CN104928186A - 一种淡紫拟青霉及其规模制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种淡紫拟青霉及其规模制备方法，属于微生物用农业用药肥技术领域，具体涉及保藏号为：CGMCC NO.5339的淡紫拟青霉的菌株，将该菌株采用液态发酵和固态发酵相结合的方式，即通过液态发酵、固态发酵基质灭菌、固态基质喷雾接种、接种后基质的培养4个步骤来实现其规模制备，本方法具有发酵效率高、制备周期短、制备方法简单、制备成本低的优势，可以实现淡紫拟青霉在农业病害防治中的广泛应用，满足线虫高效、规模防治的实际需求。

Description

一种淡紫拟青霉及其规模制备方法

技术领域：

本发明属于微生物用农业用药肥技术领域，具体涉及一种淡紫拟青霉及其规模制备方法。

背景技术：

根结线虫作为分布广泛、为害严重的一种植物寄生线虫，对农林业生产造成极大的经济损失。根结线虫可直接破坏寄主表皮细胞使作物造成机械损伤，也可通过口针刺伤寄主，分泌有毒物质，形成瘤状根结，影响作物生长。

淡紫拟青霉作为一种高效微生物药肥，可有效防治根结线虫为害，然而现有的微生物菌株，在实际应用中，许多产品因含孢量有限而防效不及化学杀线虫剂。因此，如何扩大淡紫拟青霉产孢量，在短时间内实现其规模生产的尤为重要。

现有技术中，例如公开号为CN 10332032的专利，采用固液两相的方法进行发酵，其含孢子量仅为10⁹cfu/g，又如公开号CN 102925405采用液态发酵的方式进行淡紫拟青霉菌株的规模生产，其活孢子量也仅为10⁹cfu/g，发酵效率普遍较低。此外，现有的淡紫拟青霉的规模生产方法，生产周期长，例如公开号为：CN 103589649采用固态培养的方法，生产周期长，达32-37天，不能满足淡紫拟青霉生产的实际需求。

综上，现有淡紫拟青霉菌株产孢量低，缺少适合的规模发酵方法，不能满足根结线虫大规模防治的需求。因此，需要一种高产的淡紫拟青霉菌株，并结合其规模制备的方法，来实现淡紫拟青霉在农业病害防治中的广泛应用，达到线虫高效、规模防治的实际需求。

发明内容：

本发明根据现有淡紫拟青霉在规模制备过程中出现的发酵效率低、制备周期长的缺点，筛选出一种高产的淡紫拟青霉菌株，拉丁名为：Paecilomyces lilacinus，已于2011年10月14日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为：CGMCC NO.5339。并根据其菌株的特点，开发出一种规模制备的方法，具有发酵效率高、制备周期短、制备方法简单、制备成本低的优势，可实现淡紫拟青霉的广泛应用。

本发明的技术方案如下：

1、一种淡紫拟青霉，其特征在于：采用液态发酵和固态发酵相结合的方式进行淡紫拟青霉的规模制备；其规模制备方法如下：

(1)液态发酵：配制液态发酵培养基1000ml灭菌，接种淡紫拟青霉的菌块，在25-30℃的摇床中震荡，摇床转速为160rpm-200rpm，震荡培养3-5天，得到液体种子液A；

(2)固态发酵基质灭菌：将固态发酵基质混匀，采用灭菌方法进行杀菌后，得到灭菌后的固态发酵基质B；

(3)固态基质喷雾接种：将A得到的种子液用无菌水进行稀释，种子液与无菌水的质量比为：1:2-5:1，将稀释后的种子液倒入喷雾器中，将B在超净工作台中进行接种，稀释后的种子液与固态发酵基质的比例为：30-65ml：100g，得到物质C；

(4)接种后基质的培养：将物质C放置货架上进行固态发酵，发酵的温度条件为20-30℃，4-10天后，发酵结束，获得发酵产物，将发酵产物放入烘箱干燥，烘箱温度为25-35℃。

