CN110301441A - 氯喹防治根结线虫的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氯喹防治根结线虫的新用途，属于根结线虫防控技术领域。本发明氯喹在防治根结线虫中的应用和氯喹在抑制根结线虫侵染、发育和/或产卵中的应用，其中氯喹为氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁。氯喹在制备根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂中的应用，根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂的活性成分为氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁，根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂为氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁的水溶液。本发明使用氯喹的水溶液防治根结线虫，安全、无毒、有效。

Description

氯喹防治根结线虫的新用途

技术领域

本发明涉及氯喹防治根结线虫的新用途，属于根结线虫防控技术领域。

背景技术

根结线虫对农作物引起的危害已经超过病毒和细菌引起的，成为了仅次于真菌的第二大植物病害。并且，在十种常见的植物病原线虫中，根结线虫属(Meloidogyne spp.)对植物的危害位列首位。截止目前，发现并登记记录的根结线虫属有106个种，其中四种根结线虫(南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica))较为常见，分布也较为广泛。随着我国北方设施蔬菜保护地面积的扩大和气温的变暖，根结线虫的呈现爆发趋势，对农作物特别是蔬菜引起的经济损失也逐年攀升，成为了现代化设施农业的快速发展的瓶颈因素。

目前，根结线虫的防控措施主要包括化学防治、作物栽培管理、生物防治和寄主抗病选育。高价值作物的根结线虫病害的防治主要依靠化学防治，随着人类环保意识的逐步提高和对自身安全考虑的认识，过去常用的化学熏蒸剂-氯丙烷，逐渐从农药市场退出。作物栽培管理主要包括轮作、休耕和添加土壤改良剂，是我国主要采用的植物病原线虫防控措施。然而，对于寄主广泛的根结线虫而言，轮作和休耕均不能有效降低土壤中根结线虫的虫口密度。过度添加土壤改良剂，会改变原有的土壤微生态环境，进而影响土壤中有益微生物区系。生物防治主要依靠植物病原线虫的自然天敌对其进行防控，目前，根结线虫自然天敌研究较多的为内寄生细菌、根际细菌、食线虫真菌、捕食线虫真菌、腐生真菌。尽管生物防治符合生态社会绿色发展的生活理念，并且在实验室条件下获得了较好的防控效果。然而，在田间的防控效果却收效甚微，其原因在于生物防治要求的防控环境较为严格，而田间环境相对复杂，均会影响生物防治的效果。寄主抗病选育主要从筛选抗病基因入手，通过传统育种或转基因技术获得抗线虫品种。然而，对于根结线虫而言，常见的农作物几都是寄主，这无疑加大了抗病基因筛选的难度。即使携带抗线虫基因Mi的栽培品种，根结线虫对其也产生了抗性。杀虫化合物的筛选已成为植物病原线虫防控的重要研究方向，已有来源于植物、真菌和细菌的多种化合物在实验室条件下表现出对根结线虫具有良好的防控效果，但这些化合物多具有不稳定性和易受土壤环境的影响。目前，农业生产上常用的化合物主要是阿维菌素，是一种十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomycesavermitilis发酵产生。尽管阿维菌素对根结线虫具有良好的防控效果，然而目前该产品主要是加工成乳油使用，阿维菌素的喷施给土壤带来了大量有机溶剂而造成环境污染和资源浪费严重。此外，乳油制剂易被土壤颗粒吸附，使得阿维菌素快速释放出来被土壤中的微生物降解成为没有杀虫活性的代谢物。对于日趋严重的根结线虫病害，亟需寻找一种安全、绿色高效的防控措施，寻找到安全、高效的杀虫化合物。

发明内容

针对现有技术中根结线虫的防控的问题，提供了氯喹防治根结线虫的新用途，即氯喹在防治根结线虫中的应用和氯喹在抑制根结线虫侵染、发育和/或产卵中的应用。

所述应用中氯喹为氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁。

所述根结线虫为南方根结线虫、北方根结线虫、瓜哇根结线虫或花生根结线虫。

氯喹在制备根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂中的应用，根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂的活性成分为氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁，根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂为氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁的水溶液。

进一步地，所述根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂中氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁的浓度为250～1000μM。

本发明的有益效果：

(1)本发明氯喹在防治根结线虫中的应用和氯喹在抑制根结线虫产卵中的应用，对根结线虫二龄幼虫体外存活具有毒杀作用，可制备根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂；

(2)使用氯喹的水溶液防治根结线虫，安全、无毒、有效。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

本发明氯喹防治根结线虫的新用途以防治南方根结线虫为例；

本发明氯喹磷酸盐对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀效果测定方法：

氯喹磷酸盐溶液配制(以下为重量百分比)：

用干净的称量纸准确称取氯喹磷酸盐，加入适量的无菌水，定容后使氯喹磷酸盐浓度为1M；

氯喹磷酸盐对南方根结线虫毒杀效果的测定

(1)南方根结线虫J2幼虫的收集和体表消毒

拔起萎蔫、下部叶片发黄的植株，剪掉地上部分，将根部冲洗干净，选取根部卵块呈米黄色而量多的番茄，用灭菌的解剖针挑取成熟卵块并将其置于40μm细胞筛网；挑取后将筛网和卵块置于2％的次氯酸钠中1min，期间缓慢振动筛网；无菌水冲洗卵块5-7次后将筛网放置于装有15mL无菌水的6cm培养板中在温度为28℃恒温培养箱中孵化48h后离心收集幼虫；

