CN108865900A - 一种爪哇棒束孢菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种爪哇棒束孢菌株，其分类命名为Isaria javanica，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2018.04.28，保藏编号为CCTCC M 2018241。本发明的爪哇棒束孢菌株分离自感染爪哇棒束孢的普通大蓟马成虫，其可用于防治普通大蓟马。通过大量的生物学实验证明，本发明的爪哇棒束孢菌株不仅能寄生普通大蓟马二龄若虫和成虫，且对普通大蓟马的控制效果达80％以上。

Description

一种爪哇棒束孢菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种爪哇棒束孢菌株，属于微生物技术领域，

背景技术

普通大蓟马[Megalurothrips usitatus(Bagnall)]，是缨翅目蓟马亚族大蓟马属(MegalurothripsBagrall)昆虫。在中国，该虫分布于海南、台湾、陕西、广西、贵州、湖北等省(区)，国外则分布于日本、菲律宾、印度、斯里兰卡、澳大利亚、马来西亚、斐济等国家。普通大蓟马主要为害豆类植物,近些年来，该虫已成为海南省豇豆上的主要害虫，其若虫和成虫为害嫩芽、花朵和嫩荚，使其生长停滞、叶片萎缩与畸形、落花落荚等，严重造成豇豆减产，轻则达20％-30％，严重可达50％-80％，甚至绝产。当蓟马严重为害时，农户便加大用药量，增加施用频次，或使用高毒农药防治，严重威胁了农产品的质量安全，且长期采用以农药为主的化学防治措施，会导致普通大蓟马对农药的敏感度降低，甚至产生一定程度的抗药性。

棒束孢属(Isaria.sp)隶属盘菌亚门(Pezizomycotina)粪菌纲(Sondariomycetes)肉座菌目(Hypocrellales)虫草科(Conlycipitaceae)。最早由Persoon提出该属。1821年，Fries将Isariafarinosa(Holm:Fr.)Fr.选定为其模式种。截至目前，该属中已有大约50余种菌被描述，且均为昆虫病原真菌。种间主要以产孢结构、分生孢子以及分生孢子梗形态加以区分。在我国，目前已有记录的棒束孢属真菌约16种，其中较为常见，研究最多的为玫烟色棒束孢、蝉棒束孢、粉棒束孢等。目前，国内外目前对棒束孢的研究主要包括分类鉴定、对昆虫的致病力测定、生物防治的应用等方面，关于爪哇棒束孢的研究资料很少。

发明内容

本发明的目的是提供一种爪哇棒束孢菌株BS-1，该菌株对普通大蓟马具有高效生物防治功能。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种爪哇棒束孢菌株，分类命名：Isaria javanica，于2018年4月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018241。

本发明的爪哇棒束孢菌株分离自感染爪哇棒束孢的普通大蓟马成虫。

本发明人将采自海南省6个豇豆主产区感染爪哇棒束孢的普通大蓟马成虫经虫体表面消毒后置于培养皿上培养，该爪哇棒束孢菌株的菌落在PDA培养基上生长较慢，待长出菌丝后，经菌落形状形态学观察，菌落直径可达3.3～0.4cm，菌落正面棉状，气生菌丝发达，白色，背面为淡黄色，该菌分生孢子梗呈现瓶状或球形，在菌丝端部或者短侧枝上轮生，分生孢子为单胞链状，分生孢子卵圆形或长椭圆形。

本发明的爪哇棒束孢菌株的ITSrRNA序列如SEQ ID NO:1所示，经分子生物学鉴定、ITS序列比对、系统发育分析，确定该菌为爪哇棒束孢,命名为BS-1。

上述爪哇棒束孢菌株用于防治普通大蓟马的应用。通过大量的生物学实验证明，本发明的爪哇棒束孢菌株不仅能寄生普通大蓟马二龄若虫和成虫，且对普通大蓟马的控制效果达80％以上。

本发明的有益效果：本发明的爪哇棒束孢菌株对普通大蓟马二龄若虫、成虫具有很高的寄生能力，并具有高效杀虫活性，该爪哇棒束孢菌株对普通大蓟马的生物防治具有很大的应用潜力。

