CN101914479A

CN101914479A - 一种可降解二甲基甲酰胺的菌群富集方法

Info

Publication number: CN101914479A
Application number: CN 201010266673
Authority: CN
Inventors: 崔荣; 韩京龙; 宋岩; 张鹏; 李金玲
Original assignee: Yantai University
Current assignee: Yantai University
Priority date: 2010-08-30
Filing date: 2010-08-30
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2030-08-30
Also published as: CN101914479B

Abstract

本发明涉及环境微生物领域，尤其涉及一种可降解二甲基甲酰胺(DMF)的菌群富集方法。针对DMF在工业废水处理中不易降解或降解效果不理想的问题。本发明公开了一种可降解二甲基甲酰胺的菌群富集方法，其特征在于将活性污泥加入到驯化期的培养基中进行驯化培养，再将驯化培养后的活性污泥加入到二甲基甲酰胺与富集培养基的体积比为1：250的培养液中进行富集培养，用NaOH或H₂SO₄调节其pH至7.00；在好氧条件下放置在恒温振荡箱QW—A中在恒温30℃±2℃，振荡频率150rpm左右振荡培养5至6天。本发明的目的在于为工业废水的生化处理提供一种经济高效的可降解DMF的菌群的富集方法。

Description

一种可降解二甲基甲酰胺的菌群富集方法

技术领域

本发明涉及环境微生物领域，尤其涉及一种可降解二甲基甲酰胺的菌群富集方法。

背景技术

二甲基甲酰胺(DMF)是一种化学性质稳定、沸点高、性能优良的有机溶剂，能与水及多数有机溶剂以任意比互溶，有“万能溶剂”之称，在工业生产中得到大量应用。由于DMF仅作为有机溶剂而不发生化学反应，在量上几乎没有损耗，全部进入废水中。DMF进入水中会导致生物化学耗氧量和氮含量增加，使水质迅速恶化。1gDMF产生1.54gCOD，0.01gBOD，BOD/COD值为0.0065，可生化性极差。因此寻找一种有效的方法来处理DMF废水是十分迫切的。高效优势菌以其成本低、二次污染少的特点，已受到重视并开始得到应用。但如何获得高效的优势降解菌群一直是废水生化处理中的一个难题。

高效降解菌在废水的生物处理中起着非常重要的作用，研究人员往往是从受污染的环境中分离到一些具有特殊降解能力的细菌、真菌种类，通过富集、驯化而培养起来。国外有学者为提高DMF的生物降解速率，用炼油厂、石化厂装置附近经常接触工业废水的土壤中分离出的微生物或泥土加到活性污泥中去。研究发现主要降解DMF的菌种为给出中文名称（Pseudomonas minuscula），给出中文名称（Pcrucivial）及革兰氏阴性菌，它们可将DMF作为碳、氮源而去除。

在自然环境中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当希望获得某一类微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一类微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得某类微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长而抑制其他细菌生长的环境，从而淘汰其他不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到较纯的菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种可降解DMF的菌群富集方法，通过该方法能够为工业废水生化处理提供一种经济高效的可降解DMF的菌群。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

先将含可降解二甲基甲酰胺的菌的活性污泥加入到驯化期的培养基中进行驯化培养；再将驯化培养后的的活性污泥加入到二甲基甲酰胺与富集培养基的体积比为1：250的培养液中进行富集培养;最后将培养液在好氧条件下放置在恒温振荡箱中，保持恒温28℃至32℃、振荡频率150 rpm，振荡培养5至6天为一周期，在每一周期结束时，撇掉2/3的培养液，补充添加新鲜的富集培养基继续培养，共经过5个周期的培养。

进一步，驯化期的培养基组分为：K₂HPO₄ 6.8g、KH₂PO₄ 1.2 、MgSO₄.7H₂O 0.1g、MnSO₄.4H₂O 0.1g、CaCl₂.2H₂O 0.1g、FeSO₄.7H₂O 0.1g、Na₂MoO₇.2H₂O 0.006g和蒸馏水1000mL。

