CN110656071A - 一种高效降解dmf的惠氏副球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及污水处理技术领域，特别是一种高效降解DMF的惠氏副球菌及其应用。该菌株代码为YJY19‑03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17359。该高效降解DMF功能的菌剂投入到生化系统中，可以有效耐受高负荷或抑制有害物质的冲击，能够利用生化系统中的DMF作为唯一碳源，对DMF进行彻底化、无害化降解处理，保证生化系统正常运行，同时，避免采用物理化学法处理成本高、造成二次污染等缺点，经过处理后的污水达到综合池排放标准，对操作人员无副作用。

Description

一种高效降解DMF的惠氏副球菌及其应用

技术领域

本发明涉及污水处理技术领域，特别是一种高效降解DMF的惠氏副球菌及其应用。

背景技术

DMF(N,N-二甲基甲酰胺)因化学性质稳定、沸点高、性能优良，能与水及多数有机溶剂以任意比例互溶，故有“万能溶剂”之称，大量应用于农药、制药、制革、石油化工等生产行业。近年来，随着DMF工业废水排放量的日益增加，DMF污染日益严重。许多研究结论表明，DMF对动物和人类有一定的毒害作用，DMF能够影响细胞分化、导致肝损伤、引起胃痛、中枢神经和肾损害，而且具有生殖毒性和潜在的致癌性。因此，有效处理DMF废水非常重要。

目前，DMF废水的处理方法主要为物理化学法和化学法，包括蒸馏、萃取、吸附、高级氧化和碱性水解等。然而，这些方法存在成本高、易引起二次污染等缺点。相比之下，生物处理方法因其具有处理量大、成本低、条件温和、不产生二次污染等优点，成为DMF废水处理技术的研究点。Chromek等利用经过驯化后的藻类植物(Scenedesmusquadricauda)对人造革废水中DMF进行处理。王毅军等在实际工程中采用厌氧膨胀颗粒污泥反应器和新型高效厌氧膨胀颗粒污泥—生物接触氧化工艺处理含DMF的废水。Okazaki等利用DMF废水驯化培养活性污泥，从中分离得到杆状的DMF分解细菌Bacillus cereus D-1。Yoshie Hasegawa等则分离出以DMF为唯一碳氮源的菌株Alcaligenessp KUFA-1。然而，国内有关纯种微生物降解DMF的报道较少，相关高效稳定降解DMF的应用更是少之又少。

发明内容

含DMF工业废水不但对动物、人类有毒害作用，更影响生化装置处理能力，导致出水指标不合格，发明人针对现有技术缺陷，考虑到微生物技术处理废水的安全、环保、绿色的特点，对降解DMF的功能微生物菌种进行了研究，最终获得一种高效降解DMF的副球菌，并对其生长代谢及降解特性进行了研究，将其应用于工业DMF废水处理后，充分展现了生物处理法在工业废水处理过程中的优势，该菌株能够有效去除生化系统中的DMF，避免生化系统遭受冲击，保证出水指标达到排放标准。

该高效降解DMF的副球菌，菌株代码为YJY19-03，平板培养菌落呈圆形,隆起,表面光滑,湿润,边缘整齐,乳黄色，该菌株是从活性污泥中经过驯化筛选获得，发明人对其进行了16SrDNA测序，所测得的16SrDNA序列进行BLAST比对，在分子水平上确定为惠氏副球菌(Paracoccuswyeth)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17359。

