CN111592987A - 一株淡紫拟青霉菌及其在抑制植物生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明中公开了一株淡紫拟青霉菌及其在抑制植物生长中的应用。该淡紫拟青霉菌名称为Purpureocillium lilacinum Scaumcx04，保藏编号为GDMCC NO：60794，该菌株于2019年9月27日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。本发明中通过培养淡紫拟青霉菌或其孢子获得的培养物，以及进一步经有机溶剂萃取和层析柱纯化后的次生代谢产物能够抑制植物地上部分茎的生长和地下部分根的生长，同时能够抑制植物种子萌发，延长发芽的时间，因此可将其作为植物生长的调节剂和植物除草剂，为植物生长调节剂和除草剂的开发提供一种有效途径。

Description

一株淡紫拟青霉菌及其在抑制植物生长中的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，特别涉及一株淡紫拟青霉菌及其在抑制植物生长中的应用。

背景技术

农田杂草是生长在农作物田间的，除了有目的栽培的植物以外的农田其他植物，它是长期适应当地作物、耕作、气候、土壤等生态条件而生存下来的，与栽培作物在各个方面进行竞争，对作物造成危害。根据李扬汉的《中国杂草志》记载，我国境内农田杂草共有1387种，对农业生产造成危害的主要杂草有多种，其中恶性杂草15种，优势杂草31种，区域性优势杂草23种。从世界范围来看，全世界每年因杂草危害而造成的经济损失约达400亿美元。除对农作物产量造成损失之外，杂草还能传播病虫害，影响人畜健康，破坏水利设施和风景景观，降低土地利用价值，提高农作物收获难度等，给人类生产和生活带来极大的不便。

化学除草剂的开发与应用开辟了杂草防除的新纪元，其可更高效地控制农田杂草的蔓延，与人工除草相比，它具有下述四个优点：省工省力、药效快、施用便捷、经济效益高。但是由于农民对化学除草剂使用的过度依赖和过量使用，随之也带来一些人类长期忽视的社会和生态问题，如土壤的农药残留超标，抗药性杂草种群的上升，河流的污染等，对环境和生态安全以及农业可持续发展构成了潜在威胁，这些问题日趋严重已引起世界范围的广泛关注。随着近年来人民群众环保意识的提高、对食品安全和低碳生活的关注，国家对农业可持续发展和积极构建生态文明的要求，减少化学除草剂使用的呼声日益高涨。

微生物源除草剂是指以微生物为研究对象开发制备的具有除草活性的制剂。微生物除草剂根据对微生物的利用方式可分成两类：一类是活体微生物除草剂，它是直接利用具有除草活性的活体微生物作为生物防治剂；另一类是农用抗生素除草剂，它是利用微生物次生代谢产物作为除草剂使用。真菌、细菌、病毒和放线菌是可用于微生物除草剂的潜力微生物资源。

较化学除草剂，微生物源除草剂具有显著的使用价值与商业价值：第一，防治谱较窄，表现出一定的选择性，仅对特定的对象表现除草活性；第二，使用中对人类以及家禽等比较安全；第三，除草活性物质在环境中的半衰期短，易于降解，对环境压力小；第四，微生物源除草剂在研发周期短、资金使用小。随着人们对生态环境安危意识的增强，以及农业可持续发展的要求，结合为微生物源除草剂自身开发与应用的优势，微生物除草剂等生物农药迎来了巨大的发展机遇。

植物生长调节剂是一类与植物激素具有相似生理和生物学效应的物质，对目标植物而言，植物生长调节剂是外源的非营养性化学物质，通常可在植物体内传导至作用部位，以低浓度促进或抑制其生命过程的某些环节，使之向符合人类的需要发展。因此，提供一种微生物及其次生代谢产物用作微生物源除草剂以及植物生长调节剂具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株淡紫拟青霉菌。

本发明的另一目的在于提供所述淡紫拟青霉菌在抑制植物生长中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株淡紫拟青霉菌，名称为Purpureocillium lilacinum Scaumcx04(淡紫拟青霉Scaumcx04)，保藏编号为GDMCC NO：60794，该菌株于2019年9月27日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。

