CN109182193B - 微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物菌剂及其制备方法和应用，涉及微生物菌剂技术领域。该微生物菌剂包括微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌；混合菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉。该微生物菌剂通过细菌‑真菌联合、多菌种的协同配合作用，使其具有菌种活性高、处理废水、废气或废物的多种功效和处理效率高等优点。此外，本发明还提供了微生物菌剂的制备方法，采用双层固定(初步固定和二次固定结合)微生物菌液的方法，提高了微生物菌剂的稳定性。该制备方法操作简单，便于工业推广应用。

Description

微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体而言，涉及一种微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着科学技术和生产工艺的不断发展，大量的人工合成的化合物进入环境中，由于其结构的复杂性和生物陌生性，在短时间内很难被微生物分解利用。对这类污染物具有高效降解能力的微生物在自然环境中的种类和数量都较少，在种间竞争中处于劣势。生物强化技术可以充分发挥微生物的潜力，改善难降解有机物的生物处理效果。该技术具有高效、稳定和节省投资的特点，已成为废物生物治理技术的一种发展趋势，构建高效微生物菌剂是这项技术的关键，利用微生物菌剂治理废水、废气和废物，将大大提高污染物的处理效果。
微生物菌剂是指目标微生物(一种或几种)经过工业化生产扩繁后，利用多孔的物质作为吸附剂，吸附菌体的发酵产物加工制成的活菌制剂。此类微生物菌剂广泛应用于农业、养殖业、垃圾处理和水体污染等方面。
目前国内的主要研究仍集中在高效菌种的选择和培育上，在微生物菌剂的推广和开发应用上仍不够完善。虽然有很多微生物菌剂相关的研究成果和专利，但产品种类仍十分分散，产品处理效果受很多因素影响，效果单一，效果不稳定，产品推广率仍不高。
有鉴于此，特提出本发明，期望能够解决上述问题中的至少一个。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种微生物菌剂，通过微生物菌剂中各个菌种的协同配合作用，使微生物菌剂具有菌种活性高、处理废水、废气或废物的多种功效和处理效率高等优点。
本发明的第二目的在于提供一种微生物菌剂的制备方法，采用双层固定(初步固定和二次固定结合)微生物菌液的方法制备微生物菌剂，提高微生物菌剂的稳定性，该制备方法操作简单，便于工业推广应用。
本发明的第三目的在于提供微生物菌剂在污染物处理中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种微生物菌剂，包括微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌；
所述混合菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的活菌数配比为(25-10):(30-14):(18-7):(20-6)。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，混合菌中酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的活菌数配比为(15-7):(8-5):(7-3):(9-1):(7-2):(8-2)。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，微生物菌剂的剂型包括液体菌剂和固体菌剂，优选液体菌剂。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，液体菌剂中的微白褐链霉菌CGMCCNo.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的总活菌浓度为2×108-3.5×108CFU/mL。
第二方面，本发明提供了一种微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898和极长链霉菌的各自发酵产物与初步固定的混合菌发酵产物按配比混合后，进行二次固定，得到微生物菌剂。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，微生物菌剂的制备方法包括：将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的各自发酵产物按配比混合后，用固定化载体材料进行初步固定，得到初步固定的混合菌发酵产物。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，初步固定和二次固定所用的固定化载体材料均独立地包括天然高分子多糖和合成的高分子化合物；
优选地，所述天然高分子多糖包括海藻酸钠、壳聚糖或琼脂中的至少一种，优选海藻酸钠和壳聚糖；
优选地，所述合成的高分子化合物包括聚乙烯醇、聚丙烯酞胺或聚乙二醇中的至少一种，优选聚乙烯醇。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的各自发酵液按照配比混合，得到混合菌发酵液；
