CN102399711B

CN102399711B - 一种枯草芽孢杆菌及利用该细菌制备的微生物菌种剂、微生物肥料以及它们的制备方法

Info

Publication number: CN102399711B
Application number: CN 201110260434
Authority: CN
Inventors: 麻林涛; 王莉
Original assignee: Individual
Current assignee: Inner Mongolia Xinxin Shengda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2011-09-05
Filing date: 2011-09-05
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2031-09-05
Also published as: CN102399711A

Abstract

本发明涉及一种新的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），保藏号为CGMCCNo.5091及由该菌株制备的微生物菌种剂和微生物肥料以及它们的制备方法。使用本发明所提供的菌种生产的微生物菌种剂有较高的有效菌数和较长的保质期。

Description

一种枯草芽孢杆菌及利用该细菌制备的微生物菌种剂、微生物肥料以及它们的制备方法

技术领域

本发明涉及一种新的枯草芽孢杆菌及由该菌株制备的微生物菌种剂和微生物肥料以及它们的制备方法。

背景技术

我国人口多、耕地少，且随着人口增长、工业和城市的发展耕地逐年递减。据有关部门统计，我国人口平均每年增加1600万，而耕地每年减少400万亩。1950年人口5.5亿,耕地16.5亿亩,人均耕地2.99亩,1980年人均耕地1.51亩,1990年人均耕地降到1.1亩,大大低于世界人均耕地4.03亩的水平,也低于亚洲人均耕地2.1亩的水平。为此，我国增加农产品产量的唯一可行途径是提高单位面积产量。才能满足工业发展和人口增加对农产品的需求，化肥也就顺理成章的得到了广泛应用。

长期以来不合理使用化学肥料带来的土壤板结、地力下降、生态破坏、环境污染以及农副产品品质下降问题，已经受到国家有关部门和农业科技界的高度重视。化肥的大量施用，造成了土壤肥力下降，土壤板结和农业生产成本不断提高的弊病。近几十年来，我国一直努力探索合理施肥、克服化肥的弊端及提高化肥利用率的有效途径。

农业肥料包括化学肥料和生物肥料，是我国农业生产不可替代的重要生产资料。其中，生物肥料作为农业生物工程学科的重要分支和土壤肥料学的重要组成部分，近十年无论在基础研究和应用研究方面都得到了迅速发展。而农业肥料中的微生物肥料（属于生物肥料的一种）作为一种重要的农业技术措施在发展高产、优质、高效农业中的作用越来越被人们所认识，这给它的开发、推广、应用提供了相当大的发展空间，特别是在发展有机农业、生产A 级、AA 级绿色食品中的不可替代性，充分体现了它潜在的魅力。

近几年来我国微生物肥料发展很快，有多家企业从事生产经营，品种不断增加，同时也有一些国外产品打入国内市场。由于菌种等原因，目前市场的产品质量参差不齐，生产应用上出现了一些问题。据最近几年农业部监督抽查、跟踪抽查，国家统检的情况看，抽查合格率不到60%，产品质量问题主要是有效菌数不达标，保质期过短。微生物肥料中有效活菌数是产品质量的重要指标，有效活菌数不达标，产品质量就得不到保证，反映出来的是应用效果不稳定，其中原因主要是菌种问题，菌种在制备为微生物菌种剂后，在保藏过程中的存活能力下降，存活时间变短。这个问题实际上是由于这些微生物菌种剂所使用的菌种要么不能产生芽孢，要么产生芽孢的能力比较弱，或者产生的芽孢萌发能力差，不能很好渡过微生物菌种剂生产过程中的胁迫条件和库存、保藏过程，在生产使用过程中表现为菌种活性下降，生产性能减弱，繁殖速度变慢，抗逆性差。因此，菌种问题一直困扰我国微生物肥料的生产和发展。

