CN106065392A - 一种柑橘木虱高致病力玫烟色棒束孢菌株及其应用 - Google Patents

一种柑橘木虱高致病力玫烟色棒束孢菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柑橘木虱高致病力玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）菌株IF‑BDC01及其应用。所述玫烟色棒束孢菌株IF‑BDC01于2016年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号：GDMCC No：60011，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。经长期的侵染生物学和室内生物测定，上述玫烟色棒束孢菌株IF‑BDC01对柑橘木虱具有很高的致病力，对柑橘木虱具有很强的侵染杀虫效果。该菌株是一种昆虫病原真菌，可作为一种活体生物农药，在柑橘木虱的生物防治中具有非常强的应用潜力。

Description

一种柑橘木虱高致病力玫烟色棒束孢菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一种柑橘木虱高致病力玫烟色棒束孢菌株及其应用。
背景技术
柑橘木虱（DiaphorinacitriKuwayama）是柑橘黄龙病的重要媒介昆虫，对我国乃至世界柑橘产业的健康发展潜在着巨大的威胁。受害的寄主嫩梢可出现凋萎、新梢畸变等。木虱还会分泌白色蜜露并粘附于枝叶上，能引起煤烟病的发生。更为糟糕的是，木虱在柑橘黄龙病病株上取食、产卵繁殖，可产生大量的带菌成虫，成虫可通过转移为害新植株而传播黄龙病。柑橘木虱的主要危害作物为芸香科植物，以柑橘属受害最重，黄皮、九里香和枸椽次之。
防治柑橘木虱的农药主要是各类有机磷农药，如：40%水胺硫磷乳油800倍液、50%乐果乳油800倍液、20%速灭杀丁乳油2000～3 000倍液等，但由于这些高剧毒农药已被国家禁用，而且实际使用中因木虱的蜡质表层及木虱本身快速提高的抗药性而几乎没有任何效果，因此，目前大都采用物理窒息原理的纳米矿物油200～350倍喷杀。目前在柑橘木虱的防治上，仍是以传统的化学防治为主，但是长期、大量使用这些化学农药导致了柑橘果园天敌昆虫大量死亡、生物多样性丧失、柑橘木虱产生不同程度的抗药性、果园生态环境受到污染等一系列问题，果实农药残留超标的问题也时有发生。面对这样的被动局面，研究与应用非化学手段防控柑橘木虱已是柑橘产业面临的急迫问题。
在对柑橘木虱的综合防控中，生物防治因其绿色、环保、持效等优点成为柑橘木虱等害虫最有效和最具应用前景的防治手段，生物防治是利用有益生物及其产物控制有害生物种群的防治技术，生物防治主要是通过利用生物之间相互依存、相互制约的食物链，使生物间的动态平衡向有利于农业生产方向倾斜。因此，寻求有效的生物防治产品及应用技术是今后害虫可持续控制的主要研究方向之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有柑橘木虱防治方法的缺陷和技术不足，提供一种对柑橘木虱具有高致病力的玫烟色棒束孢菌株。该菌是一种昆虫病原真菌，可作为一种对柑橘木虱具有高致病力的活体生物农药用于防治柑橘木虱。
本发明的目的是提供一种柑橘木虱高致病力玫烟色棒束孢菌株。
本发明另一目的是提供上述一种柑橘木虱高致病力玫烟色棒束孢菌株在防治柑橘木虱方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种柑橘木虱高致病力玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）菌株IF-BDC01，所述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01于2016年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号：GDMCC No：60011，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
上述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01属于丝孢目，棒束孢属。该菌株的菌落分生孢子梗呈瓶装或近球形，在菌丝端或短侧枝上轮生，分生孢子单孢链。
另外，上述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01在防治柑橘木虱中的应用，以及在制备防治柑橘木虱的药物中的应用，都在本发明的保护范围之内。
而且，上述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01在防治由柑橘木虱引起的病害中的应用，以及在制备防治由柑橘木虱引起的病害的药物中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
进一步地，上述病害是指柑橘黄龙病。