进一步，富集培养期的培养基组分为：KH₂PO₄ 5g、CaCl₂.2H₂O 0.022g、MgSO₄.7H₂O 0.040g、FeCl₃.6H₂O 0.0075g、Na₂MoO₇.2H₂O 0.0011g、ZnSO₄.7H₂O 0.0007g、MnSO₄.4H₂O 0.0006g、CuSO₄.5H₂O 0.0006g、CoCl₂.6H₂O 0.0006g和蒸馏水1000mL。

进一步，在上述培养过程中用NaOH或H₂SO₄调节其pH为7.00。

本发明的有益效果是：利用本发明的方法能使工业废水处理中 DMF去除速率由普通活性污泥的14.24 mgDMF/(g(MLSS)·d)上升到30.72 mgDMF/(g(MLSS)·d)，DMF去除速率有较大提高，对减少DMF给环境保护带来的危害起到很好的效果，在工业废水的处理具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明活性污泥与添加富集微生物的活性污泥的DMF降解曲线图；

图2为本发明活性污泥与添加富集微生物的活性污泥的DMF去除率图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1 原料的制备

a、培养基的配备

利用Ⅱ型电子精密天平依次称取下述组分溶于蒸馏水中，搅拌使其溶解。

驯化期的培养基组分为：K₂HPO₄ 6.8g、KH₂PO₄ 1.2 、MgSO₄.7H₂O 0.1g、MnSO₄.4H₂O 0.1g、CaCl₂.2H₂O 0.1g、FeSO₄.7H₂O 0.1g、Na₂MoO₇.2H₂O 0.006g和蒸馏水1000mL。

富集培养期培养基组分为：KH₂PO₄ 5g、CaCl₂.2H₂O 0.022g、MgSO₄.7H₂O 0.040g、FeCl₃.6H₂O 0.0075g、Na₂MoO₇.2H₂O 0.0011g、ZnSO₄.7H₂O 0.0007g、MnSO₄.4H₂O 0.0006g、CuSO₄.5H₂O 0.0006g、CoCl₂.6H₂O 0.0006g和蒸馏水1000mL。

b、含可降解DMF的菌的活性污泥制备

取制于烟台市辛安河污水处理厂A2O工艺二沉池的回流污泥

实施例2 培养方法

驯化培养：由于DMF具有一定的生物毒性，因此为了降低DMF的毒性对活性污泥中微生物正常生命活动的冲击影响，需要对其进行驯化培养，使其逐渐适应DMF，产生适应酶，从而在处理DMF废水时以DMF作为唯一的碳源、氮源和能源进行代谢，达到降解DMF的目的。

首先将取来的活性污泥进行了一周时间的驯化培养，活性污泥的MLSS为9702 mg/L。取250 mL锥形瓶3个，每个三角瓶取活性污泥62mL，静置弃去上清液，用驯化阶段培养基稀释到200mL，这样每个三角瓶的初始MLSS约为3000 mg/L左右。利用NaOH或H2SO4调节其初始pH至7.00。然后将三角瓶置于全温振荡培养箱中，温度保持在30±2℃，振荡频率150 rpm左右的条件下进行培养。培养期间，每天取三角瓶中培养液50 mL利用TG16-WS台式高速离心机在8000 r/分钟的转速下离心10分钟，取水样进行DMF含量和氨氮含量的测定，同时测量三角瓶中培养液的pH。由于培养液总量不多，离心剩余的泥和上清液又倒回对应的三角瓶中。经过六天的培养，DMF含量由初始的2600 mg/L左右降至40 mg/L以下，表明其中已经有可以降解DMF的微生物存活。

筛选培养：将驯化期培养后的三个三角瓶中的污泥混匀，平均分成六份并分别接种到六个相同的250 mL三角瓶中。每个三角瓶中物质添加情况见表1。DMF添加量为0.4%（v/v），即每个三角瓶添加DMF 0.8mL。接种好之后在QW-A型全温振荡培养箱中于相同的条件下进行培养。指标测定情况同前。筛选培养的目的是为了观察不同的pH和外加碳源对DMF降解影响，并为最终的富集培养确定合适的条件。

由实验中各项指标的测定及实验现象的观察，可以看出添加外加碳源琥珀酸钠且全程pH保持在7.00的培养基状况更适宜于DMF降解细菌的生长，其次是不添加外加碳源、初始pH是7.00且实验过程中不加以控制的培养条件也适宜于DMF降解微生物的活动。因此富集培养时选择的最佳的培养条件是1号和4号，即初始pH是7.00且全程不加以控制、不添加任何外加碳源和添加琥珀酸钠、实验全程pH保持在7.00的两组。