一种上述淡紫拟青霉菌的孢子。

所述的淡紫拟青霉菌的孢子的制备方法，通过将上述淡紫拟青霉菌接种到培养基上，于28～30℃条件下进行培养，得到淡紫拟青霉菌的孢子。

所述的培养培养基为以大米、稻壳、小麦、小麦壳和马铃薯中的一种以上作物为原料制备的固体或液体培养基；优选为察氏培养基、麦芽汁培养基、马铃薯培养基或PDB培养基；更优选为马铃薯培养基或PDB培养基。

所述的培养的条件为：100～180r/min培养1～30天；优选为：120～180r/min培养7～14天；更优选为7天。

所述的培养的温度优选为28℃。

一种淡紫拟青霉菌培养物，通过培养上述淡紫拟青霉菌和/或淡紫拟青霉菌的孢子获得的。

所述的淡紫拟青霉菌培养物的制备方法，包括如下步骤：将上述淡紫拟青霉菌和/或淡紫拟青霉菌的孢子接种到培养基中，于28～30℃下进行培养，过滤，得到淡紫拟青霉菌培养物。

所述的培养基优选为PDB培养基。

所述的培养的温度优选为28℃。

所述的培养的条件为：100～180r/min培养1～30天；优选为：120～180r/min培养7～14天；更优选为7天。

所述的过滤优选为采用纱布进行过滤，以去除大块菌和杂质。

一种淡紫拟青霉菌次生代谢产物，通过如下任一种方法获得：

(A)将上述淡紫拟青霉菌培养物用有机溶剂萃取，蒸发浓缩，得到淡紫拟青霉菌次生代谢产物；其中，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿和正丁醇中的至少一种；

(B)将上述淡紫拟青霉菌培养物用有机溶剂萃取，蒸发浓缩，获得粗提物；然后将粗提物采用Sephadex G-200凝胶层析柱进行纯化，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，再减压浓缩，得到淡紫拟青霉菌次生代谢产物。

方法(A)和(B)中所述的蒸发浓缩的温度优选为45℃。

方法(A)中所述的萃取所用有机溶剂优选为乙酸乙酯。

方法(B)中所述的萃取所用有机溶剂优选为乙酸乙酯和乙醇中的至少一种。

方法(B)中所述的洗脱所用有机溶剂为氯仿和醇类中的至少一种。

所述的醇类为甲醇和乙醇中的至少一种。

方法(B)中所述的收集洗脱液优选为通过如下方法进行实现：每30min收集一管，共收集31份洗脱样品，并进行编号，为1-31号；然后将合并编号为1-9的洗脱液(组分1)，合并编号10-18的洗脱液(组分2)，以及合并编号为19-31的洗脱液(组分3)。

所述的淡紫拟青霉菌，淡紫拟青霉菌的孢子，淡紫拟青霉菌培养物和淡紫拟青霉菌次生代谢产物中的至少一种在抑制植物生长中的应用。

所述的抑制植物生长为通过抑制植物地上部分茎的生长和地下部分根的生长，和/或抑制植物种子萌发以延长发芽的时间来实现。

所述的应用为将淡紫拟青霉菌培养物或淡紫拟青霉菌次生代谢产物灌溉到植物根部，或将淡紫拟青霉菌培养物或淡紫拟青霉菌次生代谢产物喷施到植物上，或将植物种子浸泡到淡紫拟青霉菌培养物或淡紫拟青霉菌次生代谢产物中。

所述的植物为单子叶和双子叶植物；包括蔬菜、水果和杂草等；进一步包括茄科植物、禾本科植物、草本植物等；优选为黑麦草、番茄、烟草、萝卜苗、水稻、稗草和马齿苋中的至少一种；更优选为萝卜苗或稗草。

所述的淡紫拟青霉菌次生代谢产物的浓度为0.0001mg/ml～10mg/ml；优选为0.01～1mg/ml；更优选为1mg/mL；每株植物的施加量为1ml～200ml(优选为4～50mL；更优选为20～50mL)。

