CN107189950B - 一种降解除草地膜的菌株gfdz1及菌剂制备方法和应用 - Google Patents

一种降解除草地膜的菌株gfdz1及菌剂制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌剂制备方法和应用。本发明菌株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1于2016年12月12日保藏于广东省农业微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO.60131。本发明获得的菌株对除草剂有耐受性,能够在除草地膜上快速生长。还可以以其作为生长所需的碳源,将除草地膜进行快速降解,具有很好的应用前景。

Description

一种降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌剂制备方法和应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域,具体涉及一种可降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌剂制备方法和应用。
背景技术
我国20世纪70年代开始使用地膜,目前地膜应用已经覆盖棉花、玉米、小麦、水稻、蔬菜、花生、甘蔗、烟草等众多种类作物;地膜已经成为继化肥、种子和农药以外的第四大农业生产物质资料。地膜应用于农业生产具有很多积极作用,包括:提高和保持土壤温度,保持水分、提高水分利用率,增肥保肥、提高土壤肥效,保持土壤疏松,提高光效,抑盐保苗。因此,地膜在我国大部分省、自治区和直辖市的农业生产中都得到了普遍使用。
地膜的主要生产原料为聚乙烯,它是一种人工合成的高分子化合物,在自然环境中降解速度极慢,可能需要上百年的时间才能完全降解。地膜在我国普遍使用,残留的地膜集中在我国各区域的部分农田中,分布区域非常广泛,这给残留地膜的回收带来了很大的困难,我国地膜的回收率不足三分之一。随着地膜每年的使用,残留在土壤中的地膜越来越多,造成的环境污染问题已日益突出。鉴于聚乙烯的难降解性,目前人们不断研究开发新型地膜,光降解地膜,生物降解地膜,光-生物双降解地膜,含除草剂光降解地膜等。
含除草剂光降解地膜不仅具备了增肥、保肥、保水的作用,还可以有效抑制杂草生长,同时可以被光分解。但是这种光降解地膜的降解速率受光照强度影响较大,而且它并不能完全降解,只是能分解成大小不同的碎片,这种碎片进入土壤中仍会长期残留,影响作物根系生长和对土壤养分的吸收。同时,由于该地膜中含有除草剂的成分,对普通的微生物具有一定抑制作用,使这些碎片更加难以降解。
发明内容
为了解决上述问题,针对目前含除草剂光降解地膜降解不彻底,生物降解性差的问题,本发明提供了一种可降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌剂制备方法和应用。
本发明的目的在于提供一株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1。
本发明的另一个目的在于提供上述菌株在降解除草地膜中的应用。
本发明的再一个目的在于提供一种含有淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1的制剂。
本发明的再一个目的在于提供淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1菌剂的制备方法。
本发明所采取的技术方案是:
一种可降解除草地膜的菌株GFDZ1,经鉴定为淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus),2016年12月12日保藏于广东省农业微生物菌种保藏中心,保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,广东省微生物研究所,保藏编号为GDMCC NO.60131,建议的分类命名为Paecilomyces lilacinus GFDZ1,已于2016年12月16日鉴定保藏的菌株是存活的。
本发明的有益效果是:
1)本发明获得的菌株对除草剂有耐受性,能够在除草地膜上快速生长。
2)本发明所获得的菌株不仅可以在除草地膜上生长,还可以以其作为生长所需的碳源,将除草地膜进行快速降解。
3)本发明所制备的菌剂,方法简单,该菌剂为微生物发酵产品,无毒害,无环境污染,在农田中应用降解地膜的同时不会造成二次污染。
4)本发明所制备的菌剂培养基配方价格低廉,易获取。本发明固体发酵培养基培养基中加入了有利于淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1菌体的快速生长和孢子的形成,提高孢子产量。
附图说明
图1为淡紫拟青霉GFDZ1降解除草地膜7天后的效果;A为7天后对照组和实验组中除草地膜的降解情况,B为将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1接种到含除草地膜的无机盐培养基中;
图2为淡紫拟青霉GFDZ1降解除草地膜电镜图;
图3淡紫拟青霉GFDZ1的平板培养及其在电镜、显微镜下的形态图。
具体实施方式
淡紫拟青霉,其分类命名为(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1,已保藏于广东省微生物菌种保藏中心GDMCC,保藏编号为GDMCC No:60131。
上述淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1在降解除草地膜中的应用。
优选的,所述除草地膜中含有除草剂,所述除草剂选自甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、敌稗、异丙草胺、异丙隆、莠去津、扑草净、莠灭净、嗪草酮和环嗪酮中的至少一种。
一种降解除草地膜的菌剂,该菌剂含有上述所述淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus GFDZ1。
一种用于淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1的固体发酵培养基,该发酵培养基含有0.1%~0.2%的麦芽糖、0.05%~0.1%的硫酸铵、0.02~0.04%的蛋壳粉、0.01%~0.03%的硫酸锰、40%~50%的水,余量为麦麸和玉米粉,其中麦麸和玉米粉的重量比为(4.5~5.2):(0.8~1.5)。
优选的,上述发酵培养基含有0.12%~0.18%麦芽糖,0.08%~0.1%硫酸铵,0.025~0.035%蛋壳粉和0.015%~0.025%硫酸锰,含42%~58%的水,余量为麦麸和玉米粉,其中麦麸和玉米粉的重量比为(4.8~5):(1.0~1.2)。
一种制备淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1的菌剂方法,将上述所述的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于PDA平板培养基,在26~30℃条件下活化,将活化后的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于Czapek培养液,26~30℃,110~130r/min条件下培养5~7d,获得种子液;将种子液按3~5%的接种量接种于上述所述固体发酵培养基,26~30℃潜盘培养6~9d,粉碎后获得淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus GFDZ1菌剂。
上述所述方法制备的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂。
上述所述淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂在降解除草地膜中的应用。