表格1 DMF降解微生物筛选培养实验各组的接种情况

富集培养：富集培养过程所用培养基与之前的筛选培养实验所用培养基相同。根据细菌筛选培养的结果分析选取1、4号进行富集培养。接种物选用DMF降解细菌筛选培养时1、4号污泥。接种量是50 mL，用培养基稀释到200 mL。DMF添加量为体积比1：250。其他培养条件同前。每天测定其中DMF的含量、氨氮含量、OD540和pH。采用补料分批培养方式,当二甲基甲酰胺浓度由2600mg/L降至250mg/L左右时，撇掉2/3的培养液，补充添加新鲜的培养基继续培养。经5个周期的培养，获得富集的可降解二甲基甲酰胺的菌群。

具体试验实施例

试验实施例1 DMF降解微生物富集培养的鉴定

本实验中通过测定生物反应速率来判断降解DMF微生物富集培养是否成功。具体流程如下：取两个相同的250mL三角瓶，1号瓶：取200mL活性污泥，离心之后将污泥利用培养基稀释到200mL；2号瓶：取200mL活性污泥和300mL左右DMF降解微生物的富集培养液进行离心。离心后撇掉上清液，将泥利用培养基稀释到200mL。两个三角瓶中DMF添加量为0.1%体积比。pH调至7.00，于相同条件下培养。每2小时离心取样一次，测定其DMF含量，同时检测pH变化。通过DMF降解速率的异同来验证DMF降解微生物是否富集。在实验开始和结束分别测定培养液的MLSS含量以计算每克MLSS的DMF去除率。

由图1可见，添加富集菌的活性污泥与未添加富集菌的活性污泥的DMF去除量相差很多，仅加活性污泥的对照组的DMF去除量为142 mg/L，添加富集菌的活性污泥对照组的DMF去除量为456 mg/L。如图2所示，图中1是未添加富集菌的活性污泥，其DMF去除速率为14.24 mgDMF/(g(MLSS)·d)；2是添加富集菌的活性污泥，其DMF去除速率为30.72 mgDMF/(g(MLSS)·d)。活性污泥的MLSS为11167 mg/L，添加富集菌的活性污泥的MLSS为12320 mg/L。两组的MLSS相差不多，但DMF去除速率相差2.2倍左右。由此很容易知道，2号DMF较高的去除速率是由于其中DMF降解微生物的存在，且该DMF降解微生物有较高的活性，由此证明DMF降解微生物富集培养效果明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种可降解二甲基甲酰胺的菌群富集方法，是通过以下步骤实现：

a、将活性污泥加入到驯化期的培养基中进行驯化培养；

b、再将驯化培养后的的活性污泥加入到二甲基甲酰胺与富集培养基的体积比为1：250的培养液中进行富集培养;

c、将上述培养液在好氧条件下放置在恒温振荡箱中，保持恒温28℃～32℃、振荡频率150rpm，振荡培养5～6天为一周期；

d、在每一周期培养结束后，去掉2/3的培养液，再补充添加新的富集培养基继续培养，共经过5个周期的培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a中驯化期的培养基组分为：K₂HPO₄ 6.8g、KH₂PO₄ 1.2g、MgSO₄.7H₂O 0.1g、MnSO₄.4H₂O 0.1g、CaCl₂.2H₂O 0.1g、FeSO₄.7H₂O 0.1g、Na₂MoO₇.2H₂O 0.006g和蒸馏水1000ml。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤b中富集培养期的培养基组分为：KH₂PO₄ 5g、CaCl₂.2H₂O 0.022g、MgSO₄.7H₂O 0.040g、FeCl₃.6H₂O 0.0075g、Na₂MoO₇.2H₂O 0.0011g、ZnSO₄.7H₂O 0.0007g、MnSO₄.4H₂O 0.0006g、CuSO₄.5H₂O 0.0006g、CoCl₂.6H₂O 0.0006g和蒸馏水1000mL。

4.根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：在培养过程中用NaOH或H₂SO₄调节其pH为7.00。