CN111235039B

CN111235039B - 一种用于培养高毒力金龟子绿僵菌的培养基及其制剂和应用

Info

Publication number: CN111235039B
Application number: CN202010146358.0A
Authority: CN
Inventors: 胡飞; 徐丽娜; 胡本进; 苏贤岩; 任学祥; 周子燕; 陈浩梁; 钟永志; 苏卫华; 戚仁德
Original assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN111235039A

Abstract

本发明公开了一种用于培养高毒力金龟子绿僵菌的培养基及其制剂和应用，属于植物保护技术领域。所述培养基由以下组分组成：麦麸、稻壳、大米粉、玉米粉、虫体冻干粉、磷酸氢二钾、硫酸锰、氯化钙、水。本发明在传统的培养基中引入了草地贪夜蛾虫体冻干粉，这不仅能提高金龟子绿僵菌NG‑Ma040对草地贪夜蛾的毒力，而且对产孢量的影响不显著。同时，麦麸、稻壳、大米粉、玉米粉、磷酸氢二钾、硫酸锰及氯化钙等各组分之间的协同配合，进一步提高对草地贪夜蛾的毒力，提升对草地贪夜蛾幼虫的侵染率和防治效果的作用。此外，本发明的培养基可以制作成金龟子绿僵菌制剂并用于防治防治草地贪夜蛾。

Description

一种用于培养高毒力金龟子绿僵菌的培养基及其制剂和应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体地说，涉及一种用于培养高毒力金龟子绿僵菌的培养基及其制剂和应用。

背景技术

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)属于子囊菌门、肉座菌目、麦角菌科、绿僵菌属，是一种广谱性的杀虫真菌。在自然界中主要进行无性繁殖，由昆虫体壁进行主动入侵而感染不同昆虫，在昆虫血腔中可进行酵母状繁殖，产生大量虫菌体，同时可产生破坏素(des tuxin，非核糖体多肽类毒素)等杀虫毒素，抑制昆虫免疫、加速杀虫。已经发现金龟子绿僵菌能够寄生的昆虫有200余种，对有些害虫已开发出绿僵菌杀虫剂，并收到良好防治效果。

随着草地贪夜蛾在我国定殖，防治由外来入侵害虫的应急防控迅速转为重要害虫的长期防控工作，生物防治具有不污染环境、持续控制效果好的特点，将发挥越来越重要的作用，研究表明金龟子绿僵菌对草地贪夜蛾具有良好的生防潜能，不易产生抗药性，因此利用金龟子绿僵菌将是重要的生物防治手段。

目前国内外发酵金龟子绿僵菌的方法主要有液体深层发酵、固体发酵和液固双相发酵。而液固两相发酵过程包括液体发酵和固体发酵2个阶段，充分结合了两者之长，利用液体发酵快速生产大量的菌丝体或芽生孢子，再转到固体营养或惰性基质上使其产生最接近自然接种体形态的气生分生孢子。该方法最大限度地利用了液体培养的优点，先生产大量的菌丝或芽生孢子，缩短了菌丝生长周期，也避免了前期污染的问题，生产方法简便、能耗和成本低，同时固相发酵产孢克服了液相发酵所产芽生孢子的环境稳定性差等缺点，因此被广泛用于金龟子绿僵菌等杀虫真菌的批量生产。

毒力、侵染力、防效效果等是决定金龟子绿僵菌菌株应用前景的重要因素。目前金龟子绿僵菌发酵基质中，多采用廉价的麦麸、玉米粉、大米粉等农副产品为营养物质，同时添加无机盐促进菌丝生长，以达到最大孢子产量。优化基质组合过程中，几乎没有把提高金龟子绿僵菌毒力、侵染力、防效效果等作为指标来考量，仅仅以孢子产量为目标。

金龟子绿僵菌NG-Ma040由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所生物防治团队从宁国玉米种植区调查发现田间有疑似感染虫生真菌的草地贪夜蛾僵虫中分离鉴定获得，保藏号为CGMCC NO.19273，2020年1月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

