CN111454847A - 一种淡紫拟青霉的固体发酵方法及固体发酵培养基 - Google Patents

一种淡紫拟青霉的固体发酵方法及固体发酵培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种淡紫拟青霉的固体发酵方法及固体发酵培养基，涉及农用微生物技术领域。其包括如下步骤：将含有淡紫拟青霉的种子菌液接种于固体培养基中发酵培养。采用固体发酵方法克服了液体发酵法制得的产品不便于运输和储存的缺陷，采用固体发酵法发酵生产淡紫拟青霉具有生产成本低、制得的产品保质期长、产品的活孢子数多的优势。此外，采用固体发酵的方法不会产生废液污染环境，极大提升了运输便利性。

Description

一种淡紫拟青霉的固体发酵方法及固体发酵培养基
技术领域
本发明涉及农用微生物技术领域，具体而言，涉及一种淡紫拟青霉的固体发酵方法及固体发酵培养基。
背景技术
植物线虫病是严重影响作物生长的主要病害之一，每年植物寄生线虫给全球农业造成的损失高达千亿美元，目前化学杀虫剂虽然能有效防治植物线虫病，但化学杀虫剂的生产和使用也给环境和土壤带来严重污染，同时化学药物的残留也对人类的健康构成威胁。而生物防治剂具有安全环保的优点，成为防治线虫研究的热点。
淡紫拟青霉是一种广泛分布于土壤和植物根系的习居菌，能寄生于根结线虫、孢囊线虫等植物线虫上，在侵染线虫过程中可通过菌丝机械压力和分泌的胞外酶联合作用，使线虫卵和虫体破裂而死，是一种具有防治植物线虫作用的生物防治菌株。
淡紫拟青霉现已成为我国开发的杀虫真菌之一，目前市场上通常采用液体深层发酵生产技术生产淡紫拟青霉，制成商品菌剂。液体深层发酵的产品存在不便于运输和储存、生产成本高、产品保质期短、产品的活孢子数少等缺陷。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种淡紫拟青霉的固体发酵方法及固体发酵培养基以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
一种淡紫拟青霉的固体发酵方法，其包括如下步骤：将含有淡紫拟青霉的种子菌液接种于固体培养基中发酵培养，固体培养基包括如下重量百分比的原料：麸皮50-55％，粗糠3-5％，细糠3-5％，玉米粉15-20％和大米15-20％。
上述固体培养基原料选自农副产品，具有生产成本低廉的优势。
在本发明应用较佳的实施例中，上述固体培养基的含水量为 50-60％。保证固体培养基一定的含水量以保证菌体的湿度。含水量为质量百分比。
本发明提供的固体发酵方法克服了液体发酵法制得的产品不便于运输和储存的缺陷，采用固体发酵法发酵生产淡紫拟青霉具有生产成本低、制得的产品保质期长、产品的活孢子数多的优势。采用固体发酵的方法不会产生废液污染环境，极大提升了运输便利性。
本发明使用的淡紫拟青霉菌为淡紫拟青霉DS09，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间:2017年5月31 日，保藏登记号为CGMCCNo.13898。生物保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名：淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。
在本发明应用较佳的实施例中，上述固体发酵方法还包括制备含有淡紫拟青霉的种子菌液，含有淡紫拟青霉的种子菌液的制备方法包括如下步骤：将淡紫拟青霉菌饼接种于一级种子液培养基，培养后再将一级种子液接种于二级种子液培养基中培养。
通过种子液的培养以使得淡紫拟青霉初步扩培，以利于后续固体发酵培养。
在本发明应用较佳的实施例中，上述在一级种子液培养基中的培养条件为：100-130r/min的转速下，26-28℃震荡培养72-96h。
通过震荡培养以加快菌丝的繁殖速度，使淡紫拟青霉菌快速繁殖到对数生长期。若培养时间过长，会导致死菌过多，影响繁殖效率。
在本发明应用较佳的实施例中，上述二级种子液培养基以体积百分比5-8％为接种量，将一级种子液接种于种子罐进行发酵。
在种子罐中进行扩大培养，确保得到足够菌体浓度的淡紫拟青霉。在上述接种量范围内，可以保证后续种子罐内淡紫拟青霉菌
