CN108570419A - 淡紫拟青霉的规模化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，包括如下步骤：将淡紫拟青霉菌株接种到灭菌后的液体培养基中进行种子培养得到液体种子；将所述的液体种子接种到以玉米芯粉为主要原料的固体培养基中进行固态发酵，所述的固体培养基经灭菌处理，接种量为1％－15％，得到发酵产物；将所述的发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。本发明提供的淡紫拟青霉的规模化制备方法具有成本低、环境要求低和生产工艺简单的优点。

Description

淡紫拟青霉的规模化制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种淡紫拟青霉的规模化制备方法。

背景技术

本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于 理解本发明的内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出 申请的申请日的现有技术。

淡紫拟青霉(Paeci lomyces lilacinus)是一种重要的生防农药，在人类的生活中 起着重要的作用。

目前淡紫拟青霉的制备方法对环境的要求较高，生产条件复杂，成本高，不利于大规模的生产。

发明内容

本发明实施例的目的是提供一种淡紫拟青霉的规模化制备方法，本发明提供的淡紫 拟青霉的规模化制备方法具有成本低、环境要求低和生产工艺简单的优点，有利于淡紫拟青霉的规模化生产。

本发明实施例的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明实施例提供了一种淡紫拟青霉的规模化制备方法，包括如下步骤：

将淡紫拟青霉菌株接种到灭菌后的液体培养基中进行种子培养得到液体种子；

将所述的液体种子接种到以玉米芯粉为主要原料的固体培养基中进行固态发酵，所 述的固体培养基经灭菌处理，接种量为1％－15％，得到发酵产物；

将所述的发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。

进一步的，所述的液体培养基由以下重量百分含量的原料制成：玉米粉0.01％－1％， 脲0.01％－1％，葡萄糖0.01％－3％，硫酸铵0.01％－2％，磷酸氢二铵0.01％－2％，酵 母粉0.01％－3％，余量为水。

进一步的，所述的固体培养基干料由以下重量百分含量的原料制成：玉米芯粉25％ －65％，麦麸5％－30％，玉米粉8％－40％，硫酸铵0.01％－2％；再将上述干料培养基与 水以1：0.5－1：3的比例混合，使固体培养基的含水量为30％－75％，完成固体培养基配备。

进一步的，所述的固态发酵包括第一固态发酵阶段和分盘发酵，所述的分盘发酵为： 在所述的固态发酵中淡紫拟青霉进入快速生长期、温度上升到30℃以上时，将半成品曲 料转移到不锈钢筛盘中继续发酵。

进一步的，所述的第一固态发酵阶段温度为20－30℃，湿度为50％－70％。

进一步的，所述的低温烘干的温度为25－45℃。

进一步的，所述的液体培养基的灭菌条件为115℃条件下灭菌15min。

进一步的，所述的固体培养基的灭菌处理为140－150℃灭菌0.01－0.2min。

进一步的，制备过程中所采用的设备材质为纯不锈钢材料。

借由上述方案，本发明淡紫拟青霉的规模化制备方法至少具有如下有益效果：

采用玉米芯粉为主要原料的固态培养基中的蓬松度高，有利于水分的吸收和保持， 从而大大降低了对培养环境湿度的要求。玉米芯粉来源于农产品废料、价格低廉。此外， 将玉米芯粉变废为宝，极具应用前景和推广价值。

生产效率高：分盘发酵增加了物料的表面积，利于供氧和废气排放，便于保温、保湿，便于随时观察和调整；同时，分盘培养对设备依赖度低，规模可大可小，便于复制 和放大。

采用本发明所述方法生产淡紫拟青霉，按国标GB20287检测方法计数其产孢量每克 含50－80亿个活孢子，其室温贮藏18个月后孢子萌发率仍能达到93％左右。

固态培养基中的硫酸铵和麦麸、玉米粉中的蛋白质等成分大大促进了玉米芯粉营养 的优化，液态培养基中的脲也可增加玉米芯粉中的氮含量，促进营养的均衡，为淡紫拟青霉的生长提供了氮源，利于淡紫拟青霉的产孢子。

固体培养基的灭菌采用的灭菌条件为140－150℃条件下灭菌0.01－0.2min，与常规的 100℃灭菌40－60min相比，瞬间灭菌大大降低了长时间高温对培养基的影响，维生素等 成分的保持率接近99％，而常规的灭菌方法会使培养基的营养损失很大。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步的详细介绍，应当理解，实施例是为了本领域 技术人员更容易理解本发明的技术方案，而不能作为本发明保护范围的限定。