发明内容

为了解决现有技术中菌种存活能力低、有效活菌数不达标、保质期过短，从而产品质量较差、应用效果不稳定等问题，本发明的目的之一是提供一种新的枯草芽孢杆菌。

本发明的目的之二是提供一种由该枯草芽孢杆菌制备的微生物菌种剂及其制备方法。

本发明的目的之三是提供一种由该微生物菌种剂制备而成的微生物肥料及其制备方法。

本发明提供的新菌种和利用该菌种生产的微生物菌种剂可以非常好地解决菌种数达标和保质期延长的问题，这使得本发明显得十分重要和有意义。

本发明中提到的百分比和比例均是指重量百分比和重量比例。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种新的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏号为CGMCC No.5091。具体的，该菌种被命名为“新枯草芽孢杆菌1号”，该菌种分离自高产农田，并经驯化，长期以来性状稳定。

新枯草芽孢杆菌1号菌株在2010年7月22日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5091，生物学命名Bacillus subtilis，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

该菌种的生物学特性为菌体杆状，为生芽孢需氧菌，其芽孢能抗高热（在100℃下30分钟仍能存活），并能在枯草浸出液中生长，其芽孢为椭圆或长桶形，0.6～0.9×1.0～1.5μm。于芽孢囊中央或近中央部形成，一般于腰间发芽。营养细胞杆状0.3～0.7×2～3μm，孤立或成短链，杆端半圆形。菌落为蔓延性，细皱或折迭，灰白，淡黄甚至黄色。在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。生长温度20-55℃，最佳生长温度37℃，最适PH7.1。在不良条件下，菌体转化产生芽孢，芽孢对不良环境抗逆性强，可耐受100℃高温 15分钟和干燥等恶劣条件。

本发明还要求保护一种由该菌种制备的微生物菌种剂以及其制备方法。具体如下：

本发明中所使用到的培养基有：

新1号培养基（斜面培养基）：蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，牛肉膏5g/L，琼脂1.5%-2.0%， PH调至6.5-7.8。

新1号液体培养基：该培养基不含琼脂，其他成分和含量与新1培养基相同, PH调至6.5-7.8。

新2号培养基：淀粉5g/L，蔗糖1g/L，酵母浸出汁0.2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L,氯化钠5g/L， PH调至6.5-7.8。

新3号培养基：淀粉10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白胨0.5g/L，豆饼粉10g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠5g/L， PH调至6.5-7.8。

新4号培养基：淀粉10g/L，蔗糖2.5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白胨0.5g/L，豆饼粉5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠5g/L， PH调至6.5-7.8。

以上所有培养基均在使用前经高压蒸汽灭菌（121℃，1.1kg/cm³，30分钟），冷却。

本发明还可采用传统的微生物菌种剂生产中用到的培养基和培养方法制备微生物菌种剂。

传统的微生物菌种剂生产中用到的培养基和培养方法在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌种目录中有详细的描述。

微生物菌种剂的具体生产方法：

一、菌种保藏及活化培养

菌种以划线培养的方式在新1培养基（斜面培养基）上保藏，短期保藏条件为4℃，每2月活化1次；长期保藏条件为-20℃，每6个月活化1次。

二、微生物培养

1、采用本发明提供的方法进行微生物培养：

1）自保存斜面取种后，划线接入斜面培养基（新1培养基），30—38℃培养箱静置黑暗条件下培养36小时；

2）用无菌水冲洗斜面，形成菌悬液；

3）将1体积菌悬液接入约20体积的新1液体培养基中，30—38℃有氧培养至菌体浓度为10⁸ 个/ml数量级；

4）将步骤3）得到的菌悬液加入到约5-10倍体积的新2培养基中，30—38℃有氧培养至菌体浓度为10⁸个/ml数量级；

5）将步骤4）得到的菌悬液加入到约50-100倍体积的新3培养基中，35-38℃有氧培养至菌体浓度为 10⁸个/ml数量级；

6）将步骤5）得到的菌悬液加入到约5-10倍体积的新4培养基中，35-38℃培养有氧培养至菌体浓度为10⁹个/ml数量级。

2、采用传统微生物发酵生产方法进行微生物培养

培养基：淀粉10%，豆饼粉10%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸铵0.1%，硫酸镁0.05%，氯化铁0.001%，碳酸钙0.01%，酵母膏0.01%，PH7.2-7.4。

