CN101717722A - 微生物菌剂及其制备方法和生产生物腐植酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微生物菌剂及其制备方法和使用该微生物菌剂通过甘蔗制糖残渣生产生物腐植酸的方法。本发明提供的微生物菌剂包括培养基和菌体，其中，所述菌体包括：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉，并且，每克所述复合微生物菌剂所含的总活菌数为0.5-1.5×109个。本发明的微生物菌剂能够实现对甘蔗制糖残渣的快速发酵，从而得到生物腐植酸。与矿物腐植酸相比，生物腐植酸具有分子量小、含有活性基团多、水溶性较好、易于被动植物组织吸收、以及生物活性较高等优点，可以用作水体、土壤的修复制剂和肥料。从而使甘蔗制糖残渣得到了有效的处理和利用，真正的实现了变废为宝。

Description

微生物菌剂及其制备方法和生产生物腐植酸的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物菌剂及其制备方法和使用该微生物菌剂通过甘蔗制糖残渣生产生物腐植酸的方法。
背景技术
甘蔗是我国重要的糖料作物，也是我国糖分的主要来源。
由甘蔗制糖的过程中，大部分的糖分被提取出来，而剩余的非糖分有机物大部分都存在于副产物中，形成残渣。在残渣中含有甘蔗经破碎和提取蔗汁后甘蔗茎的纤维性物质，约为甘蔗重量的25％左右，我国每年产生甘蔗制糖残渣近千万吨。
目前甘蔗制糖残渣主要被用作燃料而应用于糖厂锅炉发电和供应蒸汽，小部分被用于造纸以及生产动物饲料等。
虽然甘蔗制糖残渣直接燃烧是处理甘蔗制糖残渣最简洁快速的方法，但是甘蔗制糖残渣的直接燃烧既浪费甘蔗制糖残渣资源，又会产生大量CO2等温室气体，对空气和自然环境造成严重的污染。甘蔗制糖残渣造纸过程中又会产生大量的废水，对环境造成二次污染。
由于甘蔗制糖残渣中木质素的含量高达20％以上，直接用作饲料可引起动物消化系统的损伤和紊乱，现国内只限于用甘蔗制糖残渣来喂牛、羊等反当动物，且用量不超过日粮的20％，因而限制了甘蔗制糖残渣作为饲料的开发和利用。
因此，对甘蔗制糖残渣的有效处理成为迫切需要解决的问题。
发明内容
基于目前存在的问题，本发明的发明人提供了一种微生物菌剂及制备该微生物菌剂的制备方法，并利用所述微生物菌剂使甘蔗制糖残渣发酵，将残渣中的有机成分进行分解和转化，从而将残渣转化成为生物腐植酸，实现了对甘蔗制糖残渣的有效利用。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包括培养基和菌体，其中，所述菌体包括：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitlis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、链霉菌(Streptomyces sp)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，其中，每克所述复合微生物菌剂所含的总活菌数为0.5-1.5×109个，其中，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的10-30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的5-15％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的5-15％。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种微生物菌剂的制备方法，其中，该方法包括将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉接种于培养基中进行培养，使得到的每克微生物菌剂的总活菌数为0.5-1.5×109个，其中，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的10-30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的5-15％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的5-15％。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种生产生物腐植酸的方法，其中，该方法包括将本发明提供的微生物菌剂接种于甘蔗制糖残渣中，之后将所述残渣装入透气性包装体中进行发酵，发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至55℃以上，随后自然下降至50℃以下，得到生物腐植酸。
本发明提供的微生物菌剂使用了几种重要的功能微生物的特异组合，能够实现对甘蔗制糖残渣的快速发酵，且残渣不需要进行任何预处理。经本发明提供的微生物菌剂和方法发酵后，能够得到富含有机质、水溶性腐植酸、氨基酸和大量有益菌群的一种混合物，即生物腐植酸(bio-active humic acid，简称BHA)。生物腐植酸是一种具有多效性的混合物，与矿物腐植酸相比，生物腐植酸具有分子量小、含有活性基团多、水溶性较好、易于被动植物组织吸收、以及生物活性较高等优点，可以用作水体修复制剂、饲料添加剂和肥料。从而使甘蔗制糖残渣得到了有效的处理和利用，真正的实现了变废为宝。
具体实施方式
本发明提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包括培养基和菌体，其中，所述菌体包括：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitlis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、链霉菌(Streptomyces sp)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，其中，每克所述复合微生物菌剂所含的总活菌数为0.5-1.5×109个，其中，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的10-30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的5-15％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的5-15％。
根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitlis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、链霉菌(Streptomyces sp)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，例如，可以为以下培养基中的一种或几种：用于培养地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的一种或几种的营养肉汁培养基；用于培养链霉菌的豆饼粉培养基；和用于培养烟曲霉的豆饼粉培养基。
所述营养肉汁培养基的组成为本领域技术人员所公知，例如，以该培养基的总重量为基准，该培养基中蛋白胨的含量可以为0.25-1重量％、NaCl的含量可以为0.25-1重量％、牛肉膏的含量可以为0.2-0.5重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为6.5-7.5。
所述用于培养链霉菌的豆饼粉培养基的组成为本领域技术人员所公知，例如，以该培养基的总重量为基准，该培养基可中玉米淀粉的含量可以为1-5重量％、蔗糖的含量可以为0.5-1.5重量％、豆饼粉的含量可以为2-5重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为6.5-7.5。