向离心管中加入1mL 0.001％醋酸氯己定，放置于DNA混合仪上转动1h；离心并用无菌水洗涤南方根结线虫J2幼虫3～5次；然后，再向离心管中加入1mL 0.01％氯化汞溶液，7min后离心并用无菌水洗涤南方根结线虫J2幼虫3～5次，最后，将南方根结线虫J2幼虫制成浓度为40条/μl的线虫悬浮液；

(2)氯喹磷酸盐对南方根结线虫J2幼虫毒杀能力的测定

用移液枪吸取向30mm培养皿中加入500μL M9缓冲溶液(M9缓冲溶液为M9盐溶液(5×,pH7.4)分子生物学试剂，主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化铵等组成，经高压灭菌处理)，再向其中加入1500μL无菌水，使之成为0.25×的M9缓冲溶液，并向0.25×的M9缓冲溶液加入5μL的南方根结线虫J2幼虫悬浮液，加入氯喹磷酸盐母液，使氯喹磷酸盐浓度分别为250μM、500μM，750μM和1000μM，加无菌水的设为对照，每隔24h在显微镜下统计南方根结线虫J2幼虫的存活情况；

(3)毒杀效果计算

当南方根结线虫J2幼虫在溶液中呈现僵直状态并经机械刺激后，5s内仍然没有活动的判定为死亡，反之则认为存活状态；

存活率(％)＝(N_活/N_总)×100％

毒杀效果(％)＝存活率(0.25×M9缓冲溶液)-存活率(氯喹磷酸盐溶液)。

实施例1：分别配制浓度为250μM、500μM、750μM和1000μM的0.25×M9缓冲溶液的氯喹磷酸盐缓冲液，分别向含有南方根结线虫的病土中加入100mL的氯喹磷酸盐缓冲液(每杯病土中含有1200±80条南方根结线虫J2幼虫)，加入100mL 0.25×M9缓冲溶液作为对照处理；用保鲜膜对塑料杯口密封，其中每个塑料杯底部均有大小相同的四个孔，将塑料杯放置于日光温室的阴凉处；4天后，将带有4片真叶的、长势一致的番茄幼苗移栽在各塑料杯的泥土中；保持土壤潮湿使各处理的番茄植株正常生长；45天后，拔起番茄植株，仔细轻微清洗番茄植株根系，仔细统计记录各植株的根结数目，并根据病级指数对各处理的植株进行划分，然后各处理的番茄根系中的线虫进行染色处理(具体方法参考Journal ofNematology,1983,15(1):142-143)，显微镜下观察并记录各虫龄阶段的数目，并进行统计分析；65天后，拔起另一批番茄植株，仔细轻微清洗番茄植株根系，仔细统计并记录各植株的根结表面的卵块数目，并根据卵块颜色进行归类统计。

实施例2：用移液枪吸取向35mm培养皿中加入500μL M9缓冲溶液，再加入1500μL无菌水，使缓冲溶液成为0.25×的M9缓冲溶液，并向0.25×的M9缓冲溶液加入30μL的南方根结线虫J2幼虫悬浮液，然后加入氯喹磷酸盐母液，使氯喹磷酸盐浓度分别为250μM、500μM、750μM和1000μM，加30μL 0.25×M9缓冲溶液设为对照，将加有南方根结线虫J2幼虫的培养皿放置于温度为28℃，每隔24h在显微镜下统计南方根结线虫J2幼虫的存活情况(见表1)；96h后，收集各处理的南方根结线虫J2幼虫，并将各培养皿收集到的南方根结线虫J2幼虫分别加入到两批长有4片真叶的番茄根部(直径：8cm，高12cm)，将番茄放入日光温室下培养；保持土壤潮湿，使各处理的番茄植株正常生长；45天后，拔起番茄植株，仔细轻微清洗番茄植株根系，仔细统计记录各植株的根结数目，并根据病级指数对各处理的植株进行划分，然后各处理的番茄根系中的线虫进行染色处理(具体方法参见Journal of Nematology,1983,15(1):142-143)，显微镜下观察并记录各虫龄阶段的数目，并进行统计分析；65天后，拔起另一批番茄植株，仔细轻微清洗番茄植株根系，仔细统计并记录各植株的根结表面的卵块数目，并根据卵块颜色进行归类统计(注：卵块的颜色越深，卵块成熟度越深)；

