CN107189950A - 一种降解除草地膜的菌株gfdz1及菌剂制备方法和应用 - Google Patents

一种降解除草地膜的菌株gfdz1及菌剂制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌剂制备方法和应用。本发明菌株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1于2016年12月12日保藏于广东省农业微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.60131。本发明获得的菌株对除草剂有耐受性，能够在除草地膜上快速生长。还可以以其作为生长所需的碳源，将除草地膜进行快速降解，具有很好的应用前景。

Description

一种降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌剂制备方法和应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种可降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌剂制备方法和应用。
背景技术
我国20世纪70年代开始使用地膜，目前地膜应用已经覆盖棉花、玉米、小麦、水稻、蔬菜、花生、甘蔗、烟草等众多种类作物；地膜已经成为继化肥、种子和农药以外的第四大农业生产物质资料。地膜应用于农业生产具有很多积极作用，包括:提高和保持土壤温度，保持水分、提高水分利用率，增肥保肥、提高土壤肥效，保持土壤疏松，提高光效，抑盐保苗。因此，地膜在我国大部分省、自治区和直辖市的农业生产中都得到了普遍使用。
地膜的主要生产原料为聚乙烯，它是一种人工合成的高分子化合物，在自然环境中降解速度极慢，可能需要上百年的时间才能完全降解。地膜在我国普遍使用，残留的地膜集中在我国各区域的部分农田中，分布区域非常广泛，这给残留地膜的回收带来了很大的困难，我国地膜的回收率不足三分之一。随着地膜每年的使用，残留在土壤中的地膜越来越多，造成的环境污染问题已日益突出。鉴于聚乙烯的难降解性，目前人们不断研究开发新型地膜，光降解地膜，生物降解地膜，光-生物双降解地膜，含除草剂光降解地膜等。
含除草剂光降解地膜不仅具备了增肥、保肥、保水的作用，还可以有效抑制杂草生长，同时可以被光分解。但是这种光降解地膜的降解速率受光照强度影响较大，而且它并不能完全降解，只是能分解成大小不同的碎片，这种碎片进入土壤中仍会长期残留，影响作物根系生长和对土壤养分的吸收。同时，由于该地膜中含有除草剂的成分，对普通的微生物具有一定抑制作用，使这些碎片更加难以降解。
发明内容
为了解决上述问题，针对目前含除草剂光降解地膜降解不彻底，生物降解性差的问题，本发明提供了一种可降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌剂制备方法和应用。
本发明的目的在于提供一株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1。
本发明的另一个目的在于提供上述菌株在降解除草地膜中的应用。
本发明的再一个目的在于提供一种含有淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1的制剂。
本发明的再一个目的在于提供淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1菌剂的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种可降解除草地膜的菌株GFDZ1，经鉴定为淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)，2016年12月12日保藏于广东省农业微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC NO.60131，建议的分类命名为Paecilomyces lilacinus GFDZ1，已于2016年12月16日鉴定保藏的菌株是存活的。
本发明的有益效果是：
1)本发明获得的菌株对除草剂有耐受性，能够在除草地膜上快速生长。
2)本发明所获得的菌株不仅可以在除草地膜上生长，还可以以其作为生长所需的碳源，将除草地膜进行快速降解。
3)本发明所制备的菌剂，方法简单，该菌剂为微生物发酵产品，无毒害，无环境污染，在农田中应用降解地膜的同时不会造成二次污染。
4)本发明所制备的菌剂培养基配方价格低廉，易获取。本发明固体发酵培养基培养基中加入了有利于淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1菌体的快速生长和孢子的形成，提高孢子产量。
附图说明
图1为淡紫拟青霉GFDZ1降解除草地膜7天后的效果；A为7天后对照组和实验组中除草地膜的降解情况，B为将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1接种到含除草地膜的无机盐培养基中；
图2为淡紫拟青霉GFDZ1降解除草地膜电镜图；
图3淡紫拟青霉GFDZ1的平板培养及其在电镜、显微镜下的形态图。
具体实施方式
淡紫拟青霉，其分类命名为(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心GDMCC，保藏编号为GDMCC No：60131。
上述淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1在降解除草地膜中的应用。
优选的，所述除草地膜中含有除草剂，所述除草剂选自甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、敌稗、异丙草胺、异丙隆、莠去津、扑草净、莠灭净、嗪草酮和环嗪酮中的至少一种。
一种降解除草地膜的菌剂，该菌剂含有上述所述淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus GFDZ1。
一种用于淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1的固体发酵培养基，该发酵培养基含有0.1％～0.2％的麦芽糖、0.05％～0.1％的硫酸铵、0.02～0.04％的蛋壳粉、0.01％～0.03％的硫酸锰、40％～50％的水，余量为麦麸和玉米粉，其中麦麸和玉米粉的重量比为(4.5～5.2)：(0.8～1.5)。
优选的，上述发酵培养基含有0.12％～0.18％麦芽糖，0.08％～0.1％硫酸铵，0.025～0.035％蛋壳粉和0.015％～0.025％硫酸锰，含42％～58％的水，余量为麦麸和玉米粉，其中麦麸和玉米粉的重量比为(4.8～5)：(1.0～1.2)。
一种制备淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1的菌剂方法，将上述所述的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于PDA平板培养基，在26～30℃条件下活化，将活化后的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于Czapek培养液，26～30℃，110～130r/min条件下培养5～7d，获得种子液；将种子液按3～5％的接种量接种于上述所述固体发酵培养基，26～30℃潜盘培养6～9d，粉碎后获得淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus GFDZ1菌剂。
上述所述方法制备的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂。
上述所述淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂在降解除草地膜中的应用。