草地贪夜蛾作为金龟子绿僵菌NG-Ma040寄主，菌株可在草地贪夜蛾虫体上不断繁殖复壮，通过人工饲养获得幼虫，经处理后可以作为发酵基质的重要组份。为了更好的发挥金龟子绿僵菌NG-Ma040菌株生防潜力，研究出一种培养高毒力金龟子绿僵菌NG-Ma040的方法，达到保持高产孢量和提高菌株毒力、侵染力、防效效果的目的，是一项亟待解决的技术问题。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有技术尚无无法有效提高金龟子绿僵菌的毒力并用于防治草地贪夜蛾的问题，本发明提供一种用于培养高毒力金龟子绿僵菌的培养基及其制剂和应用，它可以有效提高金龟子绿僵菌的毒力并用于防治草地贪夜蛾。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种用于培养高毒力金龟子绿僵菌的培养基，所述培养基包括以下组分，以质量百分比计，

麦麸：5％-20％，

稻壳：10％-30％，

大米粉：25％-40％，

玉米粉：10％-25％，

虫体冻干粉：0.4％-0.5％，

磷酸氢二钾：0.1％-0.5％，

硫酸锰：0.1％-0.4％，

氯化钙：0.1％-0.4％，

水：19％；

所述虫体冻干粉为草地贪夜蛾虫体冻干粉。

优选地，所述培养基包括以下组分，以质量百分比计，

麦麸：15％，

稻壳：15％，

大米粉：30％，

玉米粉：20％，

虫体冻干粉：0.5％，

磷酸氢二钾：0.2％，

硫酸锰：0.2％，

氯化钙：0.1％，

水：19％。

优选地，所述培养基包括以下组分，以质量百分比计，

麦麸：15％，

稻壳：10％，

大米粉：35％，

玉米粉：20％，

虫体冻干粉：0.5％，

磷酸氢二钾：0.1％，

硫酸锰：0.2％，

氯化钙：0.1％，

水：19％。

优选地，所述金龟子绿僵菌的保藏号为CGMCC NO.19273，2020年1月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

一种金龟子绿僵菌制剂，由上述所述培养基培养并辅以助剂制得，所述制剂的剂型是可分散油悬浮剂。

优选地，所述制剂包括以下组分，以质量百分比计，

金龟子绿僵菌孢子粉 5×10⁹孢子/g，

EL10 6％，

T-40 4％，

十二烷基苯磺酸钙 4％，

独脚金内酯 0.03％，

有机硅消泡剂 0.5％，

硅酸镁铝 0.5％，

黄原胶 0.1％，

菜籽油余量。

一种如上述所述培养基在防治草地贪夜蛾上的应用。

一种如上述所述金龟子绿僵菌制剂在防治草地贪夜蛾上的应用。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明在传统的培养基中引入了草地贪夜蛾虫体冻干粉，这不仅能提高金龟子绿僵菌N G-Ma040对草地贪夜蛾的毒力，而且对产孢量的影响不显著。同时，麦麸、稻壳、大米粉、玉米粉、磷酸氢二钾、硫酸锰及氯化钙等各组分之间的协同配合，进一步提高对草地贪夜蛾的毒力，提升对草地贪夜蛾幼虫的侵染率和防治效果的作用。因此，本发明的培养基可以有效提高金龟子绿僵菌的毒力并用于草地贪夜蛾的防治上。此外，本发明的培养基可以制作成金龟子绿僵菌制剂并用于防治防治草地贪夜蛾。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

材料与方法

1、材料

金龟子绿僵菌NG-Ma040(Metarhizium anisopliae)：由本试验室土壤中分离自草地贪夜蛾僵虫，并保存；所述金龟子绿僵菌的保藏号为CGMCC NO.19273，2020年1月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