采用液态和固态相结合的发酵方法，其生产周期短，7-15天可以实现从种子液培养到淡紫拟青霉原药的获得。采用喷雾接种的方式来替代人工搅拌接种，生产速率可提高2-3倍，减少劳动力，降低生产成本。采用该制备方法进行淡紫拟青霉的发酵，其发酵产物含孢子量高，可达10^15-16cfu/g。采用上述制备方法制备的物质可以直接通过震荡获得孢子粉，其获得率可达15％(w/w)以上，制备后的物质也可以直接作为原料做成淡紫拟青霉生物杀线虫剂。

2、根据技术方案1所述的规模制备方法，其特征在于：所述液态发酵培养基为玉米粉培养基，其配制方法为将玉米粉与水混合后熬煮8min-15min后加入糖分物质，其中，每1000ml水中的玉米粉含量为5-12g，糖分物质含量为10-20g。

采用玉米粉熬煮液可将玉米粉营养物质充分溶解，有助于其培养基的营养成分充分融合，有助于淡紫拟青霉的液态培养，采用玉米粉培养基，淡紫拟青霉产孢量明显高于PDB，可高出20％以上。

3、根据技术方案1所述的规模制备方法，其特征在于：所述固态发酵基质包括：主要基质A、辅助基质B、小米粉、虾粉、硫酸铵。其中，小米粉作为营养物质可提供充足的营养，硫酸铵可提供盐分，虾粉促进淡紫拟青霉分泌几丁质酶，增强淡紫拟青霉寄生线虫能力。

4、根据技术方案3所述的固态发酵基质，其特征在于：主要基质A为麦麸或豆饼，或麦麸和豆饼的混合物；辅助基质B为玉米粉或酵母粉、或玉米粉和酵母粉的混合物。主要基质A用来提供碳源，麦麸和豆饼为农业生产中价廉物美的碳源，而辅助基质则提供氮源，同时，多种粮食作物提供全面充分的营养，以上物质更有助于淡紫拟青霉的固态发酵。

5、根据技术方案4所述的固态发酵基质，其特征在于：各成分按质量组分，主要基质A为500-800份、辅助基质B为300-450份、小米粉为50-200份、虾粉为5-50份、硫酸铵为1-20份。固态发酵基质采用上述成分以及相应比例，是根据淡紫拟青霉固态发酵过程中对各种成分的需求量进行的合理配比，筛选出来的最优配方，有利于淡紫拟青霉固态发酵的顺利进行。

6、根据技术方案1所述的规模制备方法，其特征在于：所述杀菌方法包括间歇蒸汽灭菌，具体步骤如下：

步骤(1)：将固体发酵基质通入100℃水蒸气进行灭菌，灭菌时间为30min以上，单次灭菌结束后，将固体发酵基质放置18-24小时；

步骤(2)：重复步骤(1)，重复次数为3-5次。

采用间歇蒸汽的方式进行灭菌，可降低采用高压蒸汽灭菌所存在的安全隐患，避免了高压蒸汽灭菌容易造成固体基质的板结，可减少人为搅拌步骤，从而降低固体基质污染的概率。同时，灭菌方法也可以采用高压蒸汽灭菌的方式，即：将混匀后的固态发酵基质在压力103.4kPa下，在温度115-130℃范围内进行蒸汽灭菌，持续灭菌时间为20min-30min。

7、根据技术方案1所述的淡紫拟青霉，Paecilomyces lilacinus，其保藏号为CGMCC NO.5339。该菌株为土壤有益菌，能有效防治土壤根结线虫，在作物生长期还有良好的促进生长、提高作物产量和品质的作用。

综上所述，本发明提供了一种淡紫拟青霉，并根据其特征，通过选择特定成分的培养基、液态固态相结合的发酵方式、采用喷雾式接种以及间歇蒸汽灭菌的方式，实现了淡紫拟青霉的规模制备，解决了现有技术淡紫拟青霉活孢子量少、人工接种效率低、固态发酵产品易板结、发酵效率低、发酵罐发酵成本高、制备周期长等一系列问题。本发明一种淡紫拟青霉及其规模制备方法，具有发酵原料易获得、接种及发酵效率高、制备周期短、制备方法简单、制备成本低的优势，可实现淡紫拟青霉的广泛应用。