优选的，所述除草地膜中含有除草剂，所述除草剂选自甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、敌稗、异丙草胺、异丙隆、莠去津、扑草净、莠灭净、嗪草酮和环嗪酮中的至少一种。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1的富集、分离、筛选和鉴定
一种可降解除草地膜的菌株GFDZ1，命名为Paecilomyces lilacinus GFDZ1，由广东省农业科学院农业资源与环境研究所在田间土壤分离得到。其具体分离、筛选、鉴定方法如下：
(1)除草地膜降解菌株GFDZ1的富集
从田间收集已经发生降解的除草地膜。将其放入无机盐培养(1L)：K2HPO4 0.7g,KH2PO4 0.7g,MgSO4.7H2O 0.7g,NH4NO3 1.0g,NaCl 0.005g,FeSO4.7H2O 0.002g,ZnSO4.7H2O0.002g,MnSO4.H2O 0.001g，150r/min，30℃培养15d，进行除草地膜降解菌的富集。
(2)除草地膜降解菌株GFDZ1的分离
将除草地膜剪成5cm×2cm大小，用70％的酒精消毒，然后在紫外灯下照射4h，贴于固体无机盐培养基上。吸取0.1mL富集培养的液体涂布于固体无机盐培养基，30℃培养5d。挑取在除草地膜与培养基交界处的菌株，在培养基上划线获得单菌落(细菌用LB培养基，真菌用PDA培养基，放线菌用高氏一号培养基)，4℃保存备用。
(3)除草地膜菌株GFDZ1的筛选
将上述分离的菌株接种到含有5cm×2cm大小除草剂地膜的液体无机盐培养基中，150r/min，30℃培养，观察地膜降解情况，筛选获得一株真菌能够快速降解除草地膜。
(4)菌株鉴定
a.形态学观察：将菌株在PDA上培养，观察菌落形态。本发明菌株在PDA固体培养基上菌落较大、成圆形，培养2天时长出白色菌丝体，继续培养出现淡紫色孢子。经电镜观察，分生孢子梗末端膨大。分生孢子为单细胞，呈链状平滑、无色至黄色，孢梗上具有瓶颈状不规则的分枝或轮生分枝，瓶梗基部较宽(如图3所示)。
b.分子生物学鉴定：提取真菌基因组总DNA，PCR引物为ITS1：5’-TCCGTAGGAACCTGCGC-3’(SEQ ID NO：1)，ITS2：5’-GCTGCGTTCTTCACGATGC-3’(SEQ ID NO：2)。PCR反应体系为50μl，反应条件为：94℃5min，(94℃30s，57℃50s，72℃50s)循环30次；72℃10min。PCR扩增产物测序后将获得的DNA序列输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比较，用MEGA进行系统发育树的构建。发现本发明菌株与登陆号为GU980033.1的Paecilomyces lilacinus strain NRRL22958菌株同源性达98％，说明本发明菌株为淡紫拟青霉。
实施例2淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1菌剂的制备方法
将上述筛选所得的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1接种于PDA平板，在28℃条件下活化，将活化后的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1接种于Czapek培养液，28℃，120r/min条件下培养5～7d，获得种子液；将种子液按4％的接种量接种于固体发酵培养基，28℃潜盘培养7d，粉碎后获得淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)GFDZ1菌剂。
上述固体发酵培养基中含有0.15％麦芽糖，0.08％硫酸铵，0.03％蛋壳粉，0.02％硫酸锰，含水率为45％，余量为麦麸和玉米粉，其中麦麸和玉米粉的重量比为5：1。
所述固体发酵培养基培养基中加入了有利于淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)GFDZ1菌体的快速生长和孢子的形成，提高孢子产量。
实施例3淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1菌剂的制备方法
将上述筛选所得的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于PDA平板培养基，在30℃条件下活化，将活化后的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于Czapek培养液，30℃，110r/min条件下培养7d，获得种子液；将种子液按5％的接种量接种于固体发酵培养基，30℃潜盘培养6d，粉碎后获得淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinusGFDZ1菌剂。
所述固体发酵培养基含有0.1％％的麦芽糖，0.05％％的硫酸铵，0.04％的蛋壳粉，0.03％的硫酸锰，含水率为48％，余量为麦麸和玉米粉，其中麦麸和玉米粉的重量比为4.5：1.5。
实施例4淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1对除草地膜的降解能力测定
将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1接种到含除草地膜(见CN103497412A)的无机盐培养基中(见图1B)，观察地膜变化，并在第7、14、21和30天测定地膜失重率。同时在第7天观察其电镜下变化。并设置3个平行及空白对照。
表1除草地膜失重率测定
由表1数据可知接种了淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1的除草地膜的重量在0-30d中不断下降，至第30d，失重率达到68.10％，说明该菌株对除草地膜具有较好的降解能力。
图1为经本发明淡紫拟青霉降解除草地膜7天后的效果图，图中对照组为菌株降解前的除草地膜，从图中可以看出，7天后已经可以明显看出除草地膜发生了降解(图1A)。说明本发明菌株GFDZ1对除草地膜具有很好的降解效果。本发明所获得的菌株不仅可以在除草地膜上生长，还可以以其作为生长所需的碳源，将除草地膜进行快速降解。本发明所制备的菌剂，方法简单，该菌剂为微生物发酵产品，无毒害，无环境污染，在农田中应用降解地膜的同时不会造成二次污染。
图2为淡紫拟青霉GFDZ1对除草地膜降解7天后的电镜图，从中可以从图2(左)看到未接种淡紫拟青霉GFDZ1的除草地膜在电镜下未观察到裂痕，而从图2(右)看到经淡紫拟青霉GFDZ1降解的除草地膜，出现了明显裂痕，并且淡紫拟青霉菌丝布满了地膜的表面。
淡紫拟青霉GFDZ1平板培养中菌落形态图如图3(左)所示，菌落较大、成圆形，有白色菌丝体，表面层淡紫色。图3(中)为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1在降解除草地膜过程中的电镜图，从中可以看出，其与正常培养时的菌体形相同，生长良好，说明淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1可以附着在除草地膜上很好地生长，并将其降解。图3(右)为显微镜下淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1菌体形态。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院农业资源与环境研究所
<120> 一种降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌剂制备方法和应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物
<400> 1
tccgtaggaa cctgcgc 17
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物
<400> 2
gctgcgttct tcacgatgc 19

