccccgg tttcccggag ttatcccagt cttatgggca 1320

ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc gctaacttca taagagcaag ctcttaa 1377

<210> 5

<211> 1382

<212> DNA

<213> 微小杆菌 PR-DN5(Exiguobacterium sp.PR-DN5)

<400> 5

ccggcttcgg gtgttgcaaa ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa gacccgggaa 60

cgtattcacc gcagtatgct gacctgcgat tactagcgat tccgacttca tgcaggcgag 120

ttgcagcctg caatccgaac tgggaacggc tttatgggat tggctccacc tcgcggtctc 180

gctgcccttt gtaccgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc aactcataag gggcatgatg 240

atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtctcccta gagtgcccaa 300

ctgaatgctg gcaactaagg ataggggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 360

acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcacca ttgtccccga agggaaaact 420

tgatctctca agcggtcaat gggatgtcaa gagttggtaa ggttcttcgc gttgcttcga 480

attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gtccccgtca attcctttga gtttcagcct 540

tgcggccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc ttcagcactg aggggcggaa 600

acccccccaa cactagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660

ttgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc agttacagac caaagagtcg ccttcgccac 720

tggtgttcct ccacatctct acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctcttctctt 780

ctgtactcaa gccttccagt ttccaatggc cctccccggt tgagccgggg gctttcacat 840

cagacttaaa aggccgcctg cgcgcgcttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca 900

cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctcgt aaggtaccgt 960

caaggtacga gcattccctc tcgtacgtgt tcttccctta caacagagtt ttacgatccg 1020

aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt tcgtccattg tggaagattc 1080

cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc 1140

ctctcaggtc ggctatgcat cgtcgccttg gtgggccgtt accccaccaa ctagctaatg 1200

caccgcaagg ccatctcaag gtgacgccgg agcgcctttc atcagcggac catgcggtcc 1260

gatgaactat ccggtattag ctccgatttc tcggagttat cccaatcctt gaggcaggtt 1320

ccttacgtgt tactcacccg tccgccgctc attccgctgc cttccctccg aagagttccg 1380

tc 1382

Claims

1.一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基，其特征在于：所述复合菌培养基的成分为：可溶性淀粉5-15g/L、玉米淀粉5-15g/L、葡萄糖3-10g/L、甘油1-5g/L、尿素2-6g/L、(NH₄)₂SO₄ 1-3g/L、NaCl 1-5g/L、K₂HPO₄ 0.5-2g/L以及KH₂PO₄ 2-4g/L。

2.根据权利要求1所述的一种培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基，其特征在于：所述复合菌培养基pH为 6.0-7.2。

3.如权利要求1-2所述的培养处理羟乙基纤维素生产外排废水所用复合菌的培养基在制备复合菌剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（3）复合菌剂制备方法：将发酵获得的菌液在5000r/min离心机离心15min后，去除上清液，加入生理盐水在5000r/min离心机离心15min，去除上清液，获得菌泥，加入生理盐水配制成菌液悬浊液，再加入添加剂，制备成复合菌剂。

5.根据权利要求4所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中混合菌液的体积为LB培养基体积的1-5%；所述混合菌种液的体积为复合菌培养基的2-10%。

6.根据权利要求4所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5；五种菌株分别于2019年4月15日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月20日、2019年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），PR-DN1的保藏编号为CCTCC NO:M2019255，PR-DN2的保藏编号为CCTCC NO: M2019372，PR-DN3的保藏编号为CCTCC NO:M2019373，PR-DN4的保藏编号为CCTCC NO:M2019374、PR-DN5的保藏编号为CCTCC NO:M2019413。

7.根据权利要求4所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中气单胞菌（Aeromonas sp.）PR-DN1、产碱杆菌（Alcaligenes sp.）PR-DN2、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PR-DN3、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.）PR-DN4、微小杆菌（Exiguobacterium sp.）PR-DN5五种菌种的活菌数比例为1-10：1-5：1-5：1-10：1-5。

8.根据权利要求4所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中复合菌剂的总活菌数为1×10⁹cfu/g-4×10⁹cfu/g；所述步骤（3）制成的复合菌剂中，五种菌体的体积之和占复合菌剂总体积的20%-50%。

9.根据权利要求4所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中在LB培养基中进行培养的条件为：30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h；所述步骤（2）中在LB培养基中进行培养的条件为：30℃、180r/min条件下摇床培养24-28h；所述步骤（2）中在复合菌培养基中进行培养的条件为：30℃、溶解氧40%-60%、pH为7.0条件下发酵罐培养36-60h。

10.根据权利要求4所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中添加剂为营养剂、保藏助剂、载体的混合物；所述步骤（2）中出罐时，发酵液中活菌数达到1×10¹⁰-2×10¹¹cfu/mL；所述步骤（2）中加入的消泡剂体积为2/10000发酵液体积；所述步骤（2）中，复合菌培养基的体积为发酵罐体积的75%，发酵过程通入的气体为空气。