CN108410755A - 一种用于分解二甲基甲酰胺的菌群及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分解二甲基甲酰胺的方法，尤其涉及一种用于分解二甲基甲酰胺的菌群及其培养方法。所述用于分解二甲基甲酰胺的菌群包括：短波单胞菌、类短短芽孢杆菌、无色杆菌、黄杆菌、寡养食单胞菌、苍白杆菌、水微菌、鞘脂杆菌与类诺卡氏菌。本发明的菌群利用二甲基甲酰胺作为碳源和氮源，在满足其自身生长的同时对二甲基甲酰胺进行氧化分解；本发明的菌群可高效去除工业废水中难降解的有机物二甲基甲酰胺，降低了废水处理的运行成本。

Description

一种用于分解二甲基甲酰胺的菌群及其培养方法

技术领域

本发明涉及分解二甲基甲酰胺的方法，尤其涉及一种用于分解二甲基甲酰胺的菌群及其培养方法。

背景技术

二甲基甲酰胺是一种性能优良的有机溶剂和常见的主要精细化工原料，工业用途广泛，在聚氨酯合成革工业及医药、农药、石油化工、造纸、纺织等行业有重要应用。由于二甲基甲酰胺仅作为有机溶剂而不发生化学反应，量上几乎没有损耗，这样易于形成高浓度二甲基甲酰胺有机工业废水。

目前国内学者对二甲基甲酰胺废水的处理方法主要为物理化学法，如活性炭吸附法、萃取法、Fenton氧化法等，但此类方法处理成本较高，尤其是脱附液和萃取后的废水需进一步处理。由于微生物对水环境中有机化合物的降解起着关键作用，因此采用生物方法处理二甲基甲酰胺工业废水具有高效率、低成本的优势。但二甲基甲酰胺化学性质稳定，化学式为(CH3)2NHCHO，其分子端部是两个强憎水性的甲基基团，BOD/COD为0.065，可对废水生物处理过程产生抑制作用，因此用普通的活性污泥法降解二甲基甲酰胺废水十分困难。2011年，杨帅等利用菌株MBYD-1矿化质量浓度为0.5g/L的DMF(体积浓度约为0.053％)时，需要时间84h。已报道的细菌DMF耐受质量浓度最大出现于2012年S.S.Kumar等应用聚乙烯醇和海藻酸钠包埋细菌Ochrobactrum sp.DGVK1所形成的固定化载体，其中DMF最大耐受体积浓度为2.5％(质量浓度约为23.7g/L)。2009年，S.Swaroop等在菌株Paracoccussp.strain DMF的批式试验中，获得DMF最大耐受质量浓度为15g/L(体积浓度约为1.58％)。2016年，Zheng等利用氧化石墨烯负载细菌Paracoccus denitrifcans形成符合材料用于吸附降解DMF时，可降解DMF质量浓度也仅研究到2g/L(体积浓度约为0.21％)。因此，开发高效降解二甲基甲酰胺的菌群具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于分解二甲基甲酰胺的菌群及其培养方法，以解决现有技术中存在的问题。

根据本发明的一个方面，本发明提供的用于分解二甲基甲酰胺的菌群，包括：短波单胞菌、类短短芽孢杆菌、无色杆菌、黄杆菌、寡养食单胞菌、苍白杆菌、水微菌、鞘脂杆菌与类诺卡氏菌。

进一步地，所述菌群按照质量份计包括：短波单胞菌20-25份、类短短芽孢杆菌8-12份、无色杆菌2-5份、黄杆菌20-25份、寡养食单胞菌8-12份、苍白杆菌2-5份、水微菌5-8份、鞘脂杆菌4-5份与类诺卡氏菌10-15份。

进一步地，用于分解二甲基甲酰胺的菌群的培养方法，包括步骤：从活性污泥中分离出沉淀物，将其置于容器中，旋转容器，将沉淀物打散形成菌液；将菌液接种入含有二甲基甲酰胺的培养基，形成菌群培养基；在菌群培养基中培养出用于分解二甲基甲酰胺的菌群。