将菌种活化后接入1000ml上述培养基中，三角瓶摇瓶160RPM，30—38℃培养16小时，然后按1%接种量接种到200L种子发酵罐中（仍为同种培养基），通气，30—38℃培养16小时，再按10%接种量接到2000L发酵罐中（仍为同种培养基），30—38℃培养20小时后升温至40—45℃在培养10小时，待80%菌体产生芽孢后停止发酵。

三、微生物菌种剂的生产

将优质草炭粉（市售）进行干热灭菌后冷却，根据想要得到微生物菌种剂中微生物的含量加入到发酵结束（传统微生物发酵生产方法的或本发明提供的生产方法的）得到的发酵液中，进行充分搅拌，用造粒机造粒，低温烘干，包装入库成为微生物菌种剂产品，使用时根据需要与普通化肥或有机载体混合即可成为微生物肥料。

具体地，草炭粉与发酵液的混合重量比例为2－10：1，优选的，混合比例为3－5：1，更优选的，混合比例为4：1。

具体地，所采用的普通化肥为常规氮、磷、钾肥料，微生物菌种剂与普通化肥的混合重量比例为1：5－15，优选的，混合比例为1：8－10。所采用的有机载体可以是本领域常用的有机肥，可采用鸡粪、粉碎玉米芯、粉碎秸秆、煤渣等。具体可采用鸡粪、粉碎玉米芯、煤渣，三者混合比例为1：1－5：1－6，优选三者混合比例为1：2：3。微生物菌种剂与有机载体的混合重量比例为1：5－15，优选的，混合比例为1：7－10，更优选的1：9。

有益的效果

使用本发明所提供的菌种生产的微生物菌种剂有较高的有效菌数和较长的保质期。

在本菌种使用传统发酵方式进行发酵生产的菌种剂，入库时进行有效菌数检测，其结果明显优于市售其他微生物菌种剂中的有效菌数，有效菌数是国家标准的3.5倍。解决了菌种数不达标的问题。

在本菌种使用本发明提供的发酵方式进行发酵生产的菌种剂入库时进行有效菌数检测，其结果明显优于市售其他微生物菌种剂中的有效菌数，有效菌数是国家标准的4倍。也解决了菌种数不达标的问题。

本菌种使用传统发酵方式进行发酵生产的菌种剂在仓库中保存2年后，进行有效菌数检测，其结果明显优于市售其他微生物菌种剂中的有效菌数，有效菌数是国家标准的3倍。解决了保质期短的问题。

本菌种使用本发明提供的发酵方式进行发酵生产的菌种剂在仓库中保存2年后，进行有效菌数检测，其结果明显优于市售其他微生物菌种剂中的有效菌数，有效菌数是国家标准的3.4倍。解决了保质期短的问题。

具体实施方式

实施例1：利用传统方法对麻博士新枯1号进行发酵制备微生物菌种剂

培养基：淀粉3%，豆饼粉1%，蛋白胨0.1%，硫酸铵0.2%，磷酸氢二钾0.2%，酵母粉0.1%，碳酸钙0.01%，PH7.2-7.4。

将菌种活化后接入1000ml上述培养基中，三角瓶摇瓶160RPM 37℃培养16小时，然后按1%接种量接种到200L种子发酵罐中（仍为同种培养基），通气，37℃培养16小时，再按10%接种量接到2000L发酵罐中（仍为同种培养基），37℃培养20小时后升温至42℃在培养10小时，待80%菌体产生芽孢后停止发酵。检测菌体浓度，达到10⁹，然后按1：4的重量百分比与进行干热灭菌后冷却的优质草炭粉（市售）混合，再进行造粒，低温烘干成为微生物菌种剂。