具体实施方式

通过实施例对本发明作进一步的说明，实施例不应该当作对本发明的限制。

实施例一：

1、液态发酵：玉米粉5g和水1000ml，混合熬煮8分钟，加入糖10g，制成液态发酵培养基，接种淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus保藏号为CGMCC NO.5339的菌块，在25℃的摇床中震荡，摇床转速为200rpm，震荡培养3天，得到液体种子液A；

2、固态发酵基质灭菌：将固态发酵基质按质量比：主要基质麦麸和豆饼的混合物500份、辅助基质玉米粉300份、小米粉200份、虾粉5份、硫酸铵20份，混匀，采用间歇蒸汽方式将固体发酵基质通入100℃水蒸气进行灭菌，灭菌时间为30min，间隔18小时，重复3次，得到灭菌后的固态发酵基质B；

3、固态基质喷雾接种：将A得到的种子液用无菌水进行稀释，种子液与无菌水的质量比为：1:2，将稀释后的种子液倒入喷雾器中，将B在超净工作台中进行接种，稀释后的种子液与固态基质的比例为：30ml：100g，得到物质C；

4、接种后基质的培养：将物质C放置货架上进行固态发酵，发酵的温度条件为20℃，4天后，发酵结束，获得发酵产物，将发酵产物放入烘箱干燥，烘箱温度为25℃。

将获得的发酵产物做成淡紫拟青霉生物杀线虫剂。

处理1-1：将液体发酵中液态培养基改为PDB培养基，其余步骤相同。

结果表明：采用普通PDA培养基培养液体种子液，摇培3天后，含孢量较玉米粉培养基效果低2个数量级，需同等条件下摇培5天以上才能达到玉米粉培养基相同的含孢量。

实施例二：

1、液态发酵：玉米粉12g和水1000ml，混合熬煮15分钟，加入糖20g，制成液态发酵培养基，接种淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus保藏号为CGMCCNO.5339的菌块，在30℃的摇床中震荡，摇床转速为180rpm，震荡培养5天，得到液体种子液A；

2、固态发酵基质灭菌：将固态发酵基质按质量比：主要基质麦麸800份、辅助基质玉米粉和酵母粉的混合物450份、小米粉50份、虾粉50份、硫酸铵10份，混匀，采用间歇蒸汽方式将固体发酵基质通入100℃水蒸气进行灭菌，灭菌时间为40min，间隔24小时，重复4次，进行灭菌后，得到灭菌后的固态发酵基质B；

3、固态基质喷雾接种：将A得到的种子液用无菌水进行稀释，种子液与无菌水的质量比为：5:1，将稀释后的种子液倒入喷雾器中，将B在超净工作台中进行接种，稀释后的种子液与固态基质的比例为：65ml：100g，得到物质C；

4、接种后基质的培养：将物质C放置货架上进行固态发酵，发酵的温度条件为30℃，10天后，发酵结束，获得发酵产物，将发酵产物放入烘箱干燥，烘箱温度为35℃。

将获得的发酵产物做成淡紫拟青霉生物杀线虫剂。

处理2-1：将接种方法换为超净工作台中搅拌接种，通过人工搅拌每一盘基质接种种子液。

结果表明：液体喷雾接种效率是人工搅拌的2-3倍，而最终获得的发酵产物含孢量无明显差别，均为10¹⁴cfu/g。

实施例三：

1、液态发酵：玉米粉8g和水1000ml，混合熬煮12分钟，加入糖15g，制成液态发酵培养基，接种淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus保藏号为CGMCC NO.5339的菌块，在28℃的摇床中震荡，摇床转速为160rpm，震荡培养5天，得到液体种子液A；