Claims (8)

1.淡紫拟青霉，其分类命名为(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心GDMCC，保藏编号为GDMCC No：60131。
2.权利要求1所述淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1在降解除草地膜中的应用。
3.一种降解除草地膜的菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1。
4.一种用于淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1的固体发酵培养基，其特征在于，该发酵培养基含有0.1％～0.2％的麦芽糖、0.05％～0.1％的硫酸铵、0.02～0.04％的蛋壳粉、0.01％～0.03％的硫酸锰、40％～50％的水，余量为麦麸和玉米粉，其中麦麸和玉米粉的重量比为(4.5～5.2)：(0.8～1.5)，所有百分比均为重量百分比。
5.根据权利要求4所述的固体发酵培养基，其特征在于，该发酵培养基含有0.12％～0.18％麦芽糖、0.08％～0.1％硫酸铵、0.025～0.035％蛋壳粉、0.015％～0.025％硫酸锰、含42％～58％的水，余量为麦麸和玉米粉，其中麦麸和玉米粉的重量比为(4.8～5)：(1.0～1.2)，所有百分比均为重量百分比。
6.一种制备淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1的菌剂方法，其特征在于，将权利要求1所述的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于PDA平板培养基，在26～30℃条件下活化，将活化后的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于Czapek培养液，26～30℃，110～130r/min条件下培养5～7d，获得种子液；将种子液按3～5％的接种量接种于权利要求4或5所述固体发酵培养基，26～30℃潜盘培养6～9d，粉碎后获得淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂。
7.权利要求6所述方法制备的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂。
8.权利要求7所述淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂在降解除草地膜中的应用。
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