驯化筛选的具体过程为：

从山东滨州博兴县清远环保石化废水预处理系统中取活性污泥10mL，转接于含200ppmDMF的液体无机盐培养基中，驯化时DMF浓度从200ppm开始，待DMF降解完成后转接5％至含有300ppmDMF的液体无机盐培养基中，依次逐步提高DMF浓度为400ppm、500ppm，每个梯度37℃、170rpm震荡培养7d；将500ppmDMF浓度下的驯化菌液取100μL涂布于含有同等浓度DMF的固体无机盐培养基上，平板在37℃倒置培养24-48h，将平板上分离的单菌进行多次画线培养，得到单菌落；将分离的单菌落活化后以5％接种量接入含有500ppmDMF的液体无机盐培养基中，37℃震荡培养72h，然后进行DMF含量测定，筛选出能够降解DMF的单菌株。挑取筛选出的具有降解DMF功能的菌株，分别转接至含有500ppmDMF的液体无机盐培养基中，37℃震荡培养72h，检测DMF降解情况；同时，改变接种量为1‰、5‰、1％的情况下，将DMF浓度也分别从200ppm到500ppm设置不同浓度，观察不同菌株降解能力，最终获得一个菌株，在每个浓度梯度下均能够在24h内完全降解DMF，到600ppm时24h降解率为43％，增加到800ppm时降解效果不明显；对该菌株进行遗传稳定性验证，传代五代后，对DMF降解能力没有明显变化，证明该菌株不仅对DMF降解能强并且遗传稳定。

上述过程中，液体无机盐培养基(g/L)：0.09g KH₂PO₄、0.22g K₂HPO₄、0.26gNaH₂PO₄、0.23g MgSO₄，0.28g CaCl₂，0.003g FeCl₃，pH值7.0～7.2；

固体无机盐培养基(g/L)：0.09g KH₂PO₄、0.22g K₂HPO₄、0.26g NaH₂PO₄、0.23gMgSO₄，0.28g CaCl₂，0.003g FeCl₃，20g琼脂，pH值7.0～7.2。

发明人进一步公开了该惠氏副球菌在降解DMF方面的应用方法：将其加入到待处理废水或其生化系统中。

优选的，将该惠氏副球菌做成菌剂加入到待处理废水或其生化系统中。

更为优选的，所述菌剂的有效活菌数为5×10⁷～5×10¹⁰个/g。

优选的，上述惠氏副球菌菌剂的制备方法如下：

1)菌种活化：取1～5μL冻存的惠氏副球菌接种于含有5ml LB液体培养基中，于30～35℃，150～180rpm培养16h-24h；

2)液体种子制备：将活化的菌种转接到200ml LB液体培养基中，于30～35℃，150～180rpm培养16h-24h；

3)发酵：将制备好的液体种子按照5％～15％(V/V)的接种量接种到发酵罐进行扩大培养，培养温度30℃～35℃，pH：6.8-7.5，发酵罐压：0.05Mpa，初始转速：200rpm，初始通气量10～15L/min，转速最高500rpm，通气量最高30L/min(1：2.6)，控制DO≥20mg/L，发酵周期：10-18h；

注：缓效碳氮源多，发酵周期可适当延长。

更进一步的所用的发酵培养基为：玉米粉1.5％、葡萄糖1％，酵母粉0.3％、尿素0.05％、黄豆饼粉2％、MgSO₄·7H₂O0.05％、NaCl0.01％、KH₂PO₄0.02％，消泡剂0.1％，pH6.8-7.2。此发酵培养基为优化后培养基，与常规LB培养基相比，能够有效提高发酵菌数，更能适应车间的大量生产运行，保证后期菌剂中的有效活菌数。

4)菌剂制备：当发酵培养至稳定期(菌量最高)时停止发酵，添加4％的硅藻土吸附处理发酵液后，对发酵液进行离心、分离得到固体菌体，进行干化处理后获得菌剂，菌剂的含水率控制在20％以下。

将上述获得的高效降解DMF的惠氏副球菌菌剂应用于去除生化系统中DMF，其具体过程为：将生化系统pH调至6.0-7.5，加入高效降解DMF的惠氏副球菌菌剂，曝气培养24-30h。

菌剂添加量(按体积算)为生化系统体积的1‰-5‰；

优选的，生化系统条件为温度28-37℃，PH7.0-7.2，溶氧2-4mg/L；

更为优选的，投加经活化后的固体菌种或菌剂时应配合营养盐一起投加，以提高菌种的活性，所述的营养盐具体为：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化钙、氯化铁。

优选的营养盐添加量具体为磷酸二氢钾0.09g/L、磷酸氢二钾0.22g/L、磷酸氢二钠0.26g/L、硫酸镁0.23g/L、氯化钙0.28g/L、氯化铁0.003g/L。