表1不同浓度下氯喹对南方根结线虫J2幼虫毒杀效果

结果表明：浓度为250μM和500μM氯喹溶液在48h内，毒杀线虫效果相对比较弱(分别为14.76％和16.43％)，分别从72h和96h表现出显著的毒杀效果(分别为20.43％和25.32％)；然而，浓度为750μM和1000μM氯喹溶液在48h已呈现出较为显著的毒杀效果(分别为32.65％和43.43％)，并且二者在96h杀虫效果分别为68.54％和95.43％。

实施例1和实施例2不同浓度氯喹处理南方根结线虫J2幼虫后对根结的侵染能力和病级指数见表2；

表2不同浓度氯喹处理南方根结线虫J2幼虫后对根结的侵染能力和病级指数

注：防效＝(0.25×M9缓冲液处理根结数-氯喹处理根结数)/0.25×M9缓冲液处理根结数×100％

结果表明：氯喹可有效防控南方根结线虫对番茄植物的侵染，在实施例1和实施例2中，氯喹溶液浓度为250μM对南方根结线虫的防效便能达到53％以上，并且随着浓度的升高，防治效果越加显著；当浓度为1000μM时，防治效果分别高达93.18％和95.08％；然而，从处理方式来看，实施例1的防控效果要弱于实施例2的，即氯喹培养皿中处理南方根结线虫J2幼虫的防效要强于直接处理泥土中的南方根结线虫J2幼虫，这可能是由于病土中有南方根结线虫卵块的残留，在后期孵化出南方根结线虫J2幼虫继续侵染番茄根系所致。

实施例1和实施例2不同浓度氯喹处理南方根结线虫J2幼虫后发育情况见表3；

表3不同浓度氯喹处理南方根结线虫J2幼虫后发育情况

注：抑制率＝(0.25×M9缓冲液处理虫龄比例-氯喹处理虫龄比例)/0.25×M9缓冲液处理虫龄比例×100％

结果表明：氯喹可有效抑制南方根结线虫的发育，在实施例1和实施例2中，无菌水处理的南方根结线虫J2幼虫在侵染番茄根系45天后，均有86％以上的线虫发育到雌虫阶段，而浓度为250μM氯喹处理的南方根结线虫J2幼虫在侵染番茄根系45天后，发育为雌虫的仅有35.23％和31.81％，并且随着浓度的升高，抑制效果越加显著；当浓度为500μM时，发育为雌虫的仅为29.35％和20.84％，抑制率分别为66.11％和77.60％；氯喹处理后，发育为雌虫的比例显著降低，同时，三龄幼虫(J3)和四龄幼虫(J4)的比例随着氯喹浓度的增加而显著增加；同样地，从处理方式来看，实施例2的防控效果要强于实施例1的，即氯喹培养皿中处理南方根结线虫J2幼虫的防效要强于直接处理泥土中的南方根结线虫J2幼虫。

实施例1和实施例2不同浓度氯喹处理南方根结线虫J2幼虫后侵染植株后产卵情况见表4；

表4不同浓度氯喹处理南方根结线虫J2幼虫侵染植株后产卵情况

注：产卵块抑制率＝(0.25×M9缓冲液处理卵块-氯喹处理卵块)/0.25×M9缓冲液处理卵块×100％

结果表明：氯喹可有效抑制南方根结线虫产卵，在实施例1和实施例2中，无菌水处理的南方根结线虫J2在侵染番茄根系65天后，植株的平均产卵块数分别为132和112，而浓度为250μM氯喹处理的南方根结线虫J2在侵染番茄根系65天后，植株的平均产卵块数分别为66和44，抑制率分别为50％和60.7％；并且随着浓度的升高，抑制效果越加显著；当浓度为1000μM时，产卵块数仅为11和5，抑制率分别为91.67％和95.53％。此外，氯喹处理后，卵块的成熟度也受到显著抑制；在实施例1和实施例2中，无菌水处理的南方根结线虫J2在侵染番茄根系65天后，棕黄色卵块(成熟度最佳)数分别80.65％和83.9％，而氯喹处理的南方根结线虫J2在侵染番茄根系65天后，棕黄色卵块所占比例随着氯喹浓度的增加而显著降低，棕黑色卵块(过度成熟)所占比例也呈现出类似的趋势；与之相反，浅黄色卵块(尚未完全成熟)所占的比例却随着氯喹浓度的增加而显著增加。上述结果说明，氯喹可有效抑制南方根结线虫产卵，并可延缓卵块的成熟。

Claims (6)

1.氯喹在防治根结线虫中的应用。

2.氯喹在抑制根结线虫侵染、发育和/或产卵中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，氯喹为氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁。

4.根据权利要求1或2所述的应用，根结线虫为南方根结线虫、北方根结线虫、瓜哇根结线虫或花生根结线虫。

5.氯喹在制备根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂中的应用，其特征在于：根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂的活性成分为氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁，根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂为氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁的水溶液。

6.权利要求5所述氯喹在制备根结线虫杀虫剂或根结线虫产卵抑制剂中的应用，其特征在于：根结线虫杀虫剂或根结线虫侵染、发育和/或产卵抑制剂中氯喹磷酸盐、硫酸羟氯喹或硫酸奎宁的浓度为250～1000μM。