在下述介绍中，术语“第一”、“第二”仅为用于描述的目的，而不能理解为指示 或暗示相对重要性。下述介绍提供了本发明的多个实施例，不同实施例之间可以替换或 者合并组合，因此本发明也可认为包含所记载的相同和/或不同实施例的所有可能组合。 因而，如果一个实施例包含特征A、B、C，另一个实施例包含特征B、D，那么本发明也 应视为包括含有A、B、C、D的一个或多个所有其他可能的组合的实施例，尽管该实施例 可能并未在以下内容中有明确的文字记载。

一种淡紫拟青霉的规模化制备方法，包括如下步骤：

将淡紫拟青霉菌株接种到灭菌后的液体培养基中进行种子培养得到液体种子；

将所述的液体种子接种到以玉米芯粉为主要原料的固体培养基中进行固态发酵，所 述的固体培养基经灭菌处理，接种量为1％－15％，得到发酵产物；

将所述的发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。

这里要说明的是：采用玉米芯粉为主要原料的固态培养基中的蓬松度高，有利于水 分的吸收和保持，从而大大降低了对培养环境湿度的要求。玉米芯粉来源于农产品废料、 价格低廉。此外，将玉米芯粉变废为宝，极具应用前景和推广价值。

上述方案已经可以实现淡紫拟青霉的规模化生产过程成本低、环境要求低和生产工 艺简单的目的，下面在此基础上给出优选方案。

本发明对液体培养基的具体成分不作限定，只要可以实现前期的种子发酵即可，作 为优选，在本发明的一些实施例中，液体培养基由以下重量百分含量的原料制成：玉米粉0.01％－1％，脲0.01％－1％，葡萄糖0.01％－3％，硫酸铵0.01％－2％，磷酸氢二铵0.01％－2％，酵母粉0.01％－3％，余量为水。

这里要说明的是，液体培养基中含有的脲、玉米粉、葡萄糖等成分可以使后期固态培养基的营养成分更加优化，增加粗蛋白和硫的含量，降低木质素、和纤维素的含量， 促进营养的均衡。

本发明对固态培养基的具体成分不作具体限定，只要以玉米芯粉为主料，使得培养 基具有更好的吸水和保水能力，降低对环境的要求即可，作为优选，在本发明的一些实施例中，固体培养基干料由以下重量百分含量的原料制成：玉米芯粉25％－65％，麦麸5％－30％，玉米粉8％－40％，硫酸铵0.01％－2％；再将上述干料培养基与水以1：0.5－1：3的比例混合，使固体培养基的含水量为30％－75％。

本发明对固态发酵的具体方式不作限定，只要可以实现淡紫拟青霉的培养即可，作 为优选，在本发明的一些实施例中，固态发酵包括第一固态发酵阶段和分盘发酵，分盘发酵为：在所述的固态发酵中淡紫拟青霉进入快速生长期、温度上升到30℃以上时，将 半成品曲料转移到不锈钢筛盘中继续发酵。

这里要说明的是：温度达到30℃以上、废气的大量产生、水分的丢失严重恶化了淡紫拟青霉的生长繁殖条件，导致传统发酵产品的各种酶活力低；分盘发酵增加了物料的 表面积，利于供氧和废气排放，便于保温、保湿，便于随时观察和调整；同时，分盘培 养对设备依赖度低，规模可大可小，便于复制和放大。

本发明对第一固态发酵阶段的具体培养参数不作具体限定，为了使产保孢量增加、 贮藏期延长，在本发明的一些实施例中，所述的第一固态发酵阶段温度为20－30℃，培养 基湿度为50％－70％。

这里要说明的是：由于固态培养基的主要成分是玉米芯粉，采用玉米芯粉为主要原 料的固态培养基中的蓬松度高，有利于水分的吸收和保持，从而大大降低了对培养环境湿度的要求。以往的淡紫拟青霉的固态培养对培养湿度的要求极高，环境湿度需要达到80％－99％，这样的湿度要求需要采用中央空调、温控系统和高压微雾加湿器进行控温控湿， 对培养环境提出了较高的要求。这样也使生产的成本和难度都大大增加，而限制了淡紫 拟青霉的大规模生产。本发明实施例中淡紫拟青霉的培养只需要物料湿度达到要求为50－70％，环境湿度不做严格要求，这样的湿度要求较原有的环境湿度要求大大降低了对环境的要求，这样的湿度要求不需要高成本的控温控湿系统，为淡紫拟青霉的量化生产 奠定了基础。

