CN112715301A - 一种利用爪哇棒束孢促进水稻生长和驱避害虫的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用爪哇棒束孢促进水稻生长和驱避害虫的方法，涉及微生物技术领域。本发明提供的爪哇棒束孢菌株(Isaria javanica)JS001，是分离自感菌烟粉虱的昆虫病原真菌，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3.20237。所用微生物菌剂，其有效成分为上述爪哇棒束孢JS001。所述爪哇棒束孢JS001以及含有该菌的微生物菌剂能够促进水稻生长，提高植物抗逆性，驱避褐飞虱，减少害虫的危害。

Description

一种利用爪哇棒束孢促进水稻生长和驱避害虫的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用爪哇棒束孢促进水稻生长和驱避害虫的方法。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物，水稻的产量关系我国粮食安全，而农药和化肥是影响水稻产量重要因素。近年来，农药化肥使用量的不断增加，在防治害虫危害和增加农业产量的同时，也给农业生态环境造成了土壤板结、耕地退化、农作物害虫抗药性、生态条件恶化、农产品质量下降、耕种成本增加等一系列问题。我国作为农业大国，在农药和化肥的使用方面已远远高出发达国家水平。随着人民生活水平不断提高，优质农产品和绿色食品已成为当前社会和农业生产的迫切需求。为此，寻求开发安全有效的生物制剂已成为当前阶段的重点。

生物制剂中含有特定微生物活体的制品，能够通过其中所含微生物的生命活动，改善土壤和植物的内生菌群结构，促进植物生长，提高植物抗逆性，改善农产品品质及农业生态环境。昆虫病原微生物作为害虫生物防治的重要微生物资源，是化学农药的环境友好型替代品；除直接感染昆虫外，也能为植物提供多种益处，包括促进植物生长，诱导植物系统防御，对害虫天敌安全。

爪哇棒束孢是一类重要的昆虫病原真菌，隶属盘菌亚门(Pezizomycotina)粪菌纲(Sondariomycetes)肉座菌目(Hypocrellales)虫草科(Conlycipitaceae)。该菌对烟粉虱、稻飞虱、蓟马、蚜虫等具有较好的侵染活性，同时具有促进植物生长的特性，符合有害生物综合治理的宗旨。因此，以该菌为主体开发微生物菌剂，能够兼具促生长和抗虫害的功能，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种利用爪哇棒束孢促进水稻生长和驱避害虫的方法，该菌是一种昆虫病原真菌，能促进植物生长，减少害虫危害，可应用于植物促生剂或微生物肥料的制备。

本发明的第二目的是提供一种微生物菌剂，其活性成分为爪哇棒束孢JS001。

在一个具体实施方案中，所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。

在一个优选的实施方案中，当所述微生物菌剂为固体菌剂时，所述微生物菌剂含所述爪哇棒束孢JS001的活菌数量为5×10³个孢子/克至5×10⁹个孢子/克；当所述微生物菌剂为液体菌剂时，所述微生物菌剂含所述爪哇棒束孢JS001的活菌数量为5×10³个孢子/毫升至5×10⁹个孢子/毫升。

在一个具体实施方案中，当所述微生物菌剂为固体菌剂时，所述微生物菌剂还包括固体载体。优选地，所述固体载体包括二氧化硅、凹凸棒土、滑石粉、高岭土和碳酸钙中的一种或多种。

在一个具体实施方案中，所述固体菌剂还包括抗氧化剂、粘结剂和保水剂中的一种多种。

优选地，抗氧化剂选自维生素C、维生素E以及柠檬酸中的一种或多种。

优选地，粘结剂选自麦芽糖和/或糊精。

优选地，保水剂选自吸水性树脂、甘露醇和海藻糖中的至少一种。

本发明的目的之三是提供上述微生物菌剂在促进植物幼苗生长和驱避害虫中的应用。

本发明提供上述微生物菌剂在促进水稻幼苗生长中的应用。

本发明提供上述微生物菌剂在驱避水稻褐飞虱中的应用。

本发明提供的微生物菌剂具有以下优点：1)本发明的微生物菌剂为纯生物制剂，对人体无害，不污染环境，适用于有机农产品生产需求；2)本发明的微生物菌剂种子处理或施入土壤后可以有效促进水稻幼苗的生长；同时对降低虫害的发生具有积极作用。