实施例2：利用本发明提供的方法对麻博士新枯1号进行发酵制备微生物菌种剂

先对菌种进行活化，再用5ml无菌水冲洗斜面，形成菌悬液，菌悬液接入500ml三角瓶，该三角瓶含100ml新1液体培养基，使用摇床培养18小时，培养条件为37℃，180-200rpm，检测菌体浓度，在浓度达到10⁸数量级，进行下一步；

将500ml三角瓶中的100ml菌液转接入2000ml三角瓶中，该三角瓶含700ml新2培养基，使用摇床培养20小时，培养条件为37℃，180-200rpm；检测菌体浓度，在浓度达到10⁸数量级，进行下一步；

将2000ml三角瓶中的菌液接入1m³发酵罐中，接入量为6升，该发酵罐中含有500L新3培养基，发酵条件为：温度36-38℃，罐压0.5kg/cm，通气量20m³/h，培养8小时；检测菌体浓度，在浓度达到10⁸数量级，进行下一步；

将1m³发酵罐中的菌液接入5m³发酵罐，接入量为500升，该发酵罐含有3m³新4培养基，发酵条件为：温度36-38℃，罐压0.5kg/cm，通气量120m³/h，培养15小时。检测菌体浓度，在浓度达到10⁹数量级，停止发酵。然后按1：4的比例与进行干热灭菌后冷却的优质草炭粉（市售）混合，再进行造粒，低温烘干成为微生物菌种剂。

实施例3：对利用传统方法制备的微生物菌种剂在未长时间库存的条件下进行菌数检测

按照常规的稀释平板记数法检测微生物菌种剂中的活菌含量。称取微生物菌种剂1克（库存半个月），用无菌水溶解，用无菌水稀释至菌体数为20—100个/ml，然后移取1ml稀释液到无菌培养皿中，加入适量新1培养基（斜面培养基），充分混合后凝固，在37℃保温箱中倒置培养48小时，统计平板上的菌落，重复三次以上，以平均值乘以该一克微生物菌种剂稀释为菌体浓度为20—100个/ml时的毫升数即为每克微生物菌种剂的菌种数。我们对利用传统方法制备的微生物菌种剂在未长时间库存的条件下进行菌数检测，检测结果为7.0*10⁸个/克，为国家标准的3.5倍(国家标准为2.0*10⁸个/克)。解决了菌种剂微生物数目不达标的问题。

实施例4：对利用本发明提供的方法制备的微生物菌种剂在未长时间库存的条件下进行菌数检测

按照常规的稀释平板记数法检测微生物菌种剂中的活菌含量。称取微生物菌种剂1克（库存半个月），用无菌水溶解，用无菌水稀释至菌体数为20—100个/ml，然后移取1ml稀释液到无菌培养皿中，加入适量新1培养基（斜面培养基），充分混合后凝固，在37℃保温箱中倒置培养48小时，统计平板上的菌落，重复三次以上，以平均值乘以该一克微生物菌种剂稀释为菌体浓度为20—100个/ml时的毫升数即为每克微生物菌种剂的菌种数。我们对利用本发明提供的方法制备的微生物菌种剂在未长时间库存的条件下进行菌数检测，检测结果为8*10⁸个/克，为国家标准的4倍。解决了菌种剂微生物数目不达标的问题。

实施例5：对利用传统方法制备的微生物菌种剂在长时间库存的条件下进行菌数检测

按照常规的稀释平板记数法检测微生物菌种剂中的活菌含量。称取微生物菌种剂1克（库存两年），用无菌水溶解，用无菌水稀释至菌体数为20—100个/ml，然后移取1ml稀释液到无菌培养皿中，加入适量新1培养基（斜面培养基），充分混合后凝固，在37℃保温箱中倒置培养48小时，统计平板上的菌落，重复三次以上，以平均值乘以该一克微生物菌种剂稀释为菌体浓度为20—100个/ml时的毫升数即为每克微生物菌种剂的菌种数。我们对利用传统方法制备的微生物菌种剂在长时间库存（两年）的条件下进行菌数检测，检测结果为6*10⁸个/克，为国家标准的3倍。解决了菌种剂微生物数目不达标的问题和保藏期太短的问题。