附图说明

图1为本发明的爪哇棒束孢菌株在PDA培养基上培养12d后的菌落形态图；

图2为本发明的爪哇棒束孢菌株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明的爪哇棒束孢菌株和相近菌株类群系统发育树；

图4为本发明的爪哇棒束孢菌株对普通大蓟马二龄若虫和成虫的寄生过程。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1菌株的获得：

将采自海南省6个豇豆主产区感染爪哇棒束孢的普通大蓟马成虫用75％酒精表面消毒30秒，0.1％升汞溶液表面消毒30秒后，用无菌水漂洗三次，置于灭菌滤纸上晾干，将晾干的普通大蓟马成虫置于备好的SDAY培养基上，每皿放置5头成虫；然后将培养皿置于25℃的恒温培养箱内培养，定期观察，将长出的菌丝挑至新的SDAY培养基上，菌丝长满后4℃保存。

所述SDAY培养基(萨氏葡萄糖琼脂培养基)配方：葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母膏10g，琼脂20g，蛋黄1ml，低脂牛奶10ml，补充水至1000ml。培养基45℃时，加入乳酸，摇匀后倒至直径9cm培养皿中，待用。

实施例2爪哇棒束孢菌株的菌落性状培养和形态学鉴定

(1)菌落性状培养：将保存于4℃冰箱中的菌株移入直径9cm的PDA平板上，27℃活化5d，用直径6mm的打孔器在菌落边缘切去菌块，转接到新的SDAY平板上，27℃暗箱培养，3次重复。从第2d开始记录菌落形态、颜色和菌落生长情况，直至菌落长满平板。

菌落在PDA培养基上生长较慢，培养12d后，菌落形态图见图1，菌落直径达3.3～3.4cm，菌落正面棉状，气生菌丝发达，白色,10d后变为白灰色，背面初为白色，10d后为淡黄色。

(2)菌株形态学鉴定：采用玻片培养法，SDAY培养基分成5mm×5mm的薄薄的小片，挑于载玻片上，再将已活化的该菌菌丝挑于培养基上，置于27℃恒温培养箱保湿培养，在Nikon ECLIPSE E200MV R数码生物显微镜系统连续观察该菌的分生孢子、瓶梗、晶体等的形成情况，测量并照相，发现该菌分生孢子梗呈现瓶状或球形，在菌丝端部或者短侧枝上轮生，分生孢子为单胞链状，分生孢子卵圆形或长椭圆形。

实施例3对爪哇棒束孢BS-1分子生物学研究：

本发明的爪哇棒束孢菌株16SrRNA的PCR扩增采用本领域常规的方法即可。采用试剂盒法提取爪哇棒束孢的DNA，扩增采用的引物为通用引物，由上海生工生物工程服务有限公司合成。

通用PCR扩增引物：

ITS1-F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT-3’

ITS4-R：5’-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR反应体系(25μl)：模板DNA 1μL、2×Eco Taq PCR SuperMix(Tiangen)12.5μL、上下游引物各1μL，补充去离子水至25μL。反应条件：94℃4min预变性；94℃1min，55℃30s，72℃90s，35个循环；72℃延伸10min。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2；PCR扩增产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果见SEQ ID NO:1。

将测序结果通过Blast程序与GenBank中已有的核酸序列进行比对，结果表明，该菌株(编号为BS-1)的rDNA-ITS序列和4株已有的Isariajavanica的相应序列同源性为99％。为确定该菌株与同属及其他种的亲缘关系，选择GenBank中已公布的代表性的8株isaria属的DNA序列，用ClustalX匹配排列后，通过MEGA-7.0进行分析，通过邻接法(Neigbor-joining method)构建系统发育树如图3所示。BS-1菌株与IsariajavanicaRCEF5495亲缘关系最为接近，与IsariajavanicaACP和IsariajavanicaBE01的亲缘关系也相对较近，而与三株Isariafumosorosea菌株则都相对较远，故该菌依据rDNA-ITS序列比对结果，符合Isaria javanica。