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且但接种量过大会过多移入代谢废物，也不经济；但接种量过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。
在本发明应用较佳的实施例中，在二级种子液培养基中的培养条件为：在种子罐中通入无菌空气，26-28℃下，培养72-96h。
在上述培养条件下，可以保证发酵过程高效的进行。发酵温度过低或过高都会影响菌体的代谢活性。
在本发明应用较佳的实施例中，上述一级种子液培养基包括如下重量份数的原料：蛋白胨30-40份，磷酸氢二钾0.2-0.5份，氯化钠 0.5-0.8份，七水硫酸镁0.5-0.8份，蔗糖15-20份和碳酸钙0.5-0.8份。
在本发明应用较佳的实施例中，上述原料还包括12-19份的甘油和1000-1200份的水。
在本发明应用较佳的实施例中，上述二级种子液培养基包括如下重量份数的原料：蛋白胨20-30份，磷酸氢二钾0.2-0.5份，氯化钠 0.5-0.8份，七水硫酸镁0.5-0.8份，蔗糖15-20份，碳酸钙0.5-0.8份，玉米粉10-15份和小米粉10-15份。
在本发明应用较佳的实施例中，上述原料还包括12-19份的甘油、 0.1-0.2ml的消泡剂和1000-1200份的水。
本发明提供的一级种子液培养基和二级种子液培养基均为发明人长期摸索选取的最佳配方。蛋白胨为菌丝生长提供必要的氮源，磷酸氢二钾，氯化钠，七水硫酸镁和碳酸钙为菌丝生长提供必要的K 源、Na源、镁离子和钙离子。蔗糖为菌丝生长提供必要的糖源。
玉米粉和小米粉为菌丝生长提供必要的蛋白质。
本发明提供的发酵培养基原料易得，以农副产品为主，生产成本低，同时又可以为淡紫拟青霉的生长产孢提供有利养分。
在本发明应用较佳的实施例中，在制备含有淡紫拟青霉的种子菌液前还包括菌种的活化。
通过菌种的活化步骤以使得冻存状态的菌株复壮，以节约发酵时间。
在本发明应用较佳的实施例中，上述菌种的活化包括如下步骤：将淡紫拟青霉菌株接种于固体培养基上培养。
在本发明应用较佳的实施例中，上述培养条件为26-28℃恒温培养72-120h。
在本发明应用较佳的实施例中，上述将含有淡紫拟青霉的种子菌液接种于固体培养基中发酵培养的方法包括：将二级种子液接种于固体培养基中，并将接种的固体培养基平摊至料盘中进行发酵。
将二级种子液接种于固体培养基中进行发酵培养，利用菌体浓度大，培养基养分足的优势，使得淡紫拟青霉快速发酵。本发明提供的方法极大缩短了发酵时间，缩短了发酵周期。
在本发明应用较佳的实施例中，上述固体培养基以质量百分比 5-10％为接种量，将二级种子液接种于固体培养基进行发酵。
在本发明应用较佳的实施例中，上述固体培养基的平摊厚度为 3-5cm。
在本发明应用较佳的实施例中，上述固体发酵方法还包括将料盘置于固体发酵房中发酵。
在本发明应用较佳的实施例中，上述发酵培养条件为：通氧量设定为每30-40min通氧5-10min，温度26-28℃，发酵时间72-80h。
在其他实施例中，上述发酵培养条件可以根据需要进行适当调整。
在本发明应用较佳的实施例中，上述固体发酵的方法还包括将发酵的产物进行风干，制得淡紫拟青霉发酵成品。发酵成品的活菌含量为1×1010cfu/g-1.5×1010cfu/g。
本发明提供的固体发酵方法培养的产物具有活菌含量高的优势，常规的液体发酵法培养的产物的活菌含量仅为本发明的十分之一。
在本发明应用较佳的实施例中，上述风干为自然风干或恒温干燥制得成品。
一种固体发酵培养基，其包括如下重量百分比的原料：麸皮 50-55％，粗糠3-5％，细糠3-5％，玉米粉15-20％和大米15-20％。该固体发酵培养基原料取自农副产品，成本低廉。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种淡紫拟青霉的固体发酵方法。采用固体发酵方法克服了液体发酵法制得的产品不便于运输和储存的缺陷，采用固体发酵法发酵生产淡紫拟青霉具有生产成本低、制得的产品保质期长、产品的活孢子数多的优势。此外，采用固体发酵的方法不会产生废液污染环境，极大提升了运输便利性。固体培养基原料选自农副产品，具有生产成本低廉的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中种子罐二次发酵得到的二级种子液稀释109后的菌落平板图；