所述的淡紫拟青霉菌，淡紫拟青霉菌的孢子，淡紫拟青霉菌培养物和淡紫拟青霉菌次生代谢产物中的至少一种在制备植物生长调节剂或除草剂中的应用。

所述的草为单子叶和双子叶杂草；优选为稗草。

所述的淡紫拟青霉菌次生代谢产物的浓度为0.0001mg/ml～10mg/ml；优选为0.01～1mg/ml；更优选为1mg/mL。

一种植物生长调节剂，包含所述的淡紫拟青霉菌，淡紫拟青霉菌的孢子，淡紫拟青霉菌培养物和淡紫拟青霉菌次生代谢产物中的至少一种。

所述的植物生长调节剂还可以含有其他的载体，如乳剂等。

一种除草剂，包含所述的淡紫拟青霉菌，淡紫拟青霉菌的孢子，淡紫拟青霉菌培养物和淡紫拟青霉菌次生代谢产物中的至少一种。

所述的除草剂还可以含有其他的载体，如乳剂等。

所述的淡紫拟青霉菌次生代谢产物的有效浓度为0.0001mg/ml～10mg/ml；优选为0.01～1mg/ml。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明是从马齿苋中分离并鉴定具有潜在除草活性的真菌菌株淡紫拟青霉(Purpureocillium lilacinum)，将其命名为scaumcx04。该淡紫拟青霉的孢子，淡紫拟青霉培养液，淡紫拟青霉培养液的萃取物，淡紫拟青霉培养液的萃取物的浓缩物(浸膏)，以及淡紫拟青霉产生的次生代谢产物(主要成分的含量为0.01％～100wt％)能够抑制植物地上部分茎的生长和地下部分根的生长，同时能够抑制植物种子萌发，延长发芽的时间，因此可将其作为植物生长的调节剂。

(2)本发明中的淡紫拟青霉的发酵液和次生代谢产物对植物(稗草等)生长的抑制效果较为明显，加入淡紫拟青霉发酵液中的植物叶片明显发黄，其效果甚至比乙草胺的效果明显，因此可将其作为植物除草剂，为新的微生物除草剂的开发提供一种有效途径。

附图说明

图1是淡紫拟青霉菌的菌落形态图；其中，A为PDA培养皿的正面；B为PDA培养皿的反面。

图2是淡紫拟青霉菌的显微形态图；其中，A为分生孢子梗；B为分生孢子和菌丝体；C为分生孢子。

图3是淡紫拟青霉菌发酵液对植物生长的影响图；其中，A为淡紫拟青霉菌发酵液对萝卜苗的影响；B为淡紫拟青霉菌发酵液对稗草的影响。

图4是淡紫拟青霉菌与除草剂对植物生长抑制效果的对比图；其中，A为淡紫拟青霉发酵液以及0.5mg/mL的淡紫拟青霉发酵液次生代谢产物(淡紫拟青霉发酵液粗提物)与除草剂(0.5mg/mL乙草胺和精喹禾灵乳油)对植物生长的抑制效果；B为淡紫拟青霉发酵液以及2.5mg/mL的淡紫拟青霉发酵液次生代谢产物(淡紫拟青霉发酵液粗提物)与除草剂(2.5mg/mL乙草胺和精喹禾灵乳油)对植物生长的抑制效果。

图5是不同处理的萝卜幼苗生长情况图。

图6是不同组分处理的稗草幼苗生长情况图。

图7是实施例6中的土培平面种植图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的培养基、试剂、方法和设备为本技术领域常规培养基、试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用培养基、试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1淡紫拟青霉菌的筛选、分离以及鉴定

1、菌株的分离纯化

将马齿苋(来源于广东广州某地)的茎、根用自来水洗净，晾干，75％(w/w)酒精浸泡2min，无菌水冲洗，0.1％(w/w)氯化汞浸泡1.5min，无菌水冲洗；叶用自来水洗净，晾干，75％(w/w)酒精浸泡2min，无菌水冲洗，0.1％(w/w)氯化汞浸泡30s，无菌水冲洗。最后一遍清洗的无菌水涂板(LB)，作为空白对照，排除马齿苋表面微生物干扰，根茎叶切成小块种植于PDA培养基上，28℃培养箱培养。用平板画线法把长出来的菌不断挑纯，直到变成单一菌落，将分离得到菌株命名Scaumcx04。

2.菌株的形态以及ITS鉴定

(1)菌株形态特征

将菌株Scaumcx04接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯/葡萄糖/琼脂，购买于广东环凯微生物科技有限公司，每升含马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂15g)上进行培养(28℃培养箱)。菌落形态如图1所示：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基:菌落圆形，丝绒状，菌丝体初为自色，产孢后呈现淡紫色，表面无分泌物。菌落反面呈无色至淡黄色。