(b)按混合菌发酵液体积的12-18％加入聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液的混合溶液，进行初步固定，得到初步固定的混合菌发酵液；
(c)将初步固定的混合菌发酵液与微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌的各自发酵液按照配比混合，得到混合液；
(d)将步骤(c)得到的混合液与等体积的壳聚糖溶液混合均匀，进行二次固定，得到微生物液体菌剂。
第三方面，本发明提供了微生物菌剂在环境修复中的应用；
优选地，环境修复包括污水处理、土壤修复或生活垃圾处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的微生物菌剂，包括微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌。其中微白褐链霉菌CGMCC No.13717和淡紫拟青霉CGMCC No.13898具有繁殖能力强和活性高的优点；此外，混合菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉，混合菌包含的菌种多样，具有多种功效。通过细菌-真菌联合、多菌种的协同配合作用，使微生物菌剂具有菌种活性高、处理废水、废气或废物的多种功效和处理效率高等优点。
(2)本发明提供的微生物菌剂的制备方法，采用双层固定(初步固定和二次固定结合)微生物菌液的方法制备微生物菌剂，可以使微生物菌液更好地固定在载体材料中，提高微生物菌剂的稳定性。该制备方法操作简单，便于工业推广应用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
根据本发明的第一个方面，提供了一种微生物菌剂包括微白褐链霉菌CGMCCNo.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌；混合菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉。
微白褐链霉菌(Streptomyces albidofuscus)属于革兰氏阳性细菌，菌丝体发达，分化成基内菌丝和气生菌丝；气生菌丝成熟后发育成孢子丝，可裂生大量分生孢子进行散播、繁殖；具有较强的淀粉和蛋白质水解能力(尤其是角蛋白)。本发明公开的是微白褐链霉菌CGMCC No.13717。
微白褐链霉菌CGMCC No.13717指在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏的编号为CGMCC No.13717，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2017年3月1日。
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)也称淡紫紫孢菌，属于内寄生性真菌，能够寄生于卵，也能侵染幼虫和雌虫，可明显减轻多种作物根结线虫、胞囊线虫和茎线虫等植物线虫病的危害；也能促进难溶磷酸盐的溶解，还能促进许多化学聚合物(如农药、制革废水等)的分解。本发明公开的是淡紫拟青霉CGMCC No.13898。
淡紫拟青霉CGMCC No.13898指在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏的编号为CGMCC No.13898，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2017年5月31日。
极长链霉菌(Streptomyces longissimus)属于革兰氏阳性细菌，严格好氧，形成气生菌丝和基内菌丝，孢子成链。淀粉水解能力强，也能促进角蛋白和纤维素的降解。
酵母菌(Saccharomyces sp.)是单细胞真核微生物，细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。酵母菌的功能较多，如热带假丝酵母氧化烃类能力强，解脂假丝酵母分解脂肪和蛋白的能力强。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性菌。枯草芽孢杆菌能够改善有害蓝藻泛溢造成的水质浑浊问题，具有很强的净化水质功能；还具有较强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，可以促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌。它能分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质；具有较强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分；也能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，可以抑制致病菌的生长繁殖。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)属于革兰氏阳性芽孢杆菌。它可降解土壤及果实中的残留农药，减少亚硝酸盐含量和活化土壤中难溶的磷、钾等潜在养分，改善农产品品质，提高作物产量；还能诱导作物产生超氧化物歧化酶、加多酚氧化酶和过氧化物酶，提高作物抗逆性。
侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)为革兰氏染色阴性，菌体呈细长的杆状。它具有解磷、解钾和降解一些残留农药的功能，可以改良土壤，提高作物产量；能够降解制革厂废水中的植物单宁，生物降解苯酚和甲苯，生物吸附水溶液中的有毒金属，以及对污水系统中的重金属解毒等。
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)能产生多种具有生物活性的酶系，如纤维素酶、几丁质酶和木聚糖酶等，可以直接加入到有机肥料、生物菌肥和冲施肥等肥料中；在植物病理生物防治中具有保护和治疗双重功效，可有效防治土传性真菌病害，在植物病理生物防治中具有重要的作用。
本发明公开的微生物菌剂中，微白褐链霉菌CGMCC No.13717和淡紫拟青霉CGMCCNo.13898具有繁殖能力强和活性高的优点；此外，混合菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉，混合菌包含的菌种多样，具有多种功效。通过微生物菌剂中各个菌种的协同配合作用，使微生物菌剂具有菌种活性高、处理废水、废气或废物的多种功效和处理效率高等优点。
在一种优选的实施方式中，微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCCNo.13898、极长链霉菌和混合菌的活菌数配比为((25-10):(30-14):(18-7):(20-6)。
微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的活菌数配比典型但非限制性的例如为25:14:18:6、10:30:7:20、22:16:16:17、19:18:14:14、16:22:12:12或13:26:15:9。
优选微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的活菌数配比，可以使微生物菌剂中各菌种的配比更加合理，能够更好的发挥协同配合作用，提高微生物菌剂的活性。
在一种优选的实施方式中，混合菌中酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的活菌数配比为(15-7):(8-5):(7-3):(9-1):(7-2):(8-2)。
酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的活菌数配比典型但非限制性的例如为15:5:7:1:7:2、7:8:3:9:2:8、12:6:6:3:6:3、10:7:5:5:5:4、8:6:4:3:3:5或9:6:4:2:4:3。
优选酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的活菌数配比，可以使微生物菌剂中混合菌中的各菌种的配比更加合理，能够更好的发挥各菌种的协同配合作用，提高微生物菌剂的活性。
在一种优选的实施方式中，微生物菌剂的剂型包括液体菌剂和固体菌剂，优选液体菌剂。
本发明公开的微生物菌剂可以制备成液体剂型或固体剂型，可以根据应用的环境选择合适的剂型，制备微生物菌剂的方法可以选择本领域常规的技术手段，在此处不作限定，能发挥微生物菌剂的功效即可。优选液体菌剂可以使微生物液体菌剂中各菌种的菌种的活性更高，更好的发挥微生物菌剂的作用。
在一种优选的实施方式中，液体菌剂中的微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的总活菌浓度为2×108-3.5×108CFU/mL。
微生物菌剂中总活菌浓度典型但非限制性的例如为2×108CFU/mL、2.3×108CFU/mL、2.6×108CFU/mL、3×108CFU/mL或3.5×108CFU/mL。
微生物菌剂中活菌浓度过高，会造成同种或异种菌种之间的竞争加剧，不利于菌剂的存储和保持高活性；活菌数浓度过低会降低微生物菌剂的使用效果。优选微生物液体菌剂中的总活菌浓度可以使微生物菌剂保持更好的活性，使其更好地发挥作用。
根据本发明的第二个方面，提供了一种微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898和极长链霉菌的各自发酵产物与初步固定的混合菌发酵产物按配比混合后，进行二次固定，得到微生物菌剂。
固定化微生物技术克服了生物细胞太小，与溶液分离较难，易造成二次污染的缺点。微生物的固定化方法包括吸附法、共价结合法、包埋法和交联法，其中以包埋法最为常用。本发明公开的微生物菌剂的制备方法中的初步固定和二次固定可以采用本领域常规的固定化微生物技术，比如常用的包埋法，也可以采用其它的固定化方法，发酵产物可以采用本领域常规的技术获得，能保证微生物菌剂的活性和功效等优点即可。
本发明提供的微生物菌剂的制备方法，采用双层固定(初步固定和二次固定结合)微生物菌液的方法制备微生物菌剂，可以使微生物菌液更好地固定在载体材料中，提高微生物菌剂的稳定性。该制备方法操作简单，便于工业推广应用。
在一种优选的实施方式中，微生物菌剂的制备方法包括将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的各自发酵产物按配比混合后，用固定化载体材料进行初步固定，得到初步固定的混合菌发酵产物。
初步固定将各菌种的发酵产物固定，可以使被固定化的菌种具有活菌浓度更高，稳定性更好，对有毒物质和环境变化承受适应能力较强等优点。再结合二次固定，从而使制备得到的微生物菌剂的稳定性更强。
在一种优选的实施方式中，初步固定和二次固定所用的固定化载体材料均独立地包括天然高分子多糖和合成的高分子化合物。