一种包含有上述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01的农药也在本发明的保护范围之内，该农药能够防治柑橘木虱以及由柑橘木虱引起的病害，包括柑橘黄龙病。
本发明具有以下有益效果：
本发明筛选得到了一株对柑橘木虱具有高致病力的玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01，经长期的侵染生物学和室内生物测定，表明该菌株对柑橘木虱具有很强的侵染杀虫效果，而且，该菌株是一种病原真菌，可作为一种活体生物农药，在柑橘木虱的生物防治中具有非常强的应用潜力。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1 玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01的分离与鉴定
1、材料来源
（1）样品：玫烟色棒束孢菌由华南农业大学教育部生物防治工程研究中心续代保存，对该菌株保存样品采用单胞分离获得纯化菌株。
（2）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：200g去皮马铃薯，切成小块，加水1L，煮沸20min，纱布过滤：趁热加葡萄糖20g，琼脂18～20g，搅拌使之溶解混匀，定容至锥形瓶中，放在高压灭菌锅(121℃，30min）中灭菌30min。
（3）无菌操作条件：所有器皿和用具须经过高压锅灭菌(121℃，30min），接种等操作均在超净工作台内进行。
（4）培养条件：置于25℃光照（12L：12D）恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4所说的冰箱贮存。
2、菌株的分离与纯化
（1）分离
在实验室保存的玫烟色棒束孢样品中分离病原菌，方法是：利用5%的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中冲洗三次，并放入PDA平板中，倒置于25℃恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面中，再转入4℃冰箱贮存。
（2）纯化
对分离株分别在PDA培养基上培养10d，待其形成孢子后，挑取分生孢子制成1×103孢子/ml的分生孢子悬浮液，将悬液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入培养基上，放在培养箱中培养，获得A、B、C、D、E共5个分离株。
3、玫烟色棒束孢分离株的筛选
虫生真菌在遗传、生态及生物学等方面具有多样性，同中真菌的不同菌株对目标害虫的致病力差异显著。高产优质菌株的筛选与获得是取得较好防治效果的首要前提。菌株筛选主要考虑3个指标分别是产孢量、菌落生长速率、致病力。本发明以这些指标为依据，筛选优良的玫烟色棒束孢菌株。
（1）供试菌株的处理
经纯化的玫烟色棒束孢A、B、C、D、E共5个分离株，在PDA平板于25℃的恒温箱（12L：12D）中培养。
（2）供试昆虫与寄主植物
柑橘木虱，来自教育部生物防治工程研究中心网室内九里香上的继代繁殖种群。九里香Murrayapaniculata L.，在增城购买大量的九里香嫩苗，种植在华南农业大学教育部生物防治工程研究中心的网室内。
（3）菌落生长速率和产孢量的测定
将转接到PDA平板培养基上培养10d的玫烟色棒束孢菌株5个分离株分别配制成1×106孢子/ml浓度的分生孢子悬浮液，分别取1ml滴入直径为9cm的PDA平板内，用三角玻璃棒涂匀，待7d长出菌丝后用直径为13mm的打孔器取新鲜菌落，然后接种于PDA培养基上培养，每株菌5个重复，10天后隔日测记菌落直径并于第10天收集分生孢子用血球计数器测定产孢量。
5个分离株的菌落生长速率和产孢量见表1，5株菌落的生长速率基本相同，10d后菌落直径扩展在37～40mm之间。其中以B菌株的产孢量最多，为6.0×108孢子/ml，其次是C株为2.6×108孢子/ml，A株和D株产孢量基本上相同，分别为8.8×107和9.8×107孢子/ml，E株产孢量最少。
表1 玫烟色棒束孢5个分离株菌落直径扩展量和产孢量（10d）
注：表内同数列中具有相同字母，表示在0.05水平上差异不显著（DMRT法）
（4）分离株对柑橘木虱若虫的致病力
将5个分离株接种于PDA平板上培养10d后，用0.03%的吐温-80无菌水收集分生孢子，配制成1×106孢子/ml孢子悬浮液，剪取含有柑橘木虱低龄若虫的九里香嫩芽，每个嫩芽上留有20头低龄若虫，将嫩芽浸入悬浮液中，20s后取出自然晾干，对照浸入0.03%的吐温-80无菌水中，每个菌株设置3个重复。将处理过的嫩芽放在铺有滤纸的培养皿内，然后置于26±1℃，L：D=12：12的光照培养箱中培养，并将湿度保持在90%以上，7d后记录柑橘木虱的感染死亡率。
柑橘木虱低龄若虫的致病力研究结果如表2所示，所比较的5株菌株第7d对柑橘木虱的致病力效果差异明显，以B株致病力效果最好，柑橘木虱低龄若虫的死亡率达到81.0%，其次为A、E、C和D株，柑橘木虱若虫的死亡率分别达到69.0%、67.0%、66.0%和52.0%。