实施例6：对利用本发明提供的方法制备的微生物菌种剂在长时间库存的条件下进行菌数检测

按照常规的稀释平板记数法检测微生物菌种剂中的活菌含量。称取微生物菌种剂1克（库存两年），用无菌水溶解，用无菌水稀释至菌体数为20—100个/ml，然后移取1ml稀释液到无菌培养皿中，加入适量新1培养基（斜面培养基），充分混合后凝固，在37℃保温箱中倒置培养48小时，统计平板上的菌落，重复三次以上，以平均值乘以该一克微生物菌种剂稀释为菌体浓度为20—100个/ml时的毫升数即为每克微生物菌种剂的菌种数。我们对利用本发明提供的方法制备的微生物菌种剂在长时间库存（两年）的条件下进行菌数检测，检测结果为6.8*10⁸个/克，为国家标准的3.4倍。解决了菌种剂微生物数目不达标的问题和保藏期太短的问题。

实施例7：未长期库存的微生物菌种剂与肥料混合后使用的效果

将鸡粪、粉碎玉米芯、煤渣以1：2：3重量比混合均匀，调整含水量为30%，在温度大于30℃的条件下堆积7—10天，把库存半个月的微生物菌种剂与之以1：9的重量比混合，制成微生物肥料。

将制成的微生物肥料在不同作物上进行与基质肥以及等价常规肥比较的小区肥效实验，每个小区面积0.16亩，实验设3个重复。实验时每亩施微生物肥料25公斤；基质肥（经由鸡粪、粉碎玉米芯、煤渣以1：2：3重量百分比混合均匀，调整含水量为30%后，在温度大于30℃的条件下堆积7—10天制成）每亩施25公斤；等价常规肥（磷酸二铵：尿素：氯化钾为3：3：2混合）每亩施25公斤。均作为基肥，一次施完，不追加。空白对照不施肥。

实验结果如下（数据均为各肥料相对于空白对照的增产百分比）

	生菜	小麦	玉米	水稻	棉花	黄瓜
							微生物肥料	10	14	15	20	15	35
基质肥	1	7	9	9	8	25
							等价常规肥	3	7	8	5	6	18

结果表明，该微生物菌种剂能够很好发挥作用，具有良好的增产效果。

实施例8：长期库存（两年）的微生物菌种剂与肥料混合后使用的效果

将鸡粪、粉碎玉米芯、煤渣以1：2：3重量比混合均匀，调整含水量为30%，在温度大于30℃的条件下堆积7—10天，把库存两年的微生物菌种剂与之以1：9的重量比混合，制成微生物肥料。

	生菜	小麦	玉米	水稻	棉花	黄瓜
							微生物肥料	7	12	15.5	14	10	30
基质肥	1	7	9	9	8	25
							等价常规肥	3	7	9	5	6	18

结果表明，该微生物菌种剂能够很好的解决保质期问题，由它制备的肥料相对于未长期保存的微生物菌种剂制备的肥料在使用效果上没有显著差别，解决了本发明想要解决的问题。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ），其特征在于它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5091。

2.一种枯草芽孢杆菌微生物菌种剂，其特征在于该菌种剂由枯草芽孢杆菌CGMCC No.5091经培养发酵然后与草炭土混合造粒而得。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌微生物菌种剂，其特征在于该微生物菌种剂由如下方法制备而成：