天然高分子多糖具有固定化成形方便，对微生物毒性小及固定化密度高等优点，但抗微生物分解能力差，机械强度较低，并且使用寿命短，通常为2-3个月。天然高分子多糖包括但不限于海藻酸钠、壳聚糖或琼脂，优选海藻酸钠和壳聚糖。
合成的高分子化合物具有抗微生物分解性能强、机械强度高、化学稳定性好等优点，但在固定过程中，聚合物载体网络的形成条件比较剧烈，对微生物损害较大，而且成形多样结构可控性。合成的高分子化合物包括但不限于聚乙烯醇、聚丙烯酞胺或聚乙二醇，优选聚乙烯醇。
优选固定化载体材料为天然高分子多糖和合成的高分子化合物，这两类固定化载体材料是包埋法常用的载体材料。天然高分子多糖和合成的高分子化合物各自有其优点和缺点，进一步优选固定化载体材料可以更好发挥其优势，减少其缺点带来的不良影响，使初步固定和二次固定的作用更好，制备得到的微生物菌剂的稳定性和活性更高。
在一种优选的实施方式中，微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的各自发酵液按照配比混合，得到混合菌发酵液；
(b)按混合菌发酵液体积的12-18％加入聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液的混合溶液，进行初步固定，得到初步固定的混合菌发酵液；
聚乙烯醇溶液的浓度为2-4.5wt％；海藻酸钠溶液的浓度为0.8-2.5wt％；
聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液的体积比为(0.8-1.2):(1.2-0.8)；
(c)将初步固定的混合菌发酵液与微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌的各自发酵液按照配比混合，得到混合液；
(d)将步骤(c)得到的混合液与等体积的壳聚糖溶液混合均匀，进行二次固定，得到微生物液体菌剂；
壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解于体积浓度为0.8-1％的醋酸中制备得到；
壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为5-10mg/mL。
聚乙烯醇溶液的浓度典型但非限制性的例如为2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％或4.5wt％。
海藻酸钠溶液的浓度典型但非限制性的例如为0.8wt％、1.2wt％、1.6wt％、2wt％、2.2wt％或2.5wt％。
聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液的体积比例如可以为0.8:1.2、0.9:1.2、1:1.2、1.1:1.2、1:1或1.2:0.8。
壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度典型但非限制性的例如为5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL或10mg/mL。
通过优选液体微生物菌剂制备过程中的初步固定和二次固定的方法和条件，可以使制备得到的微生物菌剂的稳定性更好，对有毒物质和环境变化承受适应能力更强。
优选地实施方式中，一种典型的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)将保存的微白褐链霉菌、淡紫拟青霉和极长链霉菌分别划线接种到高氏培养基中，置于培养箱28.5℃恒温培养5天；
制备种子液：NaCl(0.5g)、FeSO4·7H2O(0.01g)和无菌水(1L)，分装于250mL的锥形瓶中，制得每瓶180mL的大米培养液，灭菌待用；分别将高氏培养基上的微白褐链霉菌、淡紫拟青霉和极长链霉菌菌饼接种于大米培养液中，于27.5℃，180rpm摇培4天，制得种子液；
制备发酵液：分别吸取5mL的种子液于各自的大米培养液中，培养基初始pH值为6-8，发酵温度为27.5℃，振荡频率为180r/min，发酵时间为7天，制得发酵液；
(b)分别将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉发酵液按照配比混合后，按发酵液体积的16％加入3wt％的聚乙烯醇(PVA)溶液和1.6wt％的海藻酸钠(SA)溶液的混合溶液中，得到初步固定的混合菌发酵液；
(c)分别将微白褐链霉菌、淡紫拟青霉、极长链霉菌的各自发酵液和经初步固定的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、哈茨木霉的混合发酵液按照配比混合，得到混合液；
(d)将壳聚糖溶解于体积浓度为1％的醋酸中，配制成壳聚糖浓度为7mg/mL的壳聚糖溶液，取等体积的步骤(3)混合液，与壳聚糖溶液混合均匀，得到微生物液体菌剂；
其中，高氏培养基组分包括：可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO31g、K2HPO4·3H2O0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂20g和去离子水1000mL，调节pH至7.4～7.6；
聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液的体积比1:1.2。
需要说明的是，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的发酵液可以采用本领域常规的技术及条件获得，在此处对发酵液的制备方法不作限定。