(2)显微形态特征

将菌株Scaumcx04置于显微镜下观察，结果如图2所示：分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，长度为19μm～35μm。通常3～5个瓶梗着生于分生孢子梗顶部。瓶梗基部柱状或瓶状，向上变为细长管状，大小为(7.5～9.0)μm×(1.8～3.0)μm。分生孢子为卵形或纺锥形，大小为(1.5～2.8)μm×(1.3～2.5)μm，单生或在孢子梗上呈链状排列。

(3)样品Scaumcx04的ITS测序序列如下:

AACCCACTGTGACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGACCGCCCCGGCCGCCGCGCAAGCGGCGCCGGACTCCAAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCAAAACTCTTTTGCATTACGCCCAACGGCGGGAATTTTTTCTCTGAGTGCATAAGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGGG。

菌株Scaumcx04的ITS测序序列与Purpurecilium lilacinum(淡紫拟青霉)同源性达99.72％，其培养特征及显微形态特征与Purpurecilium lilacinum(淡紫拟青霉)最相似。根据鉴定，该样品为Purpurecilium lilacinum(淡紫拟青霉)。因此，将本发明筛选得到的菌株Scaumcx04命名为淡紫拟青霉(Purpureocillium lilacinum)Scaumcx04，该菌株于2019年9月27日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60794。

实施例2淡紫拟青霉培养液的不同溶剂萃取物对植物生长的影响

(1)配制1L的PDB培养液(即液体PDB培养基)，装入2L三角瓶封口，于121℃下高温高压灭菌30min后备用。在无菌条件下将淡紫拟青霉Scaumcx04(直径为0.5cm的菌种)接种于装有PDB培养液的摇瓶中，随后将接菌的摇瓶放在摇床上培养7d，其中摇床的温度为28℃，转速为180r/min。培养一周后将培养液取出，获得相应的内生菌菌液。

(2)将所得的菌液用纱布过滤(去除大块菌杂)取得上清液，并分为三等分，随后分别在上清液中加入等体积的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚进行萃取。萃取后将所得的有机相转移至250mL圆底烧瓶中，置于旋转蒸发仪上，在温度45℃的条件下蒸发浓缩，得到浸膏。最终得到三种有机溶剂萃取的淡紫拟青霉发酵液粗体物并分别称重。

(3)将所得三种发酵液粗提物用蒸馏水配置成浓度为0mg/mL(ck)、0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL的溶液。

(4)准备若干大小相同的培养皿，在其内垫上滤纸。取大小、色泽和饱满程度基本一致的萝卜苗种子适量，然后将萝卜苗种子16粒整齐置于垫有滤纸的培养皿中，每个处理加入4mL不同浓度的淡紫拟青霉发酵液粗体物溶液，均设置3个重复。

(5)每天定时观察萝卜苗的长势，并在4d后取出培养皿中的种子，分别统计每个培养皿中种子的发芽率以及发芽种子的平均根长和平均芽长并拍照记录。结果如表1所示。

本实验通过用不同有机溶剂萃取淡紫拟青霉菌液获得的不同次生代谢产物后用其培养萝卜苗并观察其对生长的影响，以此判断哪种有机溶剂萃取出的化合物中含有的抑制植物生长的有效成分多。通过观察表1可发现用石油醚萃取的化合物对萝卜苗的生长影响并不明显，而用乙酸乙酯和正丁醇萃取的化合物对植物生长的影响较为明显，且对萝卜苗根部的生长抑制作用较为明显。由此可知由乙酸乙酯或正丁醇萃取的化合物种对抑制植物生长的有效成分含量较高，且淡紫拟青霉次生代谢产物对植物根部生长的抑制作用较为明显。但是用乙酸乙酯萃取相较于正丁醇来说更加方便，故选择用乙酸乙酯萃取的化合物进行后续实验。

表1不同有机溶剂萃取的淡紫拟青霉次生代谢产物对萝卜苗生长的影响

注：表1中不同有机溶剂(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)为不同批次的实验结果，因此每一批次都做了空白对照。

实施例3、淡紫拟青霉培养液乙酸乙酯萃取物对不同植物生长的影响

(1)配制1L的PDB培养液，装入2L三角瓶封口，于121℃下高温高压灭菌30min后备用。在无菌条件下将淡紫拟青霉Scaumcx04(直径为0.5cm的菌种)接种于装有PDB培养液的摇瓶中，随后将接菌的摇瓶放在摇床上培养7d，其中摇床的温度为28℃，转速为180r/min。培养一周后将培养液取出，获得相应的内生菌菌液。