营养盐是为了增加菌株的活性，营养盐容易吸收利用，提供菌株前期生长所需，提高适应能力。

将上述高效降解DMF的惠氏副球菌菌剂应用于生化系统中，对系统的适应性强，效果稳定，能高效降解生化系统中的DMF，24h降解率为100％。

本发明具有以下优势：

(1)本发明经过驯化筛选，从活性污泥中分离、筛选获得目的菌株惠氏副球菌，使其能够有效耐受生化系统中的高负荷及其他抑制物的冲击，快速形成优势菌群，有效去除生化系统中含有的DMF，维持系统稳定性，保证出水各指标达到排放标准。

(2)本发明提供的惠氏副球菌菌剂，降解DMF效率高，500ppm浓度下，24h降解率为100％。

(3)本发明提供的惠氏副球菌菌剂与生物化学处理方法比较，处理量大，成本低，条件温和，并且，简化操作，节省了人力、物力，降低了设备使用压力。

(4)本发明提供的惠氏副球菌菌剂能够利用生化系统中的DMF为唯一碳源，对DMF进行彻底化、无害化降解处理，不产生二次污染。

保藏说明

保藏时间：2019年03月19日；

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC No.17359；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；

分类命名:惠氏副球菌(Paracoccus wyeth)。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。除特殊说明外，以下实施例中均采用常规技术操作完成。

实施例1

通过梯度压力驯化、筛选获得一株具有降解DMF功能的惠氏副球菌YJY19-03，对其降解功能定性检测，具体方法如下：

无机盐培养基配方为：每升培养基中0.09g KH₂PO₄、0.22g K₂HPO₄、0.26g NaH₂PO₄、0.23g MgSO₄，0.28g CaCl₂，0.003g FeCl₃，pH值7.0～7.2。将新鲜种子液以1‰、5‰、1％的接种量接种于DMF初始浓度为500ppm的无机盐液体培养基中，同时将新鲜种子液以1‰的接种量接种于DMF初始浓度为500ppm的LB培养基中，37℃、170r/min条件下连续振荡培养3d，每隔24h取样检测DMF含量变化情况，见表1。

表1 DMF降解数据统计

DMF降解菌在不同接种量及培养方式下，表现出不同的降解效果，其中，在无机盐培养基中，随着接种量的提高，降解效果明显增强，接种量1‰时，培养2d后，降解率达到100％。同时，接种量为1‰的情况下，在LB培养基中，培养1d后，降解率达到100％。

由此可知，DMF降解菌具有极其高效的降解效果，在无机盐培养基中能够以DMF为唯一碳源生长繁殖，在营养较为丰富的LB培养基中，也能够利用其他碳氮源快速生长繁殖，并在此过程中，显著提高对DMF的降解速率，未呈现对碳氮源的选择性利用，能够满足污水处理的应用。

实施例2

利用本发明的惠氏副球菌制备菌剂，具体制备方法如下：

1)菌种活化：取1～5μL冻存的惠氏副球菌接种于含有5ml LB液体培养基的试管内，于30～35℃，150～180rpm培养16h-24h；

2)液体种子制备：将活化的试管菌种转接到200ml LB液体培养基中，于30～35℃，150～180rpm培养16h-24h；

3)发酵：将制备好的液体种子按照5％～15％(V/V)的接种量接种到发酵罐进行扩大培养，培养温度30℃～35℃，pH：6.8-7.5，发酵罐压：0.05Mpa，初始转速：200rpm，初始通气量10～15L/min，转速最高500rpm，通气量最高30L/min(1：2.6)，控制DO≥20mg/L，发酵周期：10-18h；注：缓效碳氮源多，发酵周期可适当延长。

所用的发酵培养基为：玉米粉1.5％、葡萄糖1％，酵母粉0.3％、尿素0.05％、黄豆饼粉2％、MgSO₄·7H₂O0.05％、NaCl0.01％、KH₂PO₄0.02％，消泡剂0.1％，pH6.8-7.2。

4)菌剂制备：当发酵培养至稳定期(菌量最高)时停止发酵，添加4％的硅藻土吸附处理发酵液后，对发酵液进行离心、分离得到固体菌体，进行干化处理后获得菌剂，菌剂的含水率控制在20％以下。