该典型的微生物菌剂的制备方法，优选了制备方法的步骤和条件，缩短了制备方法的时间，便于工业推广应用，而且使制备得到的微生物菌剂的优点更加突出。
根据本发明的第三个方面，提供了微生物菌剂在环境修复中的应用；
优选地，所述环境修复包括污水处理、土壤修复或生活垃圾处理。
环境修复是指对被污染的环境采取物理、化学或生物学技术措施，使存在于环境中的污染物质浓度减少或毒性降低或完全无害化。环境修复包括但不限于污水处理、土壤修复或生活垃圾处理。本发明提供的微生物菌剂具有降解有毒有害物质的作用、修复土壤及预防植物病虫害等多种功效，可以应用在环境修复中。
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例对本发明方法和效果做进一步详细的说明。本发明涉及的各原料均可通过商购获取。
实施例1
一种微生物菌剂，包括微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCCNo.13898、极长链霉菌和混合菌；混合菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉；
其中，微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的活菌数配比为25:14:18:6；
混合菌中酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的活菌数配比为15:5:7:1:7:2；
微生物菌剂的总活菌浓度约为2×108CFU/mL。
上述微生物菌剂的优选的制备方法，包括以下步骤：
(1)将保存的微白褐链霉菌、淡紫拟青霉和极长链霉菌分别划线接种到高氏培养基中，置于培养箱28.5℃恒温培养5天；
制备种子液：NaCl(0.5g)、FeSO4·7H2O(0.01g)和无菌水(1L)，分装于250mL的锥形瓶中，制得每瓶180mL的大米培养液，灭菌待用；分别将高氏培养基上的微白褐链霉菌、淡紫拟青霉和极长链霉菌菌饼接种于大米培养液中，于27.5℃，180rpm摇培4天，制得种子液；
制备发酵液：分别吸取5mL的种子液于各自的大米培养液中，培养基初始pH值为6-8，发酵温度为27.5℃，振荡频率为180r/min，发酵时间为7天，制得发酵液；
(2)分别将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉发酵液按照配比混合后，按发酵液体积的12％加入2wt％的聚乙烯醇溶液和0.8wt％的海藻酸钠溶液的混合溶液中，得到初步固定的混合菌；
(3)分别将微白褐链霉菌、淡紫拟青霉、极长链霉菌的各自发酵液和经初步固定的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、哈茨木霉的混合发酵液按照配比混合，得到混合液；
(4)将壳聚糖溶解于体积浓度为0.8％的醋酸中，配制成壳聚糖浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液，取等体积的步骤(3)混合液，与壳聚糖溶液混合均匀，得到微生物液体菌剂；
其中，聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液的体积比0.8:1.2。
实施例2
一种微生物菌剂，包括微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCCNo.13898、极长链霉菌和混合菌；混合菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉；
其中，微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的活菌数配比为10:30:7:20；
混合菌中酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的活菌数配比为7:8:3:9:2:8；
微生物菌剂的总活菌浓度约为3.5×108CFU/mL。
上述微生物菌剂的优选的制备方法，包括以下步骤：
(1)将保存的微白褐链霉菌、淡紫拟青霉和极长链霉菌分别划线接种到高氏培养基中，置于培养箱28.5℃恒温培养5天；
制备种子液：NaCl(0.5g)、FeSO4·7H2O(0.01g)和无菌水(1L)，分装于250mL的锥形瓶中，制得每瓶180mL的大米培养液，灭菌待用；分别将高氏培养基上的微白褐链霉菌、淡紫拟青霉和极长链霉菌菌饼接种于大米培养液中，于27.5℃，180rpm摇培4天，制得种子液；
制备发酵液：分别吸取5mL的种子液于各自的大米培养液中，培养基初始pH值为6-8，发酵温度为27.5℃，振荡频率为180r/min，发酵时间为7天，制得发酵液；
(2)分别将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉发酵液按照配比混合后，按发酵液体积的18％加入4.5wt％的聚乙烯醇溶液和2.5wt％的海藻酸钠溶液的混合溶液中，得到初步固定的混合菌；
(3)分别将微白褐链霉菌、淡紫拟青霉、极长链霉菌的各自发酵液和经初步固定的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、哈茨木霉的混合发酵液按照配比混合，得到混合液；
