CN101985605B - 一种水霉拮抗菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水霉拮抗菌及其应用，可作为孔雀石绿替代药物的生物药源，降低环境污染，满足鱼类水霉病生物防治的需要。本发明提供的一种水霉拮抗菌Sh1，属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号为CCTCC NO：M 2010129。本发明提供的新型拮抗菌，其活性成分稳定性高，拮抗能力强，安全，有效，稳定；且可采用现有的生产工艺及流程进行生产，推广和使用成本低。

Description

一种水霉拮抗菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种芽孢杆菌，尤其涉及一种对鱼类水霉病有拮抗作用的芽孢杆菌，以及其作为生物安全用药的应用。

背景技术

水霉病(Saprolegniasis)是水产养殖中一类由水霉(Saprolegnia)或棉霉(Achlya)引起的寄生性疾病的统称。目前引起水产动物水霉病的最常见病原是水霉，传统上水霉病被认为是鱼类真菌病的一种。由于水霉比真菌要低等，分类学上，已将此纲生物从原真菌界划分为茸鞭生物界，故目前也认为水霉属卵菌纲。包括草鱼等四大家鱼在内的淡水鱼的鱼卵、鱼苗、成鱼都有可能得水霉病，一旦发生很难治疗。在晚冬和早春，水温15℃-20℃时发病最为严重。水霉菌包括有性和无性生长周期。研究表明水霉菌的无性生长周期是主要的感染阶段。水霉菌无性繁殖产生的孢子黏附到鱼的头部和鱼鳍上等表皮组织，也可以扩散至全身。水霉菌既可入侵和破坏鱼的皮下组织，造成伤痕和鱼的死亡；也可以在鱼的表皮生长，形成白色或者灰色的棉花状菌丝体，影响鱼的观感和价值。

以前能治疗水霉病最有效的化学试剂是孔雀石绿(Malachite Green)。然而，孔雀石绿是很强的致癌物质，我国已禁止使用孔雀石绿来治疗食用鱼的水霉病感染。国家对水霉病的研究非常重视，在农业部公益性行业科研专项和国家十一五支撑计划中都支持了水霉病的安全用药技术及孔雀石绿替代药物的研发。水霉病的严重危害也促使国内外的真菌学家和水产学家对其进行了研究，主要研究内容集中在水霉病的症状的描述，病原菌的鉴定，致病条件的探讨，以及防治方法的摸索。但是现有的水霉病防治药物治疗效果普遍不够理想，水霉病的防治问题仍没有很好的解决方案，见卢彤岩.水产养殖业孔雀石绿替代品研究现状[J].黑龙江水产，2009，130：22。

在现有化学药物尚未取得理想防治效果的情况下，我们将目光转向了微生物来源的药物的筛选。研究表明，微生物来源的很多活性成分可以抑制真菌的生长和感染，见下列文献：李海慧，徐风花，夏清梅，等.水稻立枯病拮抗菌株抗病机理研究[J].黑龙江农业科学，2007，(1)：38-40；郝华昆，韩俊华，李为民，等.棉花黄、枯萎病拮抗菌株B110的鉴定及其抑菌作用方式[J].植物保护，2007，33(2)：77-80；宋国彪，刘红彦，王振跃，等.拮抗菌96-79抑菌物质的理化特性研究[J].江西农业学报，2008，20(3)：40-42。生物药物通常具有无公害、无环境污染和防治作用专一性等优点，目前科学界公认生物防治将在健康养殖中发挥越来越大的作用。

在自然环境中往往存在大量的对各种病原菌(包括致病真菌)有拮抗作用的菌株。在追求可持续性发展的今天，利用拮抗菌防治病害是十分活跃的研究领域之一，特别是多种芽孢杆菌已被报道可作为植物病害的生防细菌，比如用于防治水稻真菌病稻瘟病的就有枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilis)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)等(见李永刚，宋兴舜，马凤鸣，等.水稻稻瘟病拮抗菌L1鉴定及抑菌特性的初步研究[J].微生物学通报，2008，35(6)：898-902)。