草地贪夜蛾虫体冻干粉：由实验室饲养的6龄幼虫经超低温冷冻干燥，搅拌粉碎后获得。

液体种子培养基：以质量百分比计，酵母浸出粉1％，葡萄糖4％，蛋白胨1％，氯化钙0. 2％，磷酸氢二钾0.2％。

发酵培养基用原料及无机盐：麦麸，稻壳，大米粉，玉米粉，虫体冻干粉，磷酸氢二钾，硫酸锰，氯化钙，水。

主要设备：蒸气消毒器、超净工作台、控温摇床、控温生化培养箱、天平、显微镜、孢子收集器。

2、方法

2.1 孢子计数：将发酵完成后收集的孢子粉从培养基上的玻璃纸上刮下，放入到100mL 的锥形瓶中，加入含有0.05％吐温-80的无菌水，在磁力搅拌器上搅30min，使孢子充分分散，配成均匀孢子悬浮液，用血球板计数法确定孢子含量。

2.2 LC₅₀值测定：采用浸虫法。将金龟子绿僵菌NG-Ma040孢子粉用0.05％吐温-80的无菌水溶液等比稀释成试验浓度，依次为10¹⁰个/mL，10⁹个/mL，10⁸个/mL，10⁷个/mL，10⁶个/mL。挑选虫龄大小一致的草地贪夜蛾2龄幼虫，于各系列浓度药液中浸渍20s，以0.05％吐温-80水溶液为对照。处理后幼虫用滤纸吸取多余药液，将试虫转移至玉米叶片上饲养，如叶片吃完及时补充，7d后以虫子僵化为死虫，调查死亡情况，计算LC₅₀值。

2.3 试验设计

2.3.1 草地贪夜蛾虫体冻干粉对金龟子绿僵菌NG-Ma040孢子量和LC₅₀值的影响

按照表1组分配比(以质量百分比计)，在培养基中加入不同含量草地贪夜蛾虫体冻干粉，确定草地贪夜蛾虫体冻干粉对金龟子绿僵菌NG-Ma040孢子量和LC₅₀值的影响。

表1 虫体冻干粉培养基组分配比

从表2试验结果可知：以麦麸、大米粉、玉米粉为基质的培养基加入草地贪夜蛾虫体冻干粉后，LC₅₀值显著降低，草地贪夜蛾虫体冻干粉可提高金龟子绿僵菌NG-Ma040对草地贪夜蛾的毒力。

表2 虫体冻干粉培养基孢子量及对草地贪夜蛾LC₅₀值统计表

11个处理组的孢子量最高为1.13×10¹¹个/g，其最低为0.88×10¹¹个/g，差异不显著，由此可知添加草地贪夜蛾虫体冻干粉对孢子量影响不显著。而11个处理组LC₅₀值最高为2.18 ×10⁸个/mL，其最低为1.70×10⁸个/mL；其中处理组8-11与处理组1-6差异显著，而处理组 1-6之间差异不显著，由此可知添加草地贪夜蛾虫体冻干粉，可以显著降低LC₅₀值，提高对草地贪夜蛾的毒力；当草地贪夜蛾虫体冻干粉的添加量至0.5％时，LC₅₀值降低至最低，但随着添加量增加，LC₅₀值无显著降低。

2.3.2 金龟子绿僵菌NG-Ma040固体发酵工艺

按照表3组分配比，进行含草地贪夜蛾虫体冻干粉培养基的优化，以孢子量和LC₅₀值为指标，确定适合金龟子绿僵菌NG-Ma040的最佳培养配方。

将保存的金龟子绿僵菌NG-Ma040接入液体种子培养基中，培养4d，待培养基混浊，出现菌丝球时停止培养待用。按表3处理将各组分与水混合搅拌均匀，静置4h后，装袋高压灭菌45min，待温度降到30℃左右后接入液体种子培养基，接种体积量为10％，搅拌混匀后，发酵培养，28℃发酵120h后，取样检查生长情况，待产孢完全后，停止发酵，收集孢子粉并测定孢子含量及对草地贪夜蛾LC₅₀值。

表3 12种固体发酵培养基组分配比

从表4试验结果可知：通过添加稻壳、磷酸氢二钾、硫酸锰、氯化钙等优化组分配比后，与表2结果相比，金龟子绿僵NG-Ma040的孢子量和毒力均获得提高。

不同组分配比的固体发酵培养基对金龟子绿僵NG-Ma040的孢子量影响差异较大，12个处理组孢子量最高为2.58×10¹¹个/g；最低为0.85×10¹¹个/g，添加草地贪夜蛾虫体冻干粉对孢子量影响不显著，而无稻壳组分处理组孢子量显著低于其它11个处理组，稻壳可让基质更好的附着，同时增加通气空隙，有利于促进产孢。