(4)将壳聚糖溶解于体积浓度为1％的醋酸中，配制成壳聚糖浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液，取等体积的步骤(3)混合液，与壳聚糖溶液混合均匀，得到微生物液体菌剂；
其中，聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液的体积比1.2:0.8。
实施例3
一种微生物菌剂，包括微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCCNo.13898、极长链霉菌和混合菌；混合菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉；
其中，微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的活菌数配比为20:24:12:15；
混合菌中酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的活菌数配比为9:6:4:2:4:4；
微生物菌剂的总活菌浓度约为2.8×108CFU/mL。
上述微生物菌剂的优选的制备方法，包括以下步骤：
(1)将保存的微白褐链霉菌、淡紫拟青霉和极长链霉菌分别划线接种到高氏培养基中，置于培养箱28.5℃恒温培养5天；
制备种子液：NaCl(0.5g)、FeSO4·7H2O(0.01g)和无菌水(1L)，分装于250mL的锥形瓶中，制得每瓶180mL的大米培养液，灭菌待用；分别将高氏培养基上的微白褐链霉菌、淡紫拟青霉和极长链霉菌菌饼接种于大米培养液中，于27.5℃，180rpm摇培4天，制得种子液；
制备发酵液：分别吸取5mL的种子液于各自的大米培养液中，培养基初始pH值为6-8，发酵温度为27.5℃，振荡频率为180r/min，发酵时间为7天，制得发酵液；
(2)分别将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉发酵液按照配比混合后，按发酵液体积的16％加入3wt％的聚乙烯醇溶液和1.6wt％的海藻酸钠溶液的混合溶液中，得到初步固定的混合菌；
(3)分别将微白褐链霉菌、淡紫拟青霉、极长链霉菌的各自发酵液和经初步固定的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、哈茨木霉的混合发酵液按照配比混合，得到混合液；
(4)将壳聚糖溶解于体积浓度为1％的醋酸中，配制成壳聚糖浓度为7mg/mL的壳聚糖溶液，取等体积的步骤(3)混合液，与壳聚糖溶液混合均匀，得到微生物液体菌剂；
其中，聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液的体积比1:1.2。
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于：微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的活菌数配比为30:10:20:4。
实施例5
本实施例与实施例3的区别在于：混合菌中酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的活菌数配比为17:3:9:0.5:10:1。
实施例6
本实施例与实施例3的区别在于：步骤(2)中用3wt％聚乙二醇溶液和1.6wt％的聚丙烯酞胺溶液分别替代聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液。
实施例7
本实施例与实施例3的区别在于：步骤(4)中用浓度为7mg/mL海藻酸钠溶液替代壳聚糖溶液。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于：缺少微白褐链霉菌CGMCC No.13717，缺少与该菌种相关的活菌数配比比例和发酵、固定的步骤。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于：缺少淡紫拟青霉CGMCC No.13898，缺少与该菌种相关的活菌数配比比例和发酵、固定的步骤。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于：缺少极长链霉菌，缺少与该菌种相关的活菌数配比比例和发酵、固定的步骤。
对比例4
本对比例与实施例3的区别在于：缺少全部的混合菌，缺少与全部的混合菌相关的活菌数配比比例和发酵、固定的步骤。
对比例5
本对比例与实施例3的区别在于：缺少混合菌中的酵母菌，缺少与该菌种相关的活菌数配比比例和发酵、固定的步骤。
对比例6
本对比例与实施例3的区别在于：缺少混合菌中的枯草芽孢杆菌，缺少与该菌种相关的活菌数配比比例和发酵、固定的步骤。
对比例7
本对比例与实施例3的区别在于：缺少混合菌中的地衣芽孢杆菌，缺少与该菌种相关的活菌数配比比例和发酵、固定的步骤。
对比例8
本对比例与实施例3的区别在于：缺少混合菌中的解淀粉芽孢杆菌，缺少与该菌种相关的活菌数配比比例和发酵、固定的步骤。
对比例9
本对比例与实施例3的区别在于：缺少混合菌中的侧孢短芽孢杆菌，缺少与该菌种相关的活菌数配比比例和发酵、固定的步骤。
对比例10
本对比例与实施例3的区别在于：缺少混合菌中的哈茨木霉，缺少与该菌种相关的活菌数配比比例和发酵、固定的步骤。
上述对比例1-10与实施例3相比，总活菌数不变，其中各菌种的活菌数配比不变。
对比例11
本对比例与实施例3的区别在于：制备方法中缺少初步固定的步骤，只进行一次固定。
对比例12