附图说明

图1是微生物菌剂处理水稻种子对褐飞虱寄主选择行为的影响，图1A：5×10³个孢子/毫升；图1B：5×10⁶个孢子/毫升；图1C：5×10⁹个孢子/毫升

具体实施方案

实施例1爪哇棒束孢JS001培养及其菌剂的制备方法

1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯浸粉6g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1.0L，pH 5.6±0.2；高温灭菌(121℃，20min)；

2)孢子粉的获得：挑取活化后的爪哇棒束孢JS001孢子粉，置于无菌水中，混匀，制成菌悬液；取100μL菌悬液到PDA平板上，在27±1℃培养10～15天，用无菌水冲洗出平板上的孢子；

3)发酵培养：将水稻种子蒸熟，装入保鲜袋中，待其冷却至常温后，接种孢子粉，在27±1℃条件下培养12天，收获分生孢子；

4)收获的菌丝和孢子经2层无菌纱布过滤，获得孢子悬液，再经12000r/min离心1min后，弃上清，获得孢子。

5)微生物固体菌剂，将孢子悬液喷洒到固体载体上，制成5×10³个/克～5×10⁹个/克的菌剂；微生物液体菌剂，将获得的孢子悬浮于0.01％Triton X-100无菌水溶液中，充分搅拌震荡，得到孢子母液，然后将孢子浓度调整到5×10³个/毫升～5×10⁹个/毫升。

实施例2微生物菌剂对水稻种子萌发和水稻苗生长的促生作用

①菌悬液的准备：将菌株接种于PDA培养基中，27±1℃培养10天，用0.01％TritonX-100 无菌水溶液冲洗出孢子，然后经2层无菌纱布过滤，获得孢子悬液，经血球计数板计数，制备浓度为5×10⁹个/毫升的菌悬液，然后稀释至所需浓度。

②种子表面消毒：取南粳5055水稻种子，先用自来水清洗3-5次，筛选出颗粒饱满的健康种子；用4％NaClO溶液浸泡4h(期间多次搅动)；然后用70％酒精灭菌3min，再用无菌水反复冲洗多次。将处理好的种子分成4组，分别用无菌0.01％Triton X-100水溶液及浓度为5×10³、5×10⁶、5×10⁹个孢子/毫升爪哇棒束孢菌悬液浸泡24h。

③将处理好的水稻种子均匀的铺在有两层滤纸(已灭菌；保湿)的培养皿中，每皿50粒，分别加入无菌水10ml，每处理重复3次。置于光照培养箱(温度28±1℃，相对湿度60％-70％，光暗周期16L：8D)中，培养3天，期间每天观察记录水稻种子的发芽情况，并采用称重法补充蒸发的水分(添加无菌水)，统计水稻种子的发芽势。培养8d，从每个处理中随机抽取10粒水稻种子，分别测定根长、芽长、根鲜重和芽鲜重，并统计水稻种子的发芽率。以水稻种子根长为芽长的两倍为发芽标准。发芽势和发芽率的计算公式如下：

发芽势＝3天内的发芽种子粒数/供试种子数×100％

发芽率＝8天内的发芽种子粒数/供试种子数×100％

④数据分析：各处理间的差异显著性采用邓肯氏新复极差法。

表1微生物菌剂对水稻种子萌发和水稻苗生长的促生作用

处理

发芽势(％)

发芽率(％)

根长(cm)

芽长(cm)

根鲜重(mg)

芽鲜重(mg)

5×10<sup>9</sup>个孢子/毫升

96.67±0.67a

98.67±1.33a

9.1±0.17a

6.3±0.12a

22.76±1.45a

31.26±0.94a

5×10<sup>6</sup>个孢子/毫升

92.00±1.15b

98.67±0.67a

8.2±0.12b

5.8±0.07b

20.57±0.71ab

29.95±0.34a

5×10<sup>3</sup>个孢子/毫升

86.67±0.67c

97.33±1.33a

7.6±0.03c

5.6±0.00c

17.79±0.60bc

26.15±0.90b

CK

85.33±1.76c

98.00±1.15a

7.4±0.09c

5.3±0.03d

17.09±0.76c

25.52±1.05b

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

⑤结果与分析：由表1可以看出，微生物菌剂在水稻种子萌发速度、根长、芽长、根鲜重和芽鲜重等方面具有显著的促生作用，尤其是浓度为5×10⁶个孢子/毫升和5×10⁹个孢子/毫升处理。