12个处理组LC₅₀值最高为1.88×10⁸个/mL；最低为1.28×10⁸个/mL；其中处理组1、1 0、11之间差异不显著，而与其它9个处理组相比差异显著，由此可知添加草地贪夜蛾虫体冻干粉，可以降低LC₅₀值，提高对草地贪夜蛾的毒力，发现当草地贪夜蛾虫体冻干粉添加量为0.5％时，即处理组1和11，对降低LC₅₀值的效果最显著，同时孢子量也较高。

表4 不同组分配比固体发酵培养基孢子量及对草地贪夜蛾LC₅₀值统计表

2.3.3 金龟子绿僵菌NG-Ma040孢子侵染率结果

按照表3中处理组1与处理组12培养基分别进行配比，培养获得金龟子绿僵菌NG-Ma0 40孢子粉，分别设置浓度为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸和1×10⁹孢子/g五个水平孢子悬浮液，共10个处理组，每组处理20头虫，4次重复。选用生长一致的草地贪夜蛾2-3龄幼虫，采用浸虫法用金龟子绿僵菌NG-Ma040孢子悬浮液处理，24h候检测幼虫带菌率。

从表5结果可知：随着金龟子绿僵菌NG-Ma040孢子浓度的升高，侵染率也相应升高。当金龟子绿僵菌NG-Ma040孢子浓度高于1×10⁶孢子/mL时，经表3中处理组1培养基培养 (含虫体冻干粉)获得的孢子侵染率要高于处理组12培养基(不含虫体冻干粉)。由此可知，添加草地贪夜蛾虫体冻干粉，有利于提升金龟子绿僵菌NG-Ma040孢子对草地贪夜蛾幼虫的侵染率。同时也说明，本发明的培养基可有效应用于草地贪夜蛾的防治上。

表5 金龟子绿僵菌NG-Ma040对草地贪夜蛾幼虫侵染率与孢子浓度水平的关系

2.3.4 金龟子绿僵菌NG-Ma040盆栽试验结果

按照表3中处理组1、处理组12培养基配比，培养获得金龟子绿僵菌NG-Ma040孢子粉，将黄原胶、硅酸镁铝在菜籽油中进行研磨至2um-3um，随后加入EL10、T-40、十二烷基苯磺酸钙、有机硅消泡剂及独脚金内酯进行混匀，接着加入上述孢子粉中，充分剪切、搅拌混匀，即得可分散油悬浮剂。上述操作过程实现了金龟子绿僵菌制剂的制备，通过培养基获得金龟子绿僵菌的孢子粉，并加以各种助剂以制得可分散油悬浮剂。

其中黄原胶、硅酸镁铝、菜籽油、EL10、T-40、十二烷基苯磺酸钙、独脚金内酯、有机硅消泡剂及孢子粉的用量配比如下，以质量百分比计，

金龟子绿僵菌孢子粉 5×10⁹孢子/g，

EL10 6％，

T-40 4％，

十二烷基苯磺酸钙 4％，

独脚金内酯 0.03％，

有机硅消泡剂 0.5％，

硅酸镁铝 0.5％，

黄原胶 0.1％，

菜籽油余量。

经室内盆栽获得的200株玉米苗，接入草地贪夜蛾2-3龄幼虫，每株2头。按照亩用制剂量150g茎叶喷施50亿孢子/mL的金龟子绿僵菌NG-Ma040可分散油悬浮剂，分别于7d、9d、14d、21d调查防治效果。