专利CN106947722A实施例1和实施例5，一种微生物菌剂，包括细长真杆菌(ATCC编号29143)、凝结芽孢杆菌(ATCC编号15949)、短乳杆菌(ATCC编号8287)、漠海威芽孢杆菌(ATCC编号51517)、毛霉菌(ATCC编号42423)、植物乳杆菌(ATCC编号14917)以及纤维弧菌(ATCC编号13127)，活菌数配比为5:3:1:2:2:1:5，总活菌数浓度为6×107CFU/mL。
为进一步验证上述实施例和对比例的效果，特设以下实验例。
实验例1污水处理实验
对实施例1-7和对比例1-12提供的微生物菌剂对污水处理效果进行评价。具体操作和结果如下：
采集生活污水，作为待处理的生活污水样品，并对其中的化学需氧量(COD)、氨氮含量(NH3-N)、生化需氧量(BOD5)和悬浮物(SS)的含量进行了测定，上述各项指标的测定均采用本领域常规技术手段，记录污水样品的各指标初始值于表1。
分别将实施例1-7、对比例1-12的微生物菌剂1L投入到相同体积的污水中作为实验组，等量无菌蒸馏水投入到相同体积的污水中作为对照组，温度35℃，连续搅拌，测定5天时实验组和对照组中的COD、NH3-N、BOD5和SS的值，计算各指标的清除率，清除率＝(1-终点值/初始值)×100％，结果见表2。
表1污水各指标初始值
Figure BDA0001812625940000171
表2污水中各指标清除率
Figure BDA0001812625940000172
Figure BDA0001812625940000181
从表2的数据可以看出，对照组中显示出污水的自净能力很差。实施例1-7对污水中的COD、NH3-N、BOD5和SS的清除率均达到了80％以上，证明了本发明提供的微生物菌剂在污水处理中有很好的效果。
实施例3是本发明的一个优选实施方式，实施例4、5与实施例3的区别是微生物菌剂中的活菌数配比不同，实施例4和5的活菌数配比不是优选地实施方式；实施例6、7与实施例3的区别是制备方法中使用的固定化材料不同。实施例3测定的污水中各项指标的清除率都比实施例4-7的结果更好，这表明微生物菌剂中活菌数配比和制备方法中使用的固定化材料会影响微生物菌剂处理污水的效果。
对比例1-4与实施例3的区别主要是分别缺少一种菌种和全部混合菌种，对比例5-10与实施例3的区别主要是分别缺少混合菌种中的一种，对比例11与实施例3的区别主要是制备方法中缺少初步固定的步骤，只进行一次固定。实施例3测定的污水中各项指标的清除率都比对比例1-11的结果好，这表明微生物菌剂中各个菌种的协同配合作用和双层固定的制备方法对微生物菌剂的活性和稳定性有十分重要的作用。
此外，实施例3测定的污水中各项指标的清除率都比对比例12的结果好，对比例12是专利CN106947722A公开的一种微生物菌剂，这表明本发明提供的微生物菌剂的对污水处理的效果优于对比例12提供的微生物菌剂。
实验例2土壤修复实验
对实施例1-7和对比例1-11提供的微生物菌剂对土壤修复效果进行评价。具体操作和结果如下：
选择实验地点，实验地均为砂壤土，并对其中的有机质、速效磷和速效钾的含量进行了测定，上述各项指标的测定均采用本领域常规技术手段，记录土壤的各理化性状指标的初始值于表3。
分别将实施例1-7、对比例1-11的微生物菌剂1L均匀喷洒到1m2的实验地土壤中作为实验组，等量无菌蒸馏水均匀喷洒到1m2的试验地土壤中作为对照组，5天后测定土壤中有机质、速效磷和速效钾的含量，计算各指标的增长率，增长率＝(终点值-初始值)/初始值×100％，结果见表4。
表3土壤中各理化指标
土壤 有机质(g/kg) 速效磷(mg/kg) 速效钾(mg/kg)
初始值 25 8 120
表4土壤中各指标增长率
Figure BDA0001812625940000191
/>
Figure BDA0001812625940000201
从表4的数据可以看出，对照组中显示出试验土壤中有机质、速效磷和速效钾的含量的增长率很低。实施例1-7对土壤中的有机质、速效磷和速效钾的增长率均分别达到了70％、75％和105％以上，证明了本发明提供的微生物菌剂在土壤修复中有很好的效果。
实施例3是本发明的一个优选实施方式，实施例4、5与实施例3的区别是微生物菌剂中的活菌数配比不同，实施例4和5的活菌数配比不是优选地实施方式；实施例6、7与实施例3的区别是制备方法中使用的固定化材料不同。实施例3测定的土壤中各项指标的增长率都比实施例4-7的结果更好，这表明微生物菌剂中活菌数配比和制备方法中使用的固定化材料会影响微生物菌剂在土壤修复中的使用效果。
实验例3生活垃圾处理实验
对实施例1-7和对比例1-11提供的微生物菌剂对生活垃圾处理效果进行评价。具体操作和结果如下：
收集住宅小区的生活垃圾，经分拣，去除砖石、塑料、金属、玻璃和纸制品等可回收利用物，剩余基本为果皮、菜叶、厨馀垃圾、纸屑、树叶等物质，测得有机物含量为60％，含水率55％，体积为1.2m3；
将10kg上述垃圾粉碎后装入具有自动通风、渗滤液回喷、管道排气和可翻动的矩形垃圾发酵仓，按垃圾总重的3％接入上述实施例1-7和对比例1-11的微生物菌剂；混合均匀后，间歇通气，风量为0.115m3/min，风压为300Pa，每隔35min通气5min，进行发酵。通气发酵8天时，发酵垃圾形成无特殊气味的黑褐色物质，可视为主发酵完成，测定此时的有机物含量、体积和重量，计算减少率，减少率＝(初始值-终点值)/初始值×100％，记录在表6。
表5垃圾各指标初始值
垃圾 重量(kg) 体积(m3) 有机物(％)
初始值 10 1.2 60
表6垃圾各指标减少率