图2为实施例1中的二级种子液不同稀释倍数下的菌落数统计表。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种淡紫拟青霉的固体发酵方法，其包括如下依次进行的步骤：
(1)菌种的活化。菌种选自淡紫拟青霉DS09，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间：2017年5月31 日，保藏登记号为CGMCCNo.13898。
将低温保存的淡紫拟青霉菌株接种于固体平板培养基上，于 26℃恒温培养72h备用。
固体平板培养基包括如下重量百分比的原料：麸皮50％，粗糠 5％，细糠5％，玉米粉20％和大米20％。固体平板培养基的含水量为 60％。
(2)种子液培养:
一级液体种子培养基的配方为：蛋白胨40g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.5g，7H2O硫酸镁0.5g，甘油15mL，蔗糖15g，碳酸钙 0.5g，水1000mL。
二级种子液培养基的配方为：蛋白胨20g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.5g，7H2O硫酸镁0.5g，甘油15mL，蔗糖15g，碳酸钙 0.5g，玉米粉10g，小米粉10g，水1000mL，消泡剂0.1mL。
摇瓶发酵培养：在无菌条件下，接种步骤(1)制得的5×5mm 菌饼8块于250mL一级液体种子培养基中，以120r/min的转速、26℃下震荡培养72h，得到一级种子液。
种子罐二次发酵：以体积比5％的接种量，将一级种子液接种于种子罐进行二次发酵，接种后持续通入无菌空气，在26℃下，培养 72h得到二级种子液。
将二级种子液分别稀释至106、107、108和109，涂布平板，培养，统计其菌落数。稀释倍数为109菌落平板图参照图1所示，二级种子液不同稀释倍数下的菌落数统计表参照图2所示。
(3)以5％的质量比的接种量，将步骤(2)的二级种子液接种于固体培养基中。
固体培养基包括如下重量百分比的原料：麸皮50％，粗糠5％，细糠5％，玉米粉20％和大米20％。固体平板培养基的含水量为60％。
将接种好的固体培养基以3-5cm的厚度平摊于料盘中，再将料盘置于无菌的固体发酵房铁架上发酵，发酵培养条件为：通氧量设定为每30-40min通氧5min，通氧时间为5-10min，温度26℃，发酵时间72h。
(4)发酵产物分离晾干。
将发酵结束后，产物经过10-15d自然风干，在风干过程中，取样镜检和水分测定，含水率低于8％时，风干过程即结束，收集发酵产物粉碎过80目筛，所得粉末即为含淡紫拟青霉活菌的固体发酵成品。
(5)菌落计数。
利用系列稀释法对含淡紫拟青霉活菌的固体发酵成品进行菌落计数，结果显示：有效活菌数为1×1010cfu/g-1.5×1010cfu/g。
实施例2
本实施例提供了一种淡紫拟青霉的固体发酵方法，其包括如下依次进行的步骤：
(1)菌种的活化。菌种选自淡紫拟青霉DS09，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间：2017年5月31 日，保藏登记号为CGMCCNo.13898。
将低温保存的淡紫拟青霉菌株接种于固体平板培养基上，于 27℃恒温培养120h备用。
固体平板培养基包括如下重量百分比的原料：麸皮55％，粗糠 3％，细糠3％，玉米粉15％和大米15％。固体平板培养基的含水量为 60％。
(2)种子液培养:
一级液体种子培养基的配方为：蛋白胨30g，磷酸氢二钾0.3g，氯化钠0.8g，7H2O硫酸镁0.8g，甘油12mL，蔗糖20g，碳酸钙0.8 g，水1000mL。
二级种子液培养基的配方为：蛋白胨30g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠0.8g，7H2O硫酸镁0.8g，甘油10mL，蔗糖20g，碳酸钙0.8 g，玉米粉15g，小米粉15g，水1000mL，消泡剂0.2mL。
摇瓶发酵培养：在无菌条件下，接种步骤(1)制得的5×5mm 菌饼8块于250mL一级液体种子培养基中，以130r/min的转速、27℃下震荡培养120h，得到一级种子液。
种子罐二次发酵：以体积比7％的接种量，将一级种子液接种于种子罐进行二次发酵，接种后持续通入无菌空气，在27℃下，培养 120h得到二级种子液。