从表6结果可知：50亿孢子/mL的金龟子绿僵菌NG-Ma040可分散油悬浮剂在盆栽试验中对草地贪夜蛾具有较好的防治效果。药后同一时间，经表3处理组1培养基培养(含虫体冻干粉)获得的孢子加工的50亿孢子/mL的金龟子绿僵菌NG-Ma040可分散油悬浮剂防治效果要高于表3处理组12培养基(不含虫体冻干粉)。由此可知，添加草地贪夜蛾虫体冻干粉，有利于提升金龟子绿僵菌NG-Ma040孢子对草地贪夜蛾幼虫的防治效果。同时也说明，金龟子绿僵菌制剂可以有效防治草地贪夜蛾。

表6 金龟子绿僵菌NG-Ma040在草地贪夜蛾防治中的应用效果

结论：麦麸(5％-20％)、稻壳(10％-30％)、大米粉(25％-40％)、玉米粉(10％-25％)、磷酸氢二钾(0.1％-0.5％)、硫酸锰(0.1％-0.4％)、氯化钙(0.1％-0.4％)、草地贪夜蛾虫体冻干粉(0.4％-0.5％)、水(19％)是金龟子绿僵菌固体发酵基质较优组合；添加草地贪夜蛾虫体冻干粉至金龟子绿僵NG-Ma040发酵培养基中，能起到降低LC₅₀值、提高对草地贪夜蛾的毒力，提升对草地贪夜蛾幼虫的侵染率和防治效果的作用；同时对孢子产量无影响，目前文献报道中，尚未见到在金龟子绿僵菌培养组分中添加过。

综上所述，本发明在传统的培养基中引入了草地贪夜蛾虫体冻干粉，这不仅能提高金龟子绿僵菌NG-Ma040对草地贪夜蛾的毒力，而且对产孢量的影响不显著。同时，麦麸、稻壳、大米粉、玉米粉、磷酸氢二钾、硫酸锰及氯化钙等各组分之间的协同配合，进一步提高对草地贪夜蛾的毒力，提升对草地贪夜蛾幼虫的侵染率和防治效果的作用。因此，本发明的培养基可以有效提高金龟子绿僵菌的毒力并用于草地贪夜蛾的防治上。此外，本发明的培养基可以制作成金龟子绿僵菌制剂并用于防治防治草地贪夜蛾。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims

1.一种用于培养高毒力金龟子绿僵菌的培养基，其特征在于：所述培养基包括以下组分，以质量百分比计，

麦麸：5%-20%，

稻壳：10%-30%，

大米粉：25%-40%，

玉米粉：10%-25%，

虫体冻干粉：0.4%-0.5%，

磷酸氢二钾：0.1%-0.5%，

硫酸锰：0.1%-0.4%，

氯化钙：0.1%-0.4%，

水：19%；

所述虫体冻干粉为草地贪夜蛾虫体冻干粉；

所述金龟子绿僵菌的保藏号为CGMCC NO.19273，2020年1月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于：所述培养基包括以下组分，以质量百分比计，

麦麸：15%，

稻壳：15%，

大米粉：30%，

玉米粉：20%，

虫体冻干粉：0.5%，

磷酸氢二钾：0.2%，

硫酸锰：0.2%，

氯化钙：0.1%，

水：19%。

3.根据权利要求1所述培养基，其特征在于：所述培养基包括以下组分，以质量百分比计，

麦麸：15%，

稻壳：10%，

大米粉：35%，

玉米粉：20%，

虫体冻干粉：0.5%，

磷酸氢二钾：0.1%，

硫酸锰：0.2%，

氯化钙：0.1%，

水：19%。

4.一种金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：由权利要求1-3中任一项培养基培养并辅以助剂制得，所述制剂的剂型是可分散油悬浮剂；

5.根据权利要求4所述金龟子绿僵菌制剂，其特征在于：所述制剂包括以下组分，以质量百分比计，

金龟子绿僵菌孢子粉 5×10⁹孢子/g，

EL10 6%，

T-40 4%，

十二烷基苯磺酸钙 4%，

独脚金内酯 0.03%，

有机硅消泡剂 0.5%，

硅酸镁铝 0.5%，

黄原胶 0.1%，

菜籽油余量。

6.一种如权利要求1-3任一项所述培养基在防治草地贪夜蛾上的应用。

7.一种如权利要求4-5任一项所述金龟子绿僵菌制剂在防治草地贪夜蛾上的应用。