近年来芽孢杆菌作为益生菌在水产养殖中的应用范围不断扩大。已知芽孢杆菌的作用机制主要包括：抑制有害细菌的生长，维持肠道微生态平衡，改善养殖水体的水质，提高饲料利用率，促进动物生长等。起到拮抗作用的细菌分泌物是很复杂的，包括细菌素、小分子量的抗菌素、过氧化物、各种酶及许多次生代谢产物等。但此前报道的有拮抗真菌活性的多种芽孢杆菌的拮抗物质被证实具有蛋白质性质(见李永刚，郝中娜，杨明秀，等.寒地水稻病害生防菌株L1的鉴定及抑菌机理研究[J].东北农业大学学报，2008，39(7)：9-12)，由于蛋白质热稳定性不好及易受环境中蛋白酶的降解，不利于制药企业大规模纯化其活性成分用于生产实践。

发明内容

本发明要提供一种新型的拮抗菌，其活性成分稳定性高，可作为孔雀石绿替代药物的生物药源，降低环境污染，满足鱼类水霉病生物防治的需要。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

提供一种水霉拮抗菌Sh1，属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌种已于2010年6月2日在中国专利局指定的保藏单位，武汉，中国典型培养物保藏中心进行保臧，保藏号CCTCC NO：M 2010129。

本发明还提供所述的保藏号为CCTCC NO：M 2010129的水霉拮抗菌Sh1，在防治鱼类水霉病中的应用；尤其是在草鱼水霉病防治中的应用。

本发明的又一目的，是提供所述的保藏号为CCTCC NO：M 2010129的水霉拮抗菌Sh1为活性成分的生物制剂。

本发明的又一目的，是提供所述的保藏号为CCTCC NO：M 2010129的水霉拮抗菌Sh1的发酵液为活性成分的生物制剂。

本发明提供的技术方案的有益效果如下：

一：拮抗能力强，安全，有效，稳定

评价一个生物工程菌株时应综合考虑菌株抗病的具体机理以及外界环境因素的影响，才能为其生产和应用提供科学的理论依据。解淀粉芽孢杆菌Sh1对水霉病菌的拮抗能力较强，对水产动物安全，活性成分不是蛋白质且热稳定性好，作为替代孔雀石绿的绿色渔药药源有较广阔的开发前景。

二：可采用现有的生产工艺及流程，推广和使用成本低

芽孢杆菌通常嗜温好氧和兼性厌氧，可产生抗逆性内生孢子以耐受各种不良的环境条件，在产品的发酵生产及运输储存上相对其他细菌具有比较优势。考虑到芽孢杆菌作为水产上的益生菌产品在我国已经得到大规模推广应用，其生产工艺和使用流程已非常成熟；而且解淀粉芽孢杆菌本来就在动物饲料工业中作为益生菌添加剂用于提高磷的转化率(车晓曦，李校堃.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的研究进展[J].北京农业，2010，(3)：7-10)，我们筛选到的这株拮抗水霉的解淀粉芽孢杆菌Sh1预计将会有很好的市场接受度。

附图说明

图1Sh1拮抗水霉菌的生长，Antagonistic ability of Shl on the growth ofSaprolegnia；1为Sh1菌株形成抑菌圈的情况，2为细菌X形成抑菌圈的情况；

图2Sh1的芽孢染色，Endospore-stained micrograph of the isolate Sh1；

图3Sh1抑制水霉菌菌丝的生长，Mycelia growth of Saprolegnia inhibited by Sh1，A为抑菌圈周围菌丝，B为正常菌丝。

具体实施方式

应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例中，所涉及的部分材料来源如下：

1、主要试剂

用于水霉培养及平板抑制实验的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，购于上海疾病预防控制中心；普通LB培养基用于包括Sh1在内的待测试细菌菌株的分离与培养。用于微生物培养的蛋白胨，酵母膏，琼脂粉等均购自北京鼎国生物有限公司；氯化钠等化学试剂购自上海国药集团；细菌基因组提取试剂和PGR试剂盒分别购自上海天根和上海生工生物工程公司。

2、菌株

水霉菌菌丝分离自上海市松江区水产养殖场发病的草鱼肌肉组织，保存于上海海洋大学国家水生动物病原库。包括芽孢杆菌Sh1在内的用于筛选水霉拮抗细菌的待试菌株，均分离自华东地区养殖水体附近的土壤中。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例一：芽孢杆菌Sh1的筛选