优选的,所述除草地膜中含有除草剂,所述除草剂选自甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、敌稗、异丙草胺、异丙隆、莠去津、扑草净、莠灭净、嗪草酮和环嗪酮中的至少一种。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1的富集、分离、筛选和鉴定
一种可降解除草地膜的菌株GFDZ1,命名为Paecilomyces lilacinus GFDZ1,由广东省农业科学院农业资源与环境研究所在田间土壤分离得到。其具体分离、筛选、鉴定方法如下:
(1)除草地膜降解菌株GFDZ1的富集
从田间收集已经发生降解的除草地膜。将其放入无机盐培养(1L):K2HPO4 0.7g,KH2PO4 0.7g,MgSO4.7H2O 0.7g,NH4NO3 1.0g,NaCl 0.005g,FeSO4.7H2O 0.002g,ZnSO4.7H2O0.002g,MnSO4.H2O 0.001g,150r/min,30℃培养15d,进行除草地膜降解菌的富集。
(2)除草地膜降解菌株GFDZ1的分离
将除草地膜剪成5cm×2cm大小,用70%的酒精消毒,然后在紫外灯下照射4h,贴于固体无机盐培养基上。吸取0.1mL富集培养的液体涂布于固体无机盐培养基,30℃培养5d。挑取在除草地膜与培养基交界处的菌株,在培养基上划线获得单菌落(细菌用LB培养基,真菌用PDA培养基,放线菌用高氏一号培养基),4℃保存备用。
(3)除草地膜菌株GFDZ1的筛选
将上述分离的菌株接种到含有5cm×2cm大小除草剂地膜的液体无机盐培养基中,150r/min,30℃培养,观察地膜降解情况,筛选获得一株真菌能够快速降解除草地膜。
(4)菌株鉴定
a.形态学观察:将菌株在PDA上培养,观察菌落形态。本发明菌株在PDA固体培养基上菌落较大、成圆形,培养2天时长出白色菌丝体,继续培养出现淡紫色孢子。经电镜观察,分生孢子梗末端膨大。分生孢子为单细胞,呈链状平滑、无色至黄色,孢梗上具有瓶颈状不规则的分枝或轮生分枝,瓶梗基部较宽(如图3所示)。
b.分子生物学鉴定:提取真菌基因组总DNA,PCR引物为ITS1:5’-TCCGTAGGAACCTGCGC-3’(SEQ ID NO:1),ITS2:5’-GCTGCGTTCTTCACGATGC-3’(SEQ ID NO:2)。PCR反应体系为50μl,反应条件为:94℃5min,(94℃30s,57℃50s,72℃50s)循环30次;72℃10min。PCR扩增产物测序后将获得的DNA序列输入GenBank,用Blast程序与数据库中的所有序列进行比较,用MEGA进行系统发育树的构建。发现本发明菌株与登陆号为GU980033.1的Paecilomyces lilacinus strain NRRL22958菌株同源性达98%,说明本发明菌株为淡紫拟青霉。
实施例2淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1菌剂的制备方法
将上述筛选所得的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1接种于PDA平板,在28℃条件下活化,将活化后的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1接种于Czapek培养液,28℃,120r/min条件下培养5~7d,获得种子液;将种子液按4%的接种量接种于固体发酵培养基,28℃潜盘培养7d,粉碎后获得淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)GFDZ1菌剂。
上述固体发酵培养基中含有0.15%麦芽糖,0.08%硫酸铵,0.03%蛋壳粉,0.02%硫酸锰,含水率为45%,余量为麦麸和玉米粉,其中麦麸和玉米粉的重量比为5:1。
所述固体发酵培养基培养基中加入了有利于淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)GFDZ1菌体的快速生长和孢子的形成,提高孢子产量。
实施例3淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1菌剂的制备方法
将上述筛选所得的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于PDA平板培养基,在30℃条件下活化,将活化后的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于Czapek培养液,30℃,110r/min条件下培养7d,获得种子液;将种子液按5%的接种量接种于固体发酵培养基,30℃潜盘培养6d,粉碎后获得淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinusGFDZ1菌剂。
所述固体发酵培养基含有0.1%%的麦芽糖,0.05%%的硫酸铵,0.04%的蛋壳粉,0.03%的硫酸锰,含水率为48%,余量为麦麸和玉米粉,其中麦麸和玉米粉的重量比为4.5:1.5。
实施例4淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1对除草地膜的降解能力测定
将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1接种到含除草地膜(见CN103497412A)的无机盐培养基中(见图1B),观察地膜变化,并在第7、14、21和30天测定地膜失重率。同时在第7天观察其电镜下变化。并设置3个平行及空白对照。
表1除草地膜失重率测定
由表1数据可知接种了淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1的除草地膜的重量在0-30d中不断下降,至第30d,失重率达到68.10%,说明该菌株对除草地膜具有较好的降解能力。
图1为经本发明淡紫拟青霉降解除草地膜7天后的效果图,图中对照组为菌株降解前的除草地膜,从图中可以看出,7天后已经可以明显看出除草地膜发生了降解(图1A)。说明本发明菌株GFDZ1对除草地膜具有很好的降解效果。本发明所获得的菌株不仅可以在除草地膜上生长,还可以以其作为生长所需的碳源,将除草地膜进行快速降解。本发明所制备的菌剂,方法简单,该菌剂为微生物发酵产品,无毒害,无环境污染,在农田中应用降解地膜的同时不会造成二次污染。
图2为淡紫拟青霉GFDZ1对除草地膜降解7天后的电镜图,从中可以从图2(左)看到未接种淡紫拟青霉GFDZ1的除草地膜在电镜下未观察到裂痕,而从图2(右)看到经淡紫拟青霉GFDZ1降解的除草地膜,出现了明显裂痕,并且淡紫拟青霉菌丝布满了地膜的表面。
淡紫拟青霉GFDZ1平板培养中菌落形态图如图3(左)所示,菌落较大、成圆形,有白色菌丝体,表面层淡紫色。图3(中)为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1在降解除草地膜过程中的电镜图,从中可以看出,其与正常培养时的菌体形相同,生长良好,说明淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1可以附着在除草地膜上很好地生长,并将其降解。图3(右)为显微镜下淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1菌体形态。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院农业资源与环境研究所
<120> 一种降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌剂制备方法和应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物
<400> 1
tccgtaggaa cctgcgc 17
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物
<400> 2
gctgcgttct tcacgatgc 19