进一步地，所述菌群培养基包括菌液、二甲基甲酰胺、氯化钙、硫酸亚铁与营养液。

进一步地，所述营养液包括K2HPO4、MgSO4·7H2O与牛肉膏。

进一步地，所述二甲基甲酰胺占所述菌群培养基的体积百分含量为0-6％。

进一步地，通过向二甲基甲酰胺的菌群培养基内添加酸或碱，以调节所述菌群培养基的pH为6.0-9.0。

进一步地，所述菌液占所述菌群培养基的体积百分含量为10-50％。

进一步地，所述培养方法还包括将容器置于摇床内进行旋转混合。

进一步地，所述培养方法还包括将菌群培养基置于摇动混合温度为25-35℃的摇床中。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.本发明的菌群利用二甲基甲酰胺作为碳源和氮源，在满足其自身生长的同时对二甲基甲酰胺进行氧化分解；

2.本发明的菌群可高效去除工业废水中难降解的有机物二甲基甲酰胺，降低了废水处理的运行成本。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的设置。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1为接种率对菌群活性的影响；

图2为pH对菌群活性的影响；

图3为二甲基甲酰胺浓度对菌群活性的影响；

图4为二甲基乙酰胺浓度对菌群活性的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种能利用二甲基甲酰胺作为碳源和氮源的混合菌群，在满足其自身生长的同时对二甲基甲酰胺进行氧化分解；用于分解二甲基甲酰胺的菌群，其特征在于，包括：短波单胞菌、类短短芽孢杆菌、无色杆菌、黄杆菌、寡养食单胞菌、苍白杆菌、水微菌、鞘脂杆菌与类诺卡氏菌。按照质量份计包括：短波单胞菌20-25份、类短短芽孢杆菌8-12份、无色杆菌2-5份、黄杆菌20-25份、寡养食单胞菌8-12份、苍白杆菌2-5份、水微菌5-8份、鞘脂杆菌4-5份与类诺卡氏菌10-15份。

本发明以人造革废水处理厂的活性污泥为菌源，通过长期批式培养获得二甲基甲酰胺降解混合菌群。二甲基甲酰胺的菌群培养基包括菌液、二甲基甲酰胺、氯化钙、硫酸亚铁与营养液；并将配置好的培养基置于25-35℃的摇床内培养。所述营养液包括K2HPO4、MgSO4·7H2O与牛肉膏。

所述菌液的具体方法：取活性污泥，从活性污泥中分离出沉淀物，之后清洗沉淀物；将其置于容器中并补充水分，加入玻璃珠；最后，将容器置于摇床内旋转，将其打散形成菌液。

所述菌液占所述培养基的体积百分含量可为10-50％。降解二甲基甲酰胺的混合菌群的接种率可为10-50％。体积比30％的接种率时48h即可将0.2％的二甲基甲酰胺培养基内的二甲基甲酰胺完全分解。

菌群在pH为6.0-9.0的培养基中对二甲基甲酰胺均有氧化效果，但是pH大于6.0时，随pH升高氧化分解能力下降。pH为5.0时，虽接种时调整pH至5.0，但反应体系内存在碱性物质释放，导致pH在24h后上升至6.5，同时出现部分二甲基甲酰胺分解，而再次调整pH为5.0后，即未再观察到pH上升和二甲基甲酰胺的分解，因此，pH为4.0和5.0时菌群失去氧化分解能力。

所述混合菌群对于氨氮具有较强的耐受能力，氨氮浓度超过2000mg/L时，菌群仍具备二甲基甲酰胺分解能力。

所述混合菌群的二甲基甲酰胺的耐受浓度为≤6％。所述混合菌群对二甲基甲酰胺最大耐受浓度为6％，超过6％时，菌群对二甲基甲酰胺丧失分解能力。

所述混合菌群的二甲基乙酰胺的耐受浓度为≤4％。所述混合菌群对二甲基甲酰胺最大耐受浓度为4％，超过4％时，菌群对二甲基乙酰胺丧失分解能力。

二甲基甲酰胺的菌群培养基中各物质的配制过程：

(1)所述活性污泥取自浙江丽水某人造革企业的污水处理站，取回后-20℃保存5d，使用前室温解冻。首先，从解冻的混合液中沉淀分离出活性污泥沉淀物10mL，在超净台内，使用去离子水清洗活性污泥沉淀物5次，后补充去离子水至总体积100mL。然后将其转移至250mL锥形瓶，并在锥形瓶中加入5mm直径玻璃珠30-40枚；最后，将锥形瓶置于25-35℃摇床内150转/min旋转15-25min，菌胶团被打散形成菌悬液，菌悬液作为菌液加入培养基中。