(3)以7％的质量比的接种量，将步骤(2)的二级种子液接种于固体培养基中。
固体培养基包括如下重量百分比的原料：麸皮55％，粗糠3％，细糠3％，玉米粉15％和大米15％。固体平板培养基的含水量为60％。
将接种好的固体培养基以3-5cm的厚度平摊于料盘中，再将料盘置于无菌的固体发酵房铁架上发酵，发酵培养条件为：通氧量设定为每30-40min通氧5min，通氧时间为5-10min，温度27℃，发酵时间72h。
(4)发酵产物分离晾干。
将发酵结束后，产物经过10-15d自然风干，在风干过程中，取样镜检和水分测定，含水率低于8％时，风干过程即结束，收集发酵产物粉碎过80目筛，所得粉末即为含淡紫拟青霉活菌的固体发酵成品。
(5)菌落计数。
利用系列稀释法对含淡紫拟青霉活菌的固体发酵成品进行菌落计数，结果显示：有效活菌数为1×1010cfu/g-1.5×1010cfu/g。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种淡紫拟青霉的固体发酵方法，其特征在于，其包括如下步骤：将含有淡紫拟青霉的种子菌液接种于固体培养基中发酵培养，所述固体培养基包括如下重量百分比的原料：麸皮50-55％，粗糠3-5％，细糠3-5％，玉米粉15-20％和大米15-20％。
2.根据权利要求1所述的固体发酵方法，其特征在于，所述固体培养基含质量百分比50-60％的水。
3.根据权利要求2所述的固体发酵方法，其特征在于，所述固体发酵方法还包括制备含有淡紫拟青霉的种子菌液，含有淡紫拟青霉的种子菌液的制备方法包括如下步骤：将淡紫拟青霉菌饼接种于一级种子液培养基，培养后再将一级种子液接种于二级种子液培养基中培养；
优选的，在所述一级种子液培养基中的培养条件为：100-130r/min的转速下，26-28℃震荡培养72-96h；
优选的，所述二级种子液培养基以体积百分比5-8％为接种量，将一级种子液接种于种子罐进行发酵；
更优选的，在所述二级种子液培养基中的培养条件为：在种子罐中通入无菌空气，26-28℃下，培养72-96h。
4.根据权利要求3所述的固体发酵方法，其特征在于，所述一级种子液培养基包括如下重量份数的原料：蛋白胨30-40份，磷酸氢二钾0.2-0.5份，氯化钠0.5-0.8份，七水硫酸镁0.5-0.8份，蔗糖15-20份和碳酸钙0.5-0.8份；
优选的，所述原料还包括12-19份的甘油和1000-1200份的水。
5.根据权利要求3所述的固体发酵方法，其特征在于，所述二级种子液培养基包括如下重量份数的原料：蛋白胨20-30份，磷酸氢二钾0.2-0.5份，氯化钠0.5-0.8份，七水硫酸镁0.5-0.8份，蔗糖15-20份，碳酸钙0.5-0.8份，玉米粉10-15份和小米粉10-15份；
优选的，所述原料还包括12-19份的甘油、0.1-0.2ml的消泡剂和1000-1200份的水。
6.根据权利要求3所述的固体发酵方法，其特征在于，在制备含有淡紫拟青霉的种子菌液前还包括菌种的活化；
优选的，所述菌种的活化包括如下步骤：将淡紫拟青霉菌株接种于固体培养基上培养；
优选的，培养条件为26-28℃恒温培养72-120h。
7.根据权利要求6所述的固体发酵方法，其特征在于，将含有淡紫拟青霉的种子菌液接种于固体培养基中发酵培养的方法包括：将二级种子液接种于固体培养基中，并将接种的固体培养基平摊至料盘中进行发酵；
优选的，固体培养基以质量百分比5-10％为接种量，将二级种子液接种于固体培养基进行发酵；
优选的，固体培养基的平摊厚度为3-5cm。
8.根据权利要求7所述的固体发酵方法，其特征在于，所述固体发酵方法还包括将料盘置于固体发酵房中发酵；
优选的，发酵培养条件为：通氧量设定为每30-40min通氧5-10min，温度26-28℃，发酵时间72-80h。
9.根据权利要求1所述的固体发酵方法，其特征在于，所述固体发酵的方法还包括将发酵的产物进行风干，制得淡紫拟青霉发酵成品；
发酵成品的活菌含量为1×1010cfu/g-1.5×1010cfu/g。
10.一种用于培养淡紫拟青霉的固体发酵培养基，其特征在于，其包括如下重量百分比的原料：麸皮50-55％，粗糠3-5％，细糠3-5％，玉米粉15-20％和大米15-20％。
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