(2)将所得的菌液用纱布过滤得上清液，随后在上清液中加入等体积的乙酸乙酯进行萃取。萃取后将所得的有机相分多次转移至250mL圆底烧瓶中，置于旋转蒸发仪上，在温度45℃的条件下蒸发浓缩，直到得到浸膏，最终得到浓缩后的淡紫拟青霉发酵液粗体物并称重，随后将其放入4℃冰箱保存。

(3)将淡紫拟青霉的发酵液粗提物用蒸馏水配置成浓度为0mg/mL(ck)、0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL的溶液。

(4)准备若干大小相同的培养皿，在其内垫上滤纸。取大小、色泽和饱满程度基本一致的黑麦草种子适量，然后将黑麦草种子36粒整齐置于垫有滤纸的培养皿中，每个处理加入4mL不同浓度的淡紫拟青霉发酵液粗体物溶液，均设置3个重复。

(5)每天定时观察黑麦草的长势，并在3d后补加4mL蒸馏水。7d后取出培养皿中的种子，分别统计每个培养皿中种子的发芽率以及发芽种子的平均根长和平均芽长并拍照记录。

(6)同样的用不同浓度的淡紫拟青霉发酵液粗体物溶液培养番茄(购自广东省农科院蔬菜研究所)、萝卜苗(快大339，购自广东省农科院蔬菜研究所)、水稻(黄花占，购自广东省农科院蔬菜研究所)、稗草(购自广东省农科院蔬菜研究所)，黑麦草(购自广东省农科院蔬菜研究所)。方法同上，根据种子大小不同，培养皿中种子数量有所不同，番茄25粒，萝卜苗20粒，水稻20粒，稗草25粒，黑麦草36粒。

从表2的数据可以看出：淡紫拟青霉的次生代谢产物对萝卜苗、黑麦草和番茄生长都有所抑制，长势均不如空白对照组。在浓度为1mg/mL的溶液中黑麦草甚至全未发芽，且在其他浓度下黑麦草的根长和芽长也随溶液浓度的升高而有所降低；萝卜苗和番茄虽然发芽率与空白对照组差别不大，但其根长和芽长还是与空白对照组有明显区别，都随着溶液浓度的升高而生长受到了抑制，且根部受到的影响更大。由此可判断淡紫拟青霉次生代谢产物在一定程度上对植物的生长起抑制作用，且对根部的影响更为明显。

表2淡紫拟青霉次生代谢产物对不同植物生长的影响

实施例4淡紫拟青霉培养液对植物生长的影响

(1)将淡紫拟青霉Scaumcx04进行发酵培养获得发酵液(方法同实施例3步骤(1))，并将所得的菌液用纱布过滤取得上清液。将上清液平均分为两，其中一份加入等量的蒸馏水稀释一倍。

(2)准备若干大小相同的容器，在每个容器中先加入25g土壤，然后均匀的放入30粒稗草种子和30粒萝卜苗种子(种子的大小、色泽和饱满程度基本一致)(快大339，购自广东省农科院蔬菜研究所)，最后再铺上25g土壤。每个处理分别加入50mL的蒸馏水(ck)、淡紫拟青霉发酵液和稀释一倍后的淡紫拟青霉发酵液。均设置2个重复。

(3)每天定时观察萝卜苗和稗草的长势，并在7d后取出容器中的种子，分别统计每个容器中种子的发芽率以及发芽种子的平均根长和平均芽长并拍照记录。

结果如图3和表3所示：本实验通过用淡紫拟青霉发酵液在土壤中培养稗草和萝卜苗，观察其生长状况来判断淡紫拟青霉发酵液对植物的生长是否有抑制作用。稗草和萝卜苗经过七天不同浓度的淡紫拟青霉发酵液的培养可以明显的看出淡紫拟青霉发酵液对两种植物的生长有一定的抑制作用，且未经稀释的淡紫拟青霉发酵液抑制效果更为明显。由此可以判断淡紫拟青霉发酵液同样对植物的生长有一定的抑制作用。