(2)营养液包括0.654g/L的K2HPO4、0.0487g/L的MgSO4·7H2O、1g/L牛肉膏，在0.1MPa与121℃下灭菌20min；

(3)二甲基甲酰胺与去离子水以一定比例配置，然后采用0.22μm滤膜过滤灭菌；

(4)FeSO4，称取25g的FeSO4·7H2O溶于100ml去离子水中，为防止氧化调节pH至1.8，然后采用0.22μm滤膜过滤灭菌；

(5)CaCl2，称取0.2g的CaCl2溶于100ml去离子水中，然后采用0.22μm滤膜过滤灭菌；

(6)酸，1mL浓H2SO4溶于29mL去离子水中，然后采用0.22μm滤膜过滤灭菌；

(7)碱，10g NaOH溶于90mL去离子水中，然后采用0.22μm滤膜过滤灭菌。

实施例1

(1)在超净台内，于锥形瓶配置100mL培养基(接种率10％)：其中菌液10mL+2mL10％二甲基甲酰胺+1mLCaCl2+20μL FeSO4+87mL营养液，调整pH为7.0，配置完成后使用Para封口膜作封口处理；

(2)将锥形瓶置于30℃摇床内培养，其中摇床转数为150r/min。随着反应进行，培养体系的pH逐渐升高，因此每24h调整pH至7.0。每48h测定反应体系的OD600(根据OD600测量细菌或真菌浓度)、和浓度，基于体系OD变化和氮素浓度变化确定反应进程，调整反应周期长度。pH调整和采样均在超净台内完成；

(3)确定每个周期的培养终点：大量研究表明，生物降解体系中二甲基甲酰胺的分解与氨氮的生产显著相关。每一个培养周期初始接种时培养基的二甲基甲酰胺浓度被控制为0.2％，经核算，0.2％二甲基甲酰胺浓度所含氮浓度为363.1mg/L。因此，在菌群培养期间，当培养体系内浓度升高300mg/L以上时(原因：反应过程中部分被氧化为部分 被细菌同化作为细胞成分)，可认为二甲基甲酰胺已被完全分解，最后反应形成的混合液作为下一个周期的接种菌液。

(4)培养过程：实现二甲基甲酰胺完全分解的培养过程共经历11个周期，历时101d，各周期时长分别为：22d、18d、15d、10d、8d、6d、6d、4d、4d、4d和4d。

第11个培养周期结束后，采集混合菌群样品，委托上海美吉生物医药科技有限公司测定群落结构。所述菌群包括：短波单胞菌、类短短芽孢杆菌、无色杆菌、黄杆菌、寡养食单胞菌、苍白杆菌、水微菌、鞘脂杆菌与类诺卡氏菌。

实施例2混合菌群批式试验：

完成11个周期的培养驯化后，针对混合菌群的各项特性，共设置4组批式试验。图1-4的纵坐标均为二甲基甲酰胺分解得到的氨氮的浓度。

(1)接种率对菌群活性的影响

如图1所示，试验共设置5个接种率：10％、20％、30％、40％和50％，配置时维持反应体积100mL，其中菌液体积分别从10mL逐级增加至50mL，同时营养液分别从87mL逐级递减为47mL，周期时长控制为48h，其余组分及控制条件与培养驯化阶段一致。如图1所示，混合菌群的最佳接种率为30％，48h即可将体积浓度0.2％的二甲基甲酰胺培养基内的二甲基甲酰胺完全分解。

可知，本发明获得的混合菌群具有快速的DMF分解能力，48h即可完全分解体积浓度为0.2％的DMF。

(2)pH对菌群活性的影响

如图2所示，试验共设置6个pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，波动范围为±0.05，每24时调整pH时即控制为初始pH,接种率调整为30％，周期时长控制为48h，培养基组分及控制条件与培养驯化阶段一致。如图2所示，混合菌群在pH为6.0-9.0范围内均有氧化分解效果，最适pH为6.0。pH大于6.0时，随pH升高氧化分解能力下降。pH为5.0时，虽接种时pH调整5.0，但反应体系内存在碱性物质释放，导致pH在24h后上升至6.5，同时出现部分二甲基甲酰胺分解，而再次调整pH为5.0后，即未再观察到pH上升和二甲基甲酰胺的分解，因此，pH为4.0和5.0时菌群失去氧化分解能力。