Figure BDA0001812625940000211
Figure BDA0001812625940000221
从表6的数据可以看出，实施例1-7实验组中对生活垃圾的重量、体积和有机物检测的各指标的减少率均分别达到了75％、80％和50％以上，证明了本发明提供的微生物菌剂在生活垃圾处理应用中有很好的效果。
实施例3是本发明的一个优选实施方式，实施例4、5与实施例3的区别是微生物菌剂中的活菌数配比不同，实施例4和5的活菌数配比不是优选地实施方式；实施例6、7与实施例3的区别是制备方法中使用的固定化材料不同。实施例3测定的生活垃圾中各项指标的减少率都比实施例4-7的结果更好，这表明微生物菌剂中活菌数配比和制备方法中使用的固定化材料会影响微生物菌剂在生活垃圾处理中的使用效果。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.微生物菌剂在环境修复中的应用，其特征在于，所述微生物菌剂包括微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌；
所述微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的活菌数之比为（25-10）:（30-14）:（18-7）:（20-6）；
所述混合菌为用固定化载体材料进行初步固定得到；
所述混合菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉；
所述混合菌中酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的活菌数配比为（15-7）:（8-5）:（7-3）:（9-1）:（7-2）:（8-2）；
所述环境修复包括污水处理、土壤修复或生活垃圾处理中的至少一种；
所述污水处理为清除污水中COD、NH3-N、BOD5和SS；
所述土壤修复为提高土壤中有机质、速效磷和速效钾的含量；
所述生活垃圾处理为减少生活垃圾的重量、体积和有机物。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂的剂型包括液体菌剂或固体菌剂。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，所述液体菌剂中的微白褐链霉菌CGMCCNo.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898、极长链霉菌和混合菌的总活菌浓度为2×108-3.5×108CFU/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
将微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCC No.13898和极长链霉菌的各自发酵产物与初步固定的混合菌发酵产物按配比混合后，进行二次固定，得到微生物菌剂。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的各自发酵产物按配比混合后，用固定化载体材料进行初步固定，得到初步固定的混合菌发酵产物。
6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，初步固定和二次固定所用的固定化载体材料均独立地包括天然高分子多糖和合成的高分子化合物。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，所述天然高分子多糖包括海藻酸钠、壳聚糖或琼脂中的至少一种。
8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，所述天然高分子多糖为海藻酸钠和壳聚糖。
9.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，所述合成的高分子化合物包括聚乙烯醇、聚丙烯酞胺或聚乙二醇中的至少一种。
10.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（a）将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和哈茨木霉的各自发酵液按照配比混合，得到混合菌发酵液；
（b）按混合菌发酵液体积的12%-18%加入聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液的混合溶液，进行初步固定，得到初步固定的混合菌发酵液；
聚乙烯醇溶液的浓度为2-4.5wt%；海藻酸钠溶液的浓度为0.8-2.5wt%；
聚乙烯醇溶液和海藻酸钠溶液的体积比为（0.8-1.2）:（1.2-0.8）；
（c）将初步固定的混合菌发酵液与微白褐链霉菌CGMCC No.13717、淡紫拟青霉CGMCCNo.13898、极长链霉菌的各自发酵液按照配比混合，得到混合液；
（d）将步骤（c）得到的混合液与等体积的壳聚糖溶液混合均匀，进行二次固定，得到微生物液体菌剂；
壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解于体积浓度为0.8-1%的醋酸溶液中得到；
壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为5-10mg/mL。
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