实施例3微生物菌剂处理水稻种子对褐飞虱寄主选择行为的影响

①采用实施例2的方法，获得不同浓度菌剂处理水稻种子的水稻苗(培养8天)。

②取褐飞虱成虫(羽化后1-2天)，饥饿2小时。

③取水稻苗10棵，剪取茎叶部分，放到无菌玻璃管中(直径3.0cm，高12.0cm)，底部加无菌水5ml。将褐飞虱成虫放到打孔培养皿(直径1.0cm，孔间距6.0cm)中，将培养皿置于玻璃管上，两玻璃管分别为菌剂处理水稻种子的水稻苗和无菌水处理水稻种子的水稻苗。置于无光照培养箱中，4h后观察记录玻璃管中褐飞虱的数量。

④数据分析，趋向指数(％)＝玻璃管中虫数/虫总数。处理间的趋向差异显著性采用独立方差t检验。

⑤结果发现，褐飞虱成虫在对5×10⁶个孢子/毫升(t＝-2.429，P＝0.026)和5×10⁹个孢子/毫升(t＝-4.613，P＜0.0001)菌悬液处理过水稻种子的水稻苗与无菌水处理水稻种子的水稻苗间，对无菌水处理种子的水稻有明显的寄主选择趋向。说明爪哇棒束孢处理种子后，可以驱避褐飞虱，降低其对水稻危害。

实施例4微生物菌剂对农田土栽培水稻生物量的影响

采用盆栽试验法测定微生物菌剂对农田土栽培水稻的促生作用。取南粳5055水稻种子，先用自来水清洗3-5次，筛选出颗粒饱满的健康种子；用4％NaClO溶液浸泡4h(期间多次搅动)；然后用70％酒精灭菌3min，再用无菌水反复冲洗多次，催芽2天。采用含部分有机质的水稻田土壤(使用前用10目网筛筛除秸秆、石块等杂质)，按照土壤含菌量10⁸个孢子/克，将微生物固体菌剂与土壤混匀，装入1.0L塑料杯；对照以同质量的固体载体混匀到土壤中。然后每杯播种3粒催芽后的水稻种子，浇水300ml，置于水稻田田埂上。待种子出芽后，每杯浇水刚淹没土壤。以后，每隔2天补水一次。经过40天培育后，沿土面剪取植株地上部分，然后取出土壤，将根系用水清洗干净，测量水稻的株高，然后将植株地上部分和根系，65℃烤至恒重，用分析天平测量植株的生物量。

结果表明，微生物菌剂处理的水稻株高，地上部分干重，根干重分别比对照组增加10.92％(P＜0.0001)，14.31％(P＜0.0001)，23.67％(P＜0.0001)(具体结果见表2)。

表2微生物菌剂对农田土栽培水稻生物量的影响

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

实施例5微生物菌剂对褐飞虱行为的影响

采用实施例4的方法，获得培育40天的水稻。将微生物菌剂处理组和对照组的盆栽苗分别放在褐飞虱发生的水稻田中，每点放两盆(间距20cm)，处理和对照各一盆，放置10个点，每天观察稻苗上褐飞虱的数量，连续观察7天。期间隔天浇一次水，使水高于土壤2.0cm。

结果表明，放置后一周内，处理组与对照组水稻上飞虱平均数量分别为：0.4 vs2.2；0.5 vs 5.2；1.3 vs 6.1；1.4 vs 7.3；1.3 vs 7.0；1.8 vs 7.4；1.5 vs 8.5。微生物菌剂处理的褐飞虱数量远低于对照组，说明微生物菌剂处理可以降低褐飞虱危害水稻。

最后应说明的是：以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种利用爪哇棒束孢促进水稻生长和驱避害虫的方法，其特征在于，所用爪哇棒束孢(Isaria javanica)菌株为爪哇棒束孢JS001，其保藏编号为CGMCC No.3.20237。

2.依据权利要求1所述一种利用爪哇棒束孢促进水稻生长和驱避害虫的方法，其特征在于：所述的害虫为褐飞虱。

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