本发明对低温烘干的具体参数不作限定，为了保证更高的存活率和更好的制粉，在 本发明的一些实施例中，所述的低温烘干的温度为25－45℃。

对固体培养基的灭菌条件，本发明不作具体限定，为了保证更好的灭菌效果，在本发明的一些实施例中，所述的固体培养基的灭菌条件为140－150℃条件下灭菌 0.01－0.2min。

这里要说明的是：固体培养基的灭菌采用的灭菌条件为140－150℃条件下灭菌0.01－0.2min，与常规的100℃灭菌40－60min相比，瞬间灭菌大大降低了长时间高温对培养基的影响，维生素等成分的保持率接近99％，而常规的灭菌方法由于需要的灭菌时间很长，较长时间的高温会使培养基的营养损失很大，而常规的固体培养基采用140－150℃的温度0.01－0.2min的话会造成外部温度过高，内部难以灭菌，而本实施例中的固体培养 基中含有大量的玉米芯粉，培养基比较疏松，避免了这种现象，可以实现高温瞬时灭菌， 防止了长时间高温造成的营养损失。

对液体培养基的灭菌条件，本发明不作具体限定，为了保证灭菌效果，在本发明的一些实施例中，所述的液体培养基的灭菌处理为115℃灭菌15min。

对制备过程中采用的设备材质本发明不作具体限定，为了保证灭菌效果，在本发明 的一些实施例中，制备过程中所采用的设备材质为纯不锈钢材料。

保藏说明

淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，于2018年5月16日保藏在北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，生物保藏编号为CGMCCNo.15688。

下面是具体实施例

实施例1

本发明提供了一种淡紫拟青霉的规模化制备方法，包括以下步骤：

将保藏的淡紫拟青霉菌株接种于装有PDA斜面培养基的培养瓶中，26℃培养9d进行 活化培养，完成菌种活化；

接种到装有400mL液体培养基的1L摇瓶中，26℃、150rpm培养7d，接种量为2％； 将5个1L摇瓶中的种子液接种到装有60L液体培养基的100L种子发酵罐中，26℃、150rpm 培养6d；所述的液体培养基由以下重量百分含量的原料制成：玉米粉1％，脲0.01％， 葡萄糖3％，硫酸铵2％，磷酸氢二铵2％，酵母粉0.01％，余量为水。

这里要说明的是：增加液体培养基中硫的含量有助于增加固体培养过程中硫含量， 从而使其与固体培养基中的玉米芯粉进行作用，优化营养。

将固体培养基进行灭菌，灭菌条件为：140℃，0.2min；灭菌物料经破碎机，将结块或发粘的料块打散，再经凉料机冷却降温；所述的固体培养基干料由以下重量百分含量 的原料制成：玉米芯粉25％－65％，麦麸5％－30％，玉米粉8％－40％，硫酸铵0.01％－2％；再将上述干料培养基与水以1：2.3的比例混合，使固体培养基的含水量为70％。提高玉米芯粉的含量有助于提高固体培养基的蓬松度，还可以增加废物利用量，降低成本。

当物料温度降至28－30℃时，采用蒸球蒸料，接种机自动接种的方式，将种子发酵罐 中的种子液接种到固体培养基中，搅拌均匀后将初始含水量调至50％左右；

发酵产物进行低温烘干，烘至含水量在10％以下；

磨料制粉。

将固体培养后的菌料采用微生物固态培养真菌孢子分离设备收集淡紫拟青霉孢子， 将收集的孢子在显微镜下观察孢子形态，以确定为淡紫拟青霉孢子。

淡紫拟青霉产孢量按照GB 20287－2006检测方法测定为每克88亿个活孢子(干重)。 该淡紫拟青霉规模化生产工艺孢子产量高，发酵产品孢子损伤小，孢子活性维持时间长， 利于工业生产及应用。与现有的技术相比，孢子产量高出至少20％，而且，其室温贮藏18个月后孢子萌发率仍能达到93％左右，而现有的技术中，室温贮藏一年左右孢子萌发 率不足80％。

实施例2

本发明提供了一种淡紫拟青霉的规模化制备方法，包括以下步骤：

将保藏的淡紫拟青霉菌株接种于装有PDA斜面培养基的培养瓶中，28℃培养6d进行 活化培养，完成菌种活化；

接种到装有400mL液体培养基的1L摇瓶中，28℃、150rpm培养5d，接种量为5％； 将5个1L摇瓶中的种子液接种到装有60L液体培养基的100L种子发酵罐中，28℃、150rpm 培养5d；所述的液体培养基由以下重量百分含量的原料制成：玉米粉0.01％，脲0.01％， 葡萄糖0.01％，硫酸铵0.01％，磷酸氢二铵0.01％，酵母粉3％，余量为水。这里要说 明的是：增加酵母粉的含量有助于使发酵效果更好。