表2玫烟色棒束孢5个分离株对柑橘木虱低龄若虫的死亡率
注：表内同数列中具有相同字母，表示在0.05水平上差异不显著（DMRT法）
（5）玫烟色棒束孢分离株的筛选结果
在筛选优良分离株时，以菌株的产孢量、致病力、菌落生长速率为重要的参考指标。在本发明中，通过这三个评判标准来比较，B株性状较为优良，具有致病力强、产孢量多的特点，就致病率而言，B株的致病率（柑橘木虱低龄若虫的死亡率）最高达到81.0%（表1、表2）。
综合比较各方面因素，以B株为最佳菌株，经过鉴定，该菌株属丝孢目，棒束孢属，该菌株的菌落分生孢子梗呈瓶装或近球形，在菌丝端或短侧枝上轮生，分生孢子单孢链。发明人将该菌株命名为玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01，于2016年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号：GDMCC No：60011，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
实施例2 玫烟色棒束孢IF-BDC01菌株对柑橘木虱低龄若虫和高龄若虫的致病力测定
1、生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，能为综合评价该虫生真菌的生物防治潜力提供重要的参考依据。本研究就玫烟色棒束孢IF-BDC01菌株对柑橘木虱低龄若虫和高龄若虫的致病力进行测定，以期筛选出其对柑橘木虱两种虫态致死的最佳龄期和浓度。
2、供试昆虫与寄主植物：柑橘木虱，教育部生物防治工程研究中心的网室内饲养柑橘木虱成虫，接种于干净健康的九里香上，每株九里香约接入成虫20对，用PVC膜制成的网罩罩住每一盆九里香，待成虫产卵24h后，赶走成虫，待柑橘木虱若虫发展至低龄与高龄时进行试验。九里香Murrayapaniculata L.为教育部生物防治工程研究中心实验室内种植的盆栽九里香，苗高30～40cm时用于试验。
3、供试菌株的处理
经纯化处理获得的玫烟色棒束孢IF-BDC01菌株，采用PDA平板，于25℃的恒温箱（12L：12D）中培养10d，挑取生长良好的菌落，倒入20ml 0.03%的吐温-80无菌水，用接种针轻刮真菌的菌丝及孢子，将菌液倒入烧杯中，经磁力搅拌器搅拌30分钟，待孢子完全被打散均匀后，用两层医用纱布过滤，得到较纯的孢子悬浮液，弃去纱布上面的培养基残留物和菌丝，在40倍物镜下以血球计数板计数母液的孢子浓度，再稀释成1×104、1×105、1×106、1×107和1×108孢子/ml等5个供试浓度各20ml，待用。
4、分离株对柑橘木虱低龄若虫和高龄若虫的致病力测定
将1.6%的琼脂溶液倒入9cm培养皿中，大约0.5cm厚度，待凉后铺上一层滤纸，分别挑取含有低龄若虫和高龄若虫的嫩芽，保证每个嫩芽上有20头若虫，慢慢浸入5个浓度的孢子悬浮液中20s，然后将带虫枝条放入培养皿中，用保鲜膜将培养皿包住，在保鲜膜上保留若干小孔确保空气流通，置于温度为26±1℃、光照为12L：12D、湿度为90%的人工气候箱内，7d后，调查柑橘木虱低龄与高龄若虫的死亡率。CK对照为0.03%的吐温-80无菌水，同一个孢子浓度及对照实验重复3次。
5、玫烟色棒束孢对柑橘木虱低龄和高龄若虫的累计死亡率
结果表明，在1×104孢子/ml的浓度下，柑橘木虱低龄与高龄若虫的死亡率很低分别只有36.7%.和33.3%。在1×105孢子/ml的浓度下，玫烟色棒束孢对柑橘木虱低龄与高龄若虫的致死率在55.0%～61.7%之间。同样，随着浓度的增加，玫烟色棒束孢对柑橘木虱低龄与高龄若虫的致死效果越来越高，在1×108孢子/ml下，对低龄若虫的致死率达到98.33%，这说明玫烟色棒束孢对柑橘木虱低龄若虫有很高的防治效果，对高龄若虫的致死率也达到93.3%。在1×107和1×108孢子/ml浓度下，玫烟色棒束孢对柑橘木虱的高龄若虫的致死率明显低于低龄若虫，说明玫烟色棒束孢对低龄若虫的侵染效果好，低龄若虫是防治的最佳时期。
表3 不同浓度的玫烟色棒束孢对柑橘木虱低龄和高龄若虫的累计死亡率
注：表中同列中相同字母者表示在0.05水平上差异不显著（DMRT法）
6、玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫第7d的累计死亡率如表4所示。
表4 玫烟色棒束孢的柑橘木虱成虫第7d的累计死亡率
注：表中同列中相同字母者表示在0.05水平上差异不显著（DMRT法）
7、玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫致病力的回归方程及参数如表5所示。
表5 玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫致病力的回归方程及参数
8、玫烟色棒束孢对柑橘木虱低龄若虫致病力的回归方程及参数如表6所示。
表6 玫烟色棒束孢对柑橘木虱低龄若虫致病力的回归方程及参数
9、玫烟色棒束孢对柑橘木虱高龄若虫致病力的回归方程及参数如表7所示。