(3)二甲基甲酰胺浓度对菌群活性的影响

如图3所示，图3(1)的二甲基甲酰胺体积浓度为0.2-1.0％，图3(2)的二甲基甲酰胺体积浓度为2-8％；试验分两次完成，第一次设置5个浓度梯度：0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1.0％，第二次设置4个浓度梯度：2％、4％、6％和8％，接种率均为30％，其余组分及控制条件与培养驯化阶段一致，同时大幅延长培养周期。如图3所示，混合菌群对二甲基甲酰胺的最大耐受浓度为6％，二甲基甲酰胺体积浓度超过8％混合菌群丧失二甲基甲酰胺分解能力，另外，长周期条件下，氨氮浓度超过2000mg/L时，菌群仍具备二甲基甲酰胺分解能力。

本发明所获得的混合菌群DMF最大耐受浓度达到体积浓度为6％(质量浓度约为56.88g/L)，远大于现有背景技术中公开报道的细菌耐受浓度，具有显著的应用价值。

(4)菌群对二甲基乙酰胺的可降解性研究

如图4所示，试验共设置6个二甲基乙酰胺体积浓度：1％、2％、4％、6％、8％和10％，培养基不投加二甲基甲酰胺，其余组分及控制条件与培养驯化阶段一致，同时大幅延长培养周期。如图4所示，经一周(7d)培养，混合菌群即显示具备二甲基乙酰胺分解能力。2％二甲基乙酰胺浓度时，分解效果最好，6％二甲基乙酰胺浓度时，菌群仅存极低的分解能力。超过6％，混合菌群完全丧失二甲基乙酰胺分解能力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种用于分解二甲基甲酰胺的菌群，其特征在于，包括：短波单胞菌、类短短芽孢杆菌、无色杆菌、黄杆菌、寡养食单胞菌、苍白杆菌、水微菌、鞘脂杆菌与类诺卡氏菌。

2.根据权利要求1所述的用于分解二甲基甲酰胺的菌群，其特征在于，按照质量份计包括：短波单胞菌20-25份、类短短芽孢杆菌8-12份、无色杆菌2-5份、黄杆菌20-25份、寡养食单胞菌8-12份、苍白杆菌2-5份、水微菌5-8份、鞘脂杆菌4-5份与类诺卡氏菌10-15份。

3.一种如权利要求1-2中任一项所述的用于分解二甲基甲酰胺的菌群的培养方法，其特征在于，包括步骤：

从活性污泥中分离出沉淀物，将其置于容器中，旋转容器，将沉淀物打散形成菌液；

将菌液接种入含有二甲基甲酰胺的培养基，形成菌群培养基；

在菌群培养基中培养出用于分解二甲基甲酰胺的菌群。

4.根据权利要求3所述的用于分解二甲基甲酰胺的菌群的培养方法，其特征在于，所述菌群培养基包括菌液、二甲基甲酰胺、氯化钙、硫酸亚铁与营养液。

5.根据权利要求4所述的用于分解二甲基甲酰胺的菌群的培养方法，其特征在于，所述营养液包括K2HPO4、MgSO4·7H2O与牛肉膏。

6.根据权利要求4所述的用于分解二甲基甲酰胺的菌群的培养方法，其特征在于，所述二甲基甲酰胺占所述菌群培养基的体积百分含量为0-6％。

7.根据权利要求3所述的用于分解二甲基甲酰胺的菌群的培养方法，其特征在于，通过向二甲基甲酰胺的菌群培养基内添加酸或碱，以调节所述菌群培养基的pH为6.0-9.0。

8.根据权利要求4所述的用于分解二甲基甲酰胺的菌群的培养方法，其特征在于，所述菌液占所述菌群培养基的体积百分含量为10-50％。

9.根据权利要求3所述的用于分解二甲基甲酰胺的菌群的培养方法，其特征在于，还包括将容器置于摇床内进行旋转混合。

10.根据权利要求3所述的用于分解二甲基甲酰胺的菌群的培养方法，其特征在于，还包括将菌群培养基置于摇动混合温度为25-35℃的摇床中。