将固体培养基进行灭菌，灭菌条件为：140℃，0.2min；灭菌物料经破碎机，将结块或发粘的料块打散，再经凉料机冷却降温；所述的固体培养基干料由以下重量百分含量 的原料制成：玉米芯粉25％，麦麸20％，玉米粉15％，硫酸铵0.01％；再将上述干料 培养基与水以1：1.5的比例混合，使固体培养基的含水量为60％。

当物料温度降至28－30℃时，采用蒸球蒸料，接种机自动接种的方式，将种子发酵罐 中的种子液接种到固体培养基中，搅拌均匀后将初始含水量调至50％左右；

发酵产物进行低温烘干，烘至含水量在10％以下；

磨料制粉。

将固体培养后的菌料采用微生物固态培养真菌孢子分离设备收集淡紫拟青霉孢子， 将收集的孢子在显微镜下观察孢子形态，以确定为淡紫拟青霉孢子。

淡紫拟青霉产孢量按GB20287－2006检测方法测定为每克79亿个活孢子(干重)。该淡 紫拟青霉规模化生产工艺孢子产量高，发酵产品孢子损伤小，孢子活性维持时间长，利 于工业生产及应用。与现有的技术相比，孢子产量高出至少20％，而且，其室温贮藏15个月后孢子萌发率仍能达到95％左右，而现有的技术中，室温贮藏一年左右孢子萌发率 不足80％。

淡紫拟青霉规模化生产产品防治禾谷孢囊线虫病的田间试验：

菌种：所用淡紫拟青霉为本发明实施例1所制备的常温保藏18个月后的淡紫拟青霉。

实验地：河北省小麦发病严重的地块，按照常规方法播种。

处理：试验共有3组。即，对照组：喷洒清水10kg/ha；淡紫拟青霉组：喷洒淡紫拟 青霉规模化生产菌剂10kg/ha；现有技术对照组：喷洒现有技术制备的淡紫拟青霉(常温 保藏18个月)10kg/ha(ha为面积单位：公顷)。每个试验组做6个小区重复取平均值。

虫口调查方法：每个小区进行随机10个点取样，每点取10株，染色调查根内幼虫数，染色方法详见刘维志(1998)，根据幼虫数计算相对防效。

相对防效计算公式：

相对防效(％)＝(对照组幼虫数一处理组幼虫数)/对照组幼虫数

田间试验结果：

表1淡紫拟青霉规模化生产产品对禾谷孢囊线虫病的田间防效

由表1可知，本发明方法制备的淡紫拟青霉在保藏较长时间(18个月)后，田间防效仍较好，而且明显高于保藏时间相同的现有技术制备的淡紫拟青霉。

本发明中未曾限定的手段均为本领域技术人员可以根据现有技术可以实现的，本领 域技术人员可以根据需要选择，在此不再赘述。

以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术 人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将淡紫拟青霉菌株接种到灭菌后的液体培养基中进行种子培养得到液体种子；

将所述的液体种子接种到以玉米芯粉为主要原料的固体培养基中进行固态发酵，所述的固体培养基经灭菌处理，接种量为1％－15％，得到发酵产物；

将所述的发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。

2.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于，所述的液体培养基由以下重量百分含量的原料制成：玉米粉0.01％－1％，脲0.01％－1％，葡萄糖0.01％－3％，硫酸铵0.01％－2％，磷酸氢二铵0.01％－2％，酵母粉0.01％－3％，余量为水。

3.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于：所述的固体培养基干料由以下重量百分含量的原料制成：玉米芯粉25％－65％，麦麸5％－30％，玉米粉8％－40％，硫酸铵0.01％－2％；再将上述干料培养基与水以1：0.5－1：3的比例混合，使固体培养基的含水量为30％－75％，完成固体培养基配备。

4.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于，所述的固态发酵包括第一固态发酵阶段和分盘发酵，所述的分盘发酵为：在所述的固态发酵中淡紫拟青霉进入快速生长期、温度上升到30℃以上时，将半成品曲料转移到不锈钢筛盘中继续发酵。

5.根据权利要求4所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于，所述的第一固态发酵阶段温度为20－30℃，湿度为50％－70％。

6.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于，所述的低温烘干的温度为25－45℃。

7.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于，所述的液体培养基的灭菌条件为115℃条件下灭菌15min。

8.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于，所述的固体培养基的灭菌处理为140－150℃灭菌0.01－0.2min。

9.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉的规模化制备方法，其特征在于，制备过程中所采用的设备材质为纯不锈钢材料。