表3淡紫拟青霉发酵液对植物生长的影响

实施例5淡紫拟青霉发酵液及其粗提物对植物生长的抑制效果

(1)将淡紫拟青霉进行发酵培养获得淡紫拟青霉发酵液(方法同实施例3步骤(1))，并将所得的淡紫拟青霉发酵液用纱布过滤、加入等体积的乙酸乙酯进行萃取、蒸发浓缩制备发酵液粗提物，即淡紫拟青霉粗提物(方法同实施例3步骤(2))。然后将淡紫拟青霉发酵液粗提物(淡紫拟青霉发酵液次生代谢产物)分别用蒸馏水配置成浓度为0.5mg/mL(第①组)和2.5mg/mL(第②组)的溶液。取适量的市售50％乙草胺(每升含有效成份500克)和5％精喹禾灵乳油(每升含有效成份50克)，同样用蒸馏水配置成浓度为0.5mg/mL和2.5mg/mL的溶液(根据浓度的不同相应设置2组实验)。

(2)准备若干大小相同的容器，在每个容器中先加入10g土壤，然后均匀的放入10粒稗草种子和10粒萝卜苗种子(种子的大小、色泽和饱满程度基本一致)(快大339，购自广东省农科院蔬菜研究所)，最后再铺上10g土壤。每个处理分别加入20mL的不同浓度的淡紫拟青霉发酵液、淡紫拟青霉发酵液粗体物、乙草胺和精喹禾灵，均设置3个重复。

(3)每天定时观察萝卜苗和稗草的长势，并在7d后取出容器中的种子，分别统计每个容器中种子的发芽率以及发芽种子的平均根长和平均芽长并拍照记录。

结果如图4和表4所示：通过所得的数据可以发现对于在土壤中种植的稗草和萝卜苗，淡紫拟青霉次生代谢产物对其生长的抑制效果并不明显，而淡紫拟青霉发酵液对植物生长的抑制效果较为明显，加入淡紫拟青霉发酵液中的萝卜苗叶片明显发黄，其效果甚至比乙草胺的效果明显。由此可以判断淡紫拟青霉发酵液对植物生长是起一定的抑制效果，且效果明显。

表4淡紫拟青霉与除草剂对植物生长抑制效果的对比

实施例6

(1)粗提物的制备：在超净工作台中取PDA培养基上已活化的淡紫拟青霉菌菌落，挑入已灭菌的PDB培养基中，封口，25℃恒温培养振荡器中培养15d，获得发酵培养液约40L。发酵液经纱布过滤除去菌渣后，用等体积的乙酸乙酯连续萃取3次，减压浓缩至干，得到约3g粗提物(浸膏)。

(2)组分的制备：

Sephadex G-200凝胶层析：先将Sephadex G-200凝胶经预处理(用甲醇浸泡4小时)，然后将其装45mm*150mm的Sephadex G-200凝胶层析柱中，装至约3/4层析柱高度，向柱内注入乙酸乙酯使填料均匀并略高于凝胶层，然后加入2g粗提物(浸膏)，用甲醇、流速2ml/min进行洗脱，每30min的洗脱液分装编号，共得到31份洗脱馏分。对得到的31份样品进行点样，合并，编号1-9馏分合并为组分1，编号10-18的馏分合并为组分2，编号19-31馏分合并为组分3。经旋转蒸发仪真空减压浓缩得到相应的浸膏，分别是组分1，组分2，组分3。

(3)不同组分除草活性的测定：称取25g营养土至塑料培养盒中，按照图7(方式放置萝卜(快大339，购自广东省农科院蔬菜研究所)和稗草种子(各36粒)，而后再覆盖25g营养土。用去离子水将组分1、组分2、组分3以及粗提物分别配置成1mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L的溶液。以水为对照，每组设置两个重复，每个培养盒中均匀加入50ml配置好的溶液。加完溶液后用的保鲜膜将塑料培养盒包裹，保持湿润，送至恒温(26℃)培养室中育苗，3d后取下保鲜膜，7d后观测各组萝卜苗、稗草的发芽状况和根苗长度，测量时的幼苗如图5和图6所示。从图中可以明显看出，随着组分浓度的增加，对稗草和萝卜苗幼苗的抑制效果增强，相同的条件下，组分2和组分3的效果最明显。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株淡紫拟青霉菌及其在抑制植物生长中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 359