实施例4爪哇棒束孢菌株BS-1对普通大蓟马二龄若虫和雌成虫的致病力测试

采用改良的“孢子浴”法对受试普通大蓟马进行接种。取直径3.5cm，高2.0cm的PP塑料材质透明带盖小盒，使用75％酒精浸泡刷洗后自然晾干使酒精完全挥发，将小盒置于鼓风干燥箱内以80℃、5h进行干热灭菌。在超净工作台中通过无菌操作向灭菌的小盒内倒入2mm厚SDAY培养基，待培养基完全凝固后，此盒即可代替培养皿，成为培养盒。制作足够数量的培养盒，分别接入BS-1菌株，正置于培养箱中培养，温度为25±1℃，培养时间为10天。10天时，菌落完全长满覆盖培养盒底面，且大量产孢。此时将培养盒倒置，将普通大蓟马接入培养盒中，每盒30头，重复三盒。每盒内放入一段未经任何处理的豇豆豆饼作为食物，防止普通大蓟马饿死。这样的普通大蓟马就可暴露在产孢菌株的分生孢子之下，就像用孢子淋浴一样，故也称“孢子浴”接种。另取三盒培养盒内只倒入培养基，不接种菌株作为对照组，每盒同样接入30头普通大蓟马。接种完成后，将培养盒放于恒温培养箱中培养，温度为25±1℃，分别在接种后24h、36h、48h、60h、72h统计各培养盒内的普通大蓟马死亡率，试虫死亡标准为以小毛笔刷轻触虫体无任何反应，视为死亡。实验质量标准为对照组死亡率小于10％为有效实验。测试结果见表1和表2：

表1 BS-1对普通大蓟马二龄若虫的致病力

表2 BS-1对普通大蓟马雌性成虫的致病力

实施例5扫描电子显微镜观察爪哇棒束孢菌株对普通大蓟马成虫侵染过程

采用“孢子浴”法对普通大蓟马接种BS-1菌，二龄若虫在接种后24h取样，成虫在接种后72h取样。将取得样品分别置于1.5ml离心管中，加入4％戊二醛溶液浸泡24h固定；将固定好的样品用0.1mol·L^-1磷酸缓冲液(pH 7.2-7.4)清洗3次，每次10min；然后用浓度为30％、50％、75％、85％、95％和100％的乙醇逐级脱水，再依次使用体积比1:1的乙醇-乙酸异戊酯溶液置换一次，100％乙酸异戊酯置换一次，制得扫描电镜的粗样品。

使用临界点干燥仪将样品进行临界点干燥30min，将干燥好的样品用双面胶粘在样品台上，用镀膜仪真空喷金镀膜，镀膜完成后即为扫描电子显微镜的样品，放入扫描电子显微镜后于10.00kV加速电压下观察、拍照，如图4所示，其中A为BS-1分生孢子在普通大蓟马体表附着，B为BS-1分生孢子形成侵染钉结构，C为普通大蓟马体表被BS-1分生孢子大量附着，D为BS-1完成对普通大蓟马的侵染。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种爪哇棒束孢菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 564

<212> DNA/RNA

<213> 爪哇棒束孢菌株(ITSr)

<400> 2

gtggcatcga gctttttcac tccctaaccc tttgtgacat acctatcgtt gcttcggcgg 60

actcgccccg gcgtccggac ggccctgcgc cgcccgcgac ccggacccag gcggccgccg 120

gagacccaca aattctgttt ctatcagtct ttctgaatcc gccgcaaggc aaaacaaatg 180

aatcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat 240

gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc 300

gcccgccagc attctggcgg gcatgcctgt tcgagcgtca tttcaaccct cgacacccct 360

tcgggggagt cggcgttggg gaccggcagc ataccgccgg ccccgaaata cagtggcggc 420

ccgtccgcgg cgacctctgc gtagtactcc aacgcgcacc gggaacccga cgcggccacg 480

ccgtaaaaca cccaacttct gaacgttgac ctcggatcag gtaggactac ccgctgaact 540

taagcatatc aatgggcgga ggaa 564

Claims (3)

1.一种爪哇棒束孢菌株，其特征在于,所述爪哇棒束孢菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2018.04.28，保藏编号为：CCTCC M 2018241。

2.如权利要求1所述的爪哇棒束孢菌株,其特征在于，所述爪哇棒束孢菌株的ITSrRNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1或2所述爪哇棒束孢菌株用于防治普通大蓟马的应用。