表7 玫烟色棒束孢对柑橘木虱高龄若虫致病力的回归方程及参数
实施例3玫烟色棒束孢IF-BDC01菌株对柑橘木虱成虫田间防治
1、在半笼罩条件下用玫烟色棒束孢的孢子悬浮液处理柑橘木虱成虫，其第7d的累计死亡率见表8，随着玫烟色棒束孢孢子浓度的升高，致死率越来越大。
表8 半田间条件下玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫的死亡率
注：表中同列中相同字母者表示在0.05水平上差异不显著（DMT法）
2、玫烟色棒束孢在田间对柑橘木虱的逐日死亡率
昆虫病原真菌杀虫效果较慢，喷施后，在第3d柑橘木虱开始出现死亡，在此后各浓度处理中的柑橘木虱成虫的死亡率不断增加，而且随着浓度的升高而增加，玫烟色棒束孢在浓度为1×104和1×105孢子/ml条件下，第6天达到了高峰期，第7天的死亡率变化不大，但在1×106～1×108孢子/ml下，每天的累计死亡率阶梯状上升。
3、玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫的致死浓度
通过数据处理分析获得玫烟色棒束孢菌株在半田间条件下对柑橘木虱成虫的致病力回归方程及参数（表9）。玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫的致病力回归方程为Y=0.39＋0.64X，其中拟合程度的X 2 值分别为8.6，p>0.05，表明所求的致病力回归方程是合适的。在半田间条件下玫烟色棒束孢菌株对柑橘木虱成虫的致死中浓度LC50是1.5×107孢子/ml。
表9 半田间条件下玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫的致病力回归方程及参数
4、玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫的时间效应
在半田间条件下玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫的致死中时间见表10。柑橘木虱成虫的LT50值是随着真菌孢子悬浮液制剂浓度的增加而递减。
玫烟色棒束孢在1×104～1×106孢子/ml的范围内，柑橘木虱成虫的最终死亡率都低于50%，计算不出LT50值；在1×107和1×108孢子/ml的浓度下，柑橘木虱成虫的LT50值分别是5.3和4.9d。
表10 玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫的致死时间（d）

Claims (10)

1.一种柑橘木虱高致病力玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）菌株IF-BDC01，其特征在于，所述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01于2016年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号：GDMCC No：60011，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
2.根据权利要求1所述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01，其特征在于，该菌株属于丝孢目，棒束孢属。
3.根据权利要求1所述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01，其特征在于，该菌株的菌落分生孢子梗呈瓶装或近球形，在菌丝端或短侧枝上轮生，分生孢子单孢链。
4.权利要求1～3任一所述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01在防治柑橘木虱中的应用。
5.权利要求1～3任一所述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01在制备防治柑橘木虱的药物中的应用。
6.权利要求1～3任一所述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01在防治由柑橘木虱引起的病害中的应用。
7.权利要求1～3任一所述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01在制备防治由柑橘木虱引起的病害的药物中的应用。
8.根据权利要求6或7所述应用，其特征在于，所述病害是指柑橘黄龙病。
9.一种能够防治柑橘木虱的农药，其特征在于，所述农药包含有权利要求1～3任一所述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01。
10.一种能够防治柑橘黄龙病的农药，其特征在于，所述农药包含有权利要求1～3任一所述玫烟色棒束孢菌株IF-BDC01。
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