1、平板对峙培养法筛选水霉拮抗菌株

分别将待选细菌与水霉菌接种PDA平板上，26℃恒温培养3天，待水霉菌在拮抗菌周围菌丝交接并出现明显抑菌圈时，以水霉菌丝边缘至细菌菌落边缘距离，作为细菌拮抗作用大小的判断标准。记录有拮抗作用菌株的编号。

2、拮抗水霉的芽孢杆菌Sh1的发现

本实验所采用的水霉菌于26℃在PDA平板上生长良好，一般在平板中间接种含水霉菌丝的琼脂块后，三至四天即可长满整个平板。在利用平板对峙培养法筛选水霉拮抗菌株时，在PDA平板周围点种待试菌株的同时，在其中间放置小块长了水霉菌丝的琼脂块，3-4天后观察待测菌株周围抑菌圈的形成情况。

图1中，1为Sh1菌株形成抑菌圈的情况，2为细菌X形成抑菌圈的情况。结果显示的是Sh1菌株可在PDA平板上形成直径约12mm的抑菌圈；而与之相对的一株不能拮抗水霉生长的细菌X，在同一平板上会被水霉菌丝完全包裹。细菌X作为对照，也同时显示Sh1对水霉的拮抗作用不会是由于营养竞争引起的。

菌株Sh1菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，边缘呈锯齿状。从菌落上挑取细菌到载玻片上用孔雀石绿染色，可以发现约90％菌体都形成了绿色芽孢(图2)。

实施例二：芽孢杆菌Sh1的鉴定

1、芽孢杆菌Sh1的菌种鉴定

本实施例根据细菌16S rDNA的序列来对Sh1进行分子鉴定。菌株基因组DNA的提取使用上海天根的基因组提取试剂盒。以细菌基因组DNA为模板，选用细菌16S rDNA通用引物：27f：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1541r：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；来扩增Sh1的16S rDNA序列。PCR反应条件根据上海生工的PCR试剂盒的产品说明设定。扩增的条带使用上海天根的DNA回收试剂盒从DNA电泳胶上切胶回收。回收的样品送上海生工进行序列测定。通过与Genbank中已知的细菌16S rDNA进行Blast相似性比较确定Sh1的种类。

2、16S rDNA测序确定Sh1为解淀粉芽孢杆菌

用通用引物扩增Sh1的16S rDNA大部分序列，扩增的963bp条带经上海生工测序，确定其序列为：

GCCACCTGTCACCGTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCACACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTAGCCACCTACATATTACCGCGGCTGC

将菌株Sh1的16S rDNA序列测序结果以BLAST软件同Genbank中的已有细菌序列进行同源性比较，结果显示Sh1与芽孢杆菌属中的解淀粉芽孢杆菌有99％的同源性，结合该菌的形态学特征可以最终鉴定菌株Sh1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

实施例三：芽孢杆菌Sh1的抑菌作用

1、菌丝抑制病理学观察

于26℃在PDA培养基上平板对峙培养水霉菌与芽孢杆菌Sh1，当水霉菌围绕Sh1形成抑菌圈时，挑取抑菌圈边缘的菌丝，显微镜下观察水霉菌菌丝的变化。

2、Sh1对水霉菌丝的抑制作用

将抑菌平板中，生长正常的菌丝和抑菌圈边缘处的菌丝，在显微镜下作对比观察。可以发现，抑菌圈边缘的水霉菌丝发生扭曲，菌丝多处断裂或是中部缢缩，菌丝生长受到明显抑制。两者对比见图3，A为抑菌圈周围菌丝，B为正常菌丝。

该实施例表明，芽孢杆菌Sh1对水霉有较强的抑制作用。

实施例四：芽孢杆菌Sh1发酵液活性成分分析

1、Sh1无细胞发酵液活性物质生化特性分析

将Sh1接种于LB液体培养液中，摇床培养24小时后，用离心法将菌体和代谢产物分离，再将上清液浓缩、离心后用细菌滤膜过滤，上清液即为Sh1无细胞发酵液。分别对Sh1发酵液进行100℃高温处理，蛋白酶K消化，有机溶剂氯仿抽提处理，然后采用纸片法测定处理后的发酵液对水霉菌的抑菌圈，并以清水为对照，每种处理重复3次。