实施例3

将实施例2的惠氏副球菌菌剂在实验室验证如下：

在无机盐液体培养基中，验证惠氏副球菌菌剂降解DMF的应用效果，其中菌剂添加量为1‰，无机盐培养基配方为：每升培养基中0.09g KH₂PO₄、0.22g K₂HPO₄、0.26g NaH₂PO₄、0.23g MgSO₄，0.28g CaCl₂，0.003g FeCl₃，pH值7.0～7.2。DMF初始浓度为500ppm，37℃、170r/min条件下连续振荡培养3d，取样检测DMF浓度为0，惠氏副球菌菌剂具有较强活性，能够满足DMF降解的需求。

实施例4

将实施例2的惠氏副球菌菌剂在滨州市沾化县新天鸿水务有限公司进行现场应用，向含有DMF的废水中投加惠氏副球菌菌剂，具体如下：

在6m3左右有效容积的曝气池中，根据现场废水中初始DMF浓度为1500ppm，投加5‰体积的菌剂，控制温度32-37℃，PH7.0-7.2，溶氧2-4mg/L，投加菌剂时配合固体营养盐一起投加，以提高菌种的活性。营养盐组成及投加量见表2.

表2营养盐组成

爆气处理1d后，检测DMF含量为0，说明惠氏副球菌菌剂能够高效降解废水中DMF，满足现场条件下应用需求。

实施例5

将实施例2的惠氏副球菌菌剂在山东京博农化污水处理系统现场进行应用，具体如下：在现场5m³生化系统中，根据废水中实际DMF含量为550ppm的情况，投加3‰体积的固体菌剂，控制温度30-35℃，PH6.5-7.0，溶氧2-4mg/L，投加固体菌种时配合固体营养盐一起投加，以增加菌种适应能力，提高菌种的活性。营养盐的组成及用量见表3。

表3营养盐组成

爆气处理1d后，通过检测DMF含量为0，说明惠氏副球菌菌剂能够高效降解废水中DMF，满足现场条件下应用需求。

实施例6

将实施例2的惠氏副球菌菌剂，山东清远环保有限公司所接收的污水：

已经经过一次生化处理，废水中DMF含量较低，为300ppm左右，在生化系统中投加固体菌剂体积为生化体系体积的3‰，控制温度28-35℃，PH7.0-7.2，溶氧2-4mg/L，曝气处理1d，通过检测出水DMF含量为0。

综上说明惠氏副球菌菌剂在处理低浓度DMF废水时具有较大优势，可根据现场情况进行调整操作规程，能够满足现场需求。

序列表

<110> 黄河三角洲京博化工研究院有限公司

<120> 一种高效降解DMF的惠氏副球菌及其应用

<141> 2019-11-11

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1332

<212> DNA

<213> 惠氏副球菌(Paracoccus wyeth)

<400> 1

cgtggtcgct gccccattgc tggttagcgc acggccgtcg ggtagaacca actcccatgg 60

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgttccgcga 120

ttactagcga ttccaacttc atggggtcga gttgcagacc ccaatccgaa ctgagatggc 180

ttttggggat taacccactg tcaccaccat tgtagcacgt gtgtagccca acccgtaagg 240

gccatgagga cttgacgtca tccacacctt cctccgactt atcatcggca gttcttccag 300

agtgcccaac caaatgatgg caactggaag tgtgggttgc gctcgttgcc ggacttaacc 360

gaacatctca cgacacgagc tgacgacagc catgcagcac ctgtccacag gtctcttacg 420

agaagacccg atctctcggg ctgtcctgcg atgtcaaggg ttggtaaggt tctgcgcgtt 480

gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt 540

ttaatcttgc gaccgtactc cccaggcgga atgcttaatc cgttaggtgt gtcaccgaac 600

agcatgctgc ccgacgactg gcattcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat 660