2、固态发酵基质灭菌：将固态发酵基质按质量比：主要基质豆饼650份、辅助基质酵母粉375份、小米粉125份、虾粉30份、硫酸铵1份，混匀，采用间歇蒸汽方式，将固体发酵基质通入100℃水蒸气进行灭菌，灭菌时间为30min，间隔21小时，重复5次，得到灭菌后的固态发酵基质B；

3、固态基质喷雾接种：将A得到的种子液用无菌水进行稀释，种子液与无菌水的质量比为：2:1，将稀释后的种子液倒入喷雾器中，将B在超净工作台中进行接种，稀释后的种子液与固态基质的比例为：50ml：100g，得到物质C；

4、接种后基质的培养：将物质C放置货架上进行固态发酵，发酵的温度条件为25℃，7天后，发酵结束，获得发酵产物，将发酵产物放入烘箱干燥，烘箱温度为30℃。

将获得的发酵产物做成淡紫拟青霉生物杀线虫剂。

处理3-1：同一批次种子液，接种高压蒸汽灭菌的基质。

发酵7天后，采用间歇蒸汽灭菌的基质发酵过程中无细菌、真菌污染出现，与高压蒸汽灭菌基质发酵情况相同，最终发酵产物含孢量为10¹⁵cfu/g。然而，采用高压蒸汽灭菌的基质板结成块状，需要人工搅拌。

Claims (7)

1.一种淡紫拟青霉，其特征在于：采用液态发酵和固态发酵相结合的方式进行淡紫拟青霉的规模制备；其规模制备方法如下：

(1)液态发酵：配制液态发酵培养基1000ml灭菌，接种淡紫拟青霉的菌块，在25-30℃的摇床中震荡，摇床转速为160rpm-200rpm，震荡培养3-5天，得到液体种子液A；

(2)固态发酵基质灭菌：将固态发酵基质混匀，采用灭菌方法进行灭菌后，得到灭菌后的固态发酵基质B；

(3)固态基质喷雾接种：将A得到的种子液用无菌水进行稀释，液体种子液与无菌水的质量比为：1:2-5:1，将稀释后的液体种子液倒入喷雾器中，将B在超净工作台中进行接种，稀释后的液体种子液与固态发酵基质的比例为：30-65ml：100g，得到物质C；

(4)接种后基质的培养：将物质C放置货架上进行固态发酵，发酵的温度条件为20-30℃，4-10天后，发酵结束，获得发酵产物，将发酵产物放入烘箱干燥，烘箱温度为25-35℃。

2.根据权利要求1所述的规模制备方法，其特征在于：所述液态发酵培养基为玉米粉培养基，其配制方法为将玉米粉与水混合后熬煮8min-15min后加入糖分物质，其中，每1000ml水中的玉米粉含量为5-12g，糖分物质含量为10-20g。

3.根据权利要求1所述的规模制备方法，其特征在于：所述固态发酵基质包括：主要基质A、辅助基质B、小米粉、虾粉、硫酸铵。

4.根据权利要求3所述的固态发酵基质，其特征在于：主要基质A为麦麸或豆饼，或麦麸和豆饼的混合物；辅助基质B为玉米粉或酵母粉、或玉米粉和酵母粉的混合物。

5.根据权利要求4所述的固态发酵基质，其特征在于：各成分按质量组分，主要基质A为500-800份、辅助基质B为300-450份、小米粉为50-200份、虾粉为5-50份、硫酸铵为1-20份。

6.根据权利要求1所述的规模制备方法，其特征在于：所述灭菌方法包括间歇蒸汽灭菌，具体步骤如下：

步骤(1)：将固体发酵基质通入100℃水蒸气进行灭菌，灭菌时间为30min以上，单次灭菌结束后，将固体发酵基质放置18-24小时；

步骤(2)：重复步骤(1)，重复次数为3-5次。

7.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉，Paecilomyces lilacinus，其保藏号为CGMCC NO.5339。