Claims (6)

1.淡紫拟青霉,其分类命名为(Paecilomyces lilacinus)GFDZ1,已保藏于广东省微生物菌种保藏中心GDMCC,保藏编号为GDMCC No:60131。
2.权利要求1所述淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1在降解除草地膜中的应用。
3.一种降解除草地膜的菌剂,其特征在于,该菌剂含有权利要求1所述淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1。
4.一种制备淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂的方法,其特征在于:
1)将权利要求1所述的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于PDA平板培养基,在26~30℃条件下活化;
2)将活化后的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1接种于Czapek培养液,26~30℃,110~130 r/min条件下培养5~7 d,获得种子液;
3)将种子液按3~5%的接种量接种于固体发酵培养基,26~30℃浅盘培养6~9 d,粉碎后获得淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂,所述固体发酵培养基含有0.1%~0.2% 的麦芽糖、0.05%~0.1%的硫酸铵、0.02~0.04%的蛋壳粉、0.01%~0.03%的硫酸锰、40%~50%的水,余量为麦麸和玉米粉,其中麦麸和玉米粉的重量比为(4.5~5.2):(0.8~1.5),所有百分比均为重量百分比。
5.权利要求4所述方法制备的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂。
6.权利要求5所述淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus GFDZ1菌剂在降解除草地膜中的应用。
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一株地膜降解真菌的筛选及其降解性能分析;李夏等;《微生物学报》;20180809;第59卷(第1期);第56-67页 *
几种肥料对淡紫拟青霉E7菌株产孢量的影响;周端咏等;《中国农学通报》;20121231;第28卷(第30期);第155-158页 *

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