<212> DNA

<213> Purpurecilium lilacinum

<220>

<223> Scaumcx04的ITS测序序列

<400> 1

aacccactgt gaccttacct cagttgcctc ggcgggaccg ccccggccgc cgcgcaagcg 60

gcgccggact ccaaggcgcc cgccgcaggg acccaaaact cttttgcatt acgcccaacg 120

gcgggaattt tttctctgag tgcataagca aaacaaatga atcaaaactt tcaacaacgg 180

atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc 240

agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg cccgccagca ttctggcggg 300

catgcctgtt cgagcgtcat ttcaaccctc gagccccccc gggggcctcg gtgttgggg 359

Claims (10)

1.一株淡紫拟青霉菌，其特征在于：名称为Purpureocillium lilacinum Scaumcx04，保藏编号为GDMCC NO：60794，该菌株于2019年9月27日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。

2.一种权利要求1所述的淡紫拟青霉菌的孢子。

3.权利要求2所述的淡紫拟青霉菌的孢子的制备方法，其特征在于：通过将权利要求1所述的淡紫拟青霉菌接种到培养基上，于28～30℃条件下进行培养，得到淡紫拟青霉菌的孢子；

所述的培养培养基为以大米、稻壳、小麦、小麦壳和马铃薯中的一种以上为原料制备的固体或液体培养基；

所述的培养的条件为：100～180r/min培养1～30天。

4.一种淡紫拟青霉菌培养物，其特征在于：通过培养权利要求1所述的淡紫拟青霉菌和/或权利要求2所述的淡紫拟青霉菌的孢子获得的。

5.权利要求4所述的淡紫拟青霉菌培养物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的淡紫拟青霉菌和/或权利要求2所述的淡紫拟青霉菌的孢子接种到培养基中，于28～30℃下进行培养，过滤，得到淡紫拟青霉菌培养物；

所述的培养基为PDB培养基；

所述的培养的条件为：100～180r/min培养1～30天；

所述的过滤为采用纱布进行过滤。

6.一种淡紫拟青霉菌次生代谢产物，其特征在于，通过如下任一种方法获得：

(A)将权利要求4所述的淡紫拟青霉菌培养物用有机溶剂萃取，蒸发浓缩，得到淡紫拟青霉菌次生代谢产物；其中，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿和正丁醇中的至少一种；

(B)将权利要求4所述的淡紫拟青霉菌培养物用有机溶剂萃取，蒸发浓缩，获得粗提物；然后将粗提物采用Sephadex G-200凝胶层析柱进行纯化，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，再减压浓缩，得到淡紫拟青霉菌次生代谢产物；

方法(A)中所述的萃取所用有机溶剂为乙酸乙酯；

方法(B)中所述的萃取所用有机溶剂为乙酸乙酯和乙醇中的至少一种；

方法(B)中所述的洗脱所用有机溶剂为氯仿和醇类中的至少一种；

所述的醇类为甲醇和乙醇中的至少一种。

7.权利要求1所述的淡紫拟青霉菌，权利要求2所述的淡紫拟青霉菌的孢子，权利要求4所述的淡紫拟青霉菌培养物和权利要求6所述的淡紫拟青霉菌次生代谢产物中的至少一种在抑制植物生长中的应用，其特征在于：

所述的植物为蔬菜、水果和杂草；进一步为黑麦草、番茄、烟草、萝卜苗、水稻、稗草和马齿苋中的至少一种。

8.权利要求1所述的淡紫拟青霉菌，权利要求2所述的淡紫拟青霉菌的孢子，权利要求4所述的淡紫拟青霉菌培养物和权利要求6所述的淡紫拟青霉菌次生代谢产物中的至少一种在制备植物生长调节剂或除草剂中的应用。

9.一种植物生长调节剂，其特征在于：包含权利要求1所述的淡紫拟青霉菌，权利要求2所述的淡紫拟青霉菌的孢子，权利要求4所述的淡紫拟青霉菌培养物和权利要求6所述的淡紫拟青霉菌次生代谢产物中的至少一种。

10.一种除草剂，其特征在于：包含权利要求1所述的淡紫拟青霉菌，权利要求2所述的淡紫拟青霉菌的孢子，权利要求4所述的淡紫拟青霉菌培养物和权利要求6所述的淡紫拟青霉菌次生代谢产物中的至少一种。

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