cctgtttgct ccccacgctt tcgcacctca gcgtcagtat cgagccagtg agccgccttc 720

gccactggtg ttcctccgaa tatctacgaa tttcacctct acactcggaa ttccactcac 780

ctctctcgaa ctccagacca atagttttga aggcagttcc gaggttgagc cccgggattt 840

cacccccaac tttctggtcc gcctacgtgc gctttacgcc cagtaattcc gaacaacgct 900

agccccctcc gtattaccgc ggctgctggc acggagttag ccggggcttc ttctgctggt 960

accgtcatta tcttcccagc tgaaagagct ttacaaccct aaggccttca tcactcacgc 1020

ggcatggcta gatcagggtt gcccccattg tctaagattc cccactgctg cctcccgtag 1080

gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gctgatcatc ctctcaaacc agctatggat 1140

cgtaggcttg gtaggccatt accccaccaa ctacctaatc caacgcgggc cgatccttct 1200

ccgataaatc tttcccccaa ggggcgtata cggtattact cccagtttcc cagggctatt 1260

ccgtagagaa gggcacgttc ccacgcgtta ctcacccgtc cgccgctaac cccgaagggt 1320

cgctcgactg ca 1332

Claims (10)

1.一种高效降解DMF的惠氏副球菌，其特征在于，菌株代码为YJY19-03，平板培养菌落呈圆形,隆起,表面光滑,湿润,边缘整齐,乳黄色，属于惠氏副球菌(Paracoccus wyeth)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17359。

2.一种高效降解DMF的惠氏副球菌的应用，其特征在于，应用于降解N,N-二甲基甲酰胺。

3.一种高效降解DMF的惠氏副球菌的应用方法，其特征在于，将其加入到待处理废水或其生化系统中。

4.根据权利要求3所述的一种高效降解DMF的惠氏副球菌的应用方法，其特征在于，将该惠氏副球菌做成菌剂加入到待处理废水或其生化系统中。

5.一种高效降解DMF的惠氏副球菌菌剂，其特征在于，制备方法如下：

1)菌种活化：取1～5μL冻存的惠氏副球菌接种于含有5ml LB液体培养基中，于30～35℃，150～180rpm培养16h-24h；

2)液体种子制备：将活化的菌种转接到200ml LB液体培养基中，于30～35℃，150～180rpm培养16h-24h；

3)发酵：将制备好的液体种子按照5％～15％(V/V)的接种量接种到发酵罐进行扩大培养，培养温度30℃～35℃，pH：6.8-7.5，发酵罐压：0.05Mpa，初始转速：200rpm，初始通气量10～15L/min，转速最高500rpm，通气量最高30L/min(1：2.6)，控制DO≥20mg/L，发酵周期：10-18h；

4)菌剂制备：当发酵培养至稳定期时停止发酵，添加4％的硅藻土吸附处理发酵液后，对发酵液进行离心、分离得到固体菌体，进行干化处理后获得菌剂，菌剂的含水率控制在20％以下。

6.根据权利要求5所述的一种高效降解DMF的惠氏副球菌菌剂，其特征在于，发酵罐的发酵培养基为：玉米粉1.5％、葡萄糖1％，酵母粉0.3％、尿素0.05％、黄豆饼粉2％、MgSO₄·7H₂O0.05％、NaCl0.01％、KH₂PO₄0.02％，消泡剂0.1％，pH6.8-7.2。

7.根据权利要求5所述的一种高效降解DMF的惠氏副球菌菌剂，其特征在于，所述菌剂的有效活菌数为5×10⁷～5×10¹⁰个/g。

8.一种高效降解DMF的惠氏副球菌菌剂的使用方法，其特征在于，其具体过程为：将生化系统pH调至6.0-7.5，加入惠氏副球菌菌剂，曝气培养24-30h，菌剂投加体积为生化系统体积的1‰-5‰。

9.根据权利要求8所述的一种高效降解DMF的惠氏副球菌菌剂的使用方法，其特征在于，生化系统条件为温度28-37℃，PH7.0-7.2，溶氧2-4mg/L。

10.根据权利要求8所述的一种高效降解DMF的惠氏副球菌菌剂的使用方法，其特征在于，投加惠氏副球菌菌剂时配合营养盐一起投加，营养盐添加量具体为磷酸二氢钾0.09g/L、磷酸氢二钾0.22g/L、磷酸氢二钠0.26g/L、硫酸镁0.23g/L、氯化钙0.28g/L、氯化铁0.003g/L。