2、Sh1活性成分理化特性的分析

在培养皿中倒入25mL PDA培养基；取水霉病菌菌落边缘的菌丝块(d＝5mm)放在PDA平板上的中心点处，在距中心50mm的四周用等距离放置d＝5mm的圆形滤纸片，每张滤纸片上滴加200μL的Sh1无菌发酵原液，及经100℃加热处理，蛋白酶K消化，氯仿抽提处理的Sh1发酵液，并以注入无菌水为对照，置于26℃下培养，每处理4个重复。培养5d后，观察在平板上的抑菌现象，测量抑菌带的宽度(表1)。表1表明Sh1发酵原液中的拮抗水霉的活性成分耐热，对蛋白酶不敏感，并且水溶性好。这些性质的测定基本排除了活性成分是蛋白质性质的可能性。

表1Sh1无细胞发酵液中活性成分的理化性质分析

本实施例证明：芽孢杆菌Sh1发酵液中拮抗水霉的活性成分，不仅对水霉有拮抗作用；面且耐热，对蛋白酶不敏感，并且水溶性好，所以稳定性高。

实施例五：动物安全性实验测试

1、动物安全性实验

以江苏吴江良种场的150g的草鱼为测试动物，在水箱内驯养观察一周后进行试验，每天用充氧泵充氧，定时投放颗粒饲料和换水排除代谢废物。20条鱼一组，腹腔注射10⁷CFU/0.1ml芽孢杆菌Sh1，持续培养21天观察鱼的生存情况，计算致死率。以注射相同剂量的致病性嗜水气单胞菌标准株7966的处理组为阴性(-)对照，以注射无菌的PBS缓冲液作为阳性(+)对照。

2、芽孢杆菌Sh1动物安全性实验

嗜水气单胞菌7966株在LB培养基中培养过夜，以10⁷CFU/0.1mL(约50LD50)肌肉注射实验鱼，逐日记录死亡情况并测定相对保护率。21天后7966注射组累计死亡率达100％(20/20)。而注射相同剂量的芽孢杆菌Sh1的草鱼则无任何发病症状，与用无菌缓冲液处理的鱼一样，死亡率为0(0/20)。

本实施例证明本发明提供的芽孢杆菌Sh1，在作为用于防治草鱼水霉的生物制剂时，非常有效并安全。

综上所述，本发明提供的水霉拮抗菌Sh1，对水霉有很强的拮抗作用，活性成分稳定，可应用于防治鱼类水霉病。水霉拮抗菌Sh1可直接作为活性成分，添加或不添加辅料制成生物制剂，用于水霉病防治；也可将其发酵液作为活性成分，添加或不添加辅料制成生物制剂，用于水霉病防治。

序列表

<110>上海海洋大学

<120>一种水霉拮抗菌及其应用

<160>3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，用来扩增Sh1的16S rDNA序列，

以进行芽孢杆菌Sh1的菌种鉴定，命名为27f。

<400>1

gagagtttga tcctggctca g                        21

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，用来扩增Sh1的16S rDNA序列，

以进行芽孢杆菌Sh1的菌种鉴定，命名为1541r。

<400>2

aaggaggtga tccagccgca                          20

<210>3

<211>963

<212>DNA

<213>解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400>3

gccacctgtc accgttcggc ggctggctcc ataaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt    60

acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc    120

atgctgatcc gcgattacta gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc    180

cgaactgaga acagatttgt gggattggct taacctcgcg gtttcgctgc cctttgttct    240

gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc    300

caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca ccttagagtg cccaactgaa tgctggcaac    360

taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac    420

gacaaccatg caccacctgt cactctgccc ccgaagggga cgtcctatct ctaggattgt    480

cagaggatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc    540

accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca    600

ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc    660

actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc    720

gctcctcagc gtcagttaca gaccagagag tcgccttcgc cactggtgtt cctccacatc    780

tctacgcatt tcaccgctac acgtggattc cactctcctc ttctgcactc aagttcccca    840

gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac atcacactta agaaaccgcc    900

tgcgagccct ttacgcccaa taattccgga caacgctagc cacctacata ttaccgcggc    960

tgc                                                                  963

Claims (1)

1.一种水霉拮抗菌Sh1，其特征在于，所述的水霉拮抗菌Sh1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号CCTCC NO：M2010129。

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