1）将CGMCC No.5091菌株划线接入斜面培养基，即，新1号培养基，30—38℃培养箱静置黑暗条件下培养36小时；

2）用无菌水冲洗斜面，形成菌悬液；

3）将1体积菌悬液接入20体积的新1号液体培养基中，30—38℃有氧培养至菌体浓度为10⁸ 个/ml数量级；

4）将步骤3）得到的菌悬液加入到5-10倍体积的新2号培养基中，30—38℃有氧培养至菌体浓度为10⁸个/ml数量级；

5）将步骤4）得到的菌悬液加入到50-100倍体积的新3号培养基中，35-38℃有氧培养至菌体浓度为 10⁸个/ml数量级；

6）将步骤5）得到的菌悬液加入到5-10倍体积的新4号培养基中，35-38℃培养有氧培养至菌体浓度为10⁹个/ml数量级，停止发酵；然后按1：2－10的比例与草炭土混合，造粒，低温烘干获得微生物菌种剂；

其中上述培养基为：新1号培养基，即，斜面培养基：蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，牛肉膏5g/L，琼脂1.5%-2.0%， PH调至6.5-7.8，

新1号液体培养基：该培养基不含琼脂，其他成分和含量与新1培养基相同, PH调至6.5-7.8，

新2号培养基：淀粉5g/L，蔗糖1g/L，酵母浸出汁0.2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L,氯化钠5g/L， PH调至6.5-7.8，

新3号培养基：淀粉10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白胨0.5g/L，豆饼粉10g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠5g/L，PH调至6.5-7.8，

4.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌微生物菌种剂，其特征在于该微生物菌种剂由如下方法制备而成：

将CGMCC No.5091菌株活化后接入1000ml培养基：淀粉10%，豆饼粉10%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸铵0.1%，硫酸镁0.05%，氯化铁0.001%，碳酸钙0.01%，酵母膏0.01%，PH7.2-7.4中，三角瓶摇瓶160RPM，30—38℃培养16小时，然后按1%接种量接种到200L种子发酵罐中，培养基不变，通气，30—38℃培养16小时，再按10%接种量接到2000L发酵罐中，培养基不变，30—38℃培养20小时后升温至40—45℃在培养10小时，待80%菌体产生芽孢后停止发酵；然后按1：2－10的比例与草炭土混合，造粒，低温烘干获得微生物菌种剂。

5.一种微生物肥料，其特征在于该肥料由权利要求2－4之一所述的枯草芽孢杆菌微生物菌种剂与常规化肥和／或有机载体混合而成。

6.根据权利要求5所述的微生物肥料，其中所述的常规化肥为氮肥、磷肥和／或钾肥，所述的有机载体为鸡粪、粉碎玉米芯和／或煤渣。

7.一种生产微生物菌种剂的方法，其特征在于具体步骤如下：

2）用无菌水冲洗斜面，形成菌悬液；

新4号培养基：淀粉10g/L，蔗糖2.5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白胨0.5g/L，豆饼粉5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠5g/L， PH调至6.5-7.8，

以上所有培养基均在使用前经高压蒸汽灭菌，条件为121℃，1.1kg/cm³，30分钟，冷却。

8.根据权利要求7所述的微生物菌种剂的方法，其特征在于发酵液与草炭土的混合比例为1：4。

9.一种生产微生物菌种剂的方法，其特征在于具体步骤如下：将CGMCCNo.5091菌株活化后接入1000ml培养基：淀粉10%，豆饼粉10%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸铵0.1%，硫酸镁0.05%，氯化铁0.001%，碳酸钙0.01%，酵母膏0.01%，PH7.2-7.4中，三角瓶摇瓶160RPM，30—38℃培养16小时，然后按1%接种量接种到200L种子发酵罐中，培养基不变，通气，30—38℃培养16小时，再按10%接种量接到2000L发酵罐中，培养基不变，30—38℃培养20小时后升温至40—45℃在培养10小时，待80%菌体产生芽孢后停止发酵；然后按1：2－10的重量比例与草炭土混合，造粒，低温烘干获得微生物菌种剂。

10.根据权利要求9所述的微生物菌种剂的方法，其特征在于发酵液与草炭土的混合比例为1：4。