所述用于培养烟曲霉的豆饼粉培养基的组成为本领域技术人员所公知，例如，以该培养基的总重量为基准，该培养基可中葡萄糖的含量可以为2-5重量％、蛋白胨的含量可以为1-3重量％、豆饼粉的含量可以为2-5重量％、酵母膏的含量可以为0.1-1重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为5.5-6.5。
本发明中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitlis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、链霉菌(Streptomyces sp)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的菌种可以商购得到，例如，购自中国农业菌种保藏中心的枯草芽孢杆菌(ACCC11089)、解淀粉芽孢杆菌(ACCC10388)、地衣芽孢杆菌(ACCC11080)、链霉菌(ACCC40044)、烟曲霉(ACCC30367)。
本发明还提供了一种微生物菌剂的制备方法，其中，该方法包括将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉接种于培养基中进行培养，使得到的每克微生物菌剂的总活菌数为0.5-1.5×109个，其中，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的10-30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的5-15％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的5-15％。
本发明中，所述将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉接种于培养基中进行培养的方法可以在很大范围内改变，例如，该方法可以包括：在各自独立的培养体系中分别培养枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉；并将分别培养得到的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的10-30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的5-15％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的5-15％。
本发明中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitlis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、链霉菌(Streptomyces sp)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的菌种可以商购得到，例如，中国农业菌种保藏中心保藏的枯草芽孢杆菌(ACCC11089)、解淀粉芽孢杆菌(ACCC10388)、地衣芽孢杆菌(ACCC11080)、链霉菌(ACCC40044)、烟曲霉(ACCC30367)。
根据本发明，所述枯草芽孢杆菌的培养方法为本领域技术人员所公知，例如，在100重量份的营养肉汁培养基中接种2-5重量份的枯草芽孢杆菌的菌株，35-40℃发酵培养，直至枯草芽孢杆菌的活菌数为0.5-1.5×109个/克的培养基。
根据本发明，所述解淀粉芽孢杆菌的培养方法为本领域技术人员所公知，例如，在100重量份的营养肉汁培养基中接种2-5重量份的解淀粉芽孢杆菌的菌株，35-40℃发酵培养，直至解淀粉芽孢杆菌的活菌数为0.5-1.5×109个/克的培养基。
根据本发明，所述地衣芽孢杆菌的培养方法为本领域技术人员所公知，例如，在100重量份的营养肉汁培养基中接种2-5重量份的地衣芽孢杆菌的菌株，35-40℃发酵培养，直至地衣芽孢杆菌的活菌数为0.5-1.5×109个/克的培养基。
根据本发明，所述链霉菌的培养方法为本领域技术人员所公知，例如，在100重量份的豆饼粉培养基中接种2-5重量份的链霉菌的菌株，25-30℃发酵培养，直至链霉菌的活菌数为0.5-1.5×109个/克的培养基。
根据本发明，所述烟曲霉的培养方法为本领域技术人员所公知，例如，在100重量份的豆饼粉培养基中接种2-5重量份的烟曲霉的菌株，25-30℃发酵培养，直至烟曲霉的活菌数为0.5-1.5×109个/克的培养基。
优选情况下，将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉培养至与得到的微生物菌剂中所期望的单位培养基中所含的活菌数相同，这样在后续的混合步骤中只需要按照上述微生物活菌数之间的比例混合即可，而不用担心制得的微生物菌剂的总活菌数是否符合需要的范围。
根据本发明，所述混合的条件没有特别的限制，只要能够使得到的微生物菌剂满足以下条件即可：使得到的微生物菌剂中，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的10-30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的5-15％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的5-15％。
本发明还提供了一种生产生物腐植酸的方法，其中，该方法包括将本发明提供的微生物菌剂接种于甘蔗制糖残渣中，之后将所述残渣装入透气性包装体中进行发酵，发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至55℃以上，随后自然下降至50℃以下，得到生物腐植酸。优选情况下，发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至65℃以上，随后自然下降至40℃以下，在这样的发酵条件下能够进一步地提高发酵效果，使得到的生物腐植酸中的黄腐酸的含量和有益微生物的数量进一步的提高。
根据本发明，术语“生物腐植酸(bio-active humic acid，简称BHA)”是指一种混合物，它富含有机质、水溶性腐植酸、氨基酸和大量有益菌群。所述微生物菌剂的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，相对于100重量份的甘蔗制糖的残渣，所述微生物菌剂的接种量为0.5-10重量份。
优选情况下，在进行发酵之前，将所述透气性包装体内的残渣的含水量调节至50-70重量％，在这样的条件下，发酵更为快速且发酵效果更好。
本发明中，所述透气性包装体的材料没有特别的限制，只要能够实现发酵所需的透气功能即可，例如，所述透气性包装体的材料可以为透气性织物和/或透气性塑料薄膜。另一方面，所述透气性包装体也可以由非透气性材料制成，例如，所述透气性包装体可以为由非透气性材料制成的具有透气孔的包装体。
下面，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的微生物菌剂及其制备方法。
(1)在100重量份的营养肉汁培养基中接种3重量份的地衣芽孢杆菌的菌株(ACCC11080，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至地衣芽孢杆菌的活菌数为0.5×109个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为0.5重量％、NaCl的含量为0.5重量％、牛肉膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，pH为7.0。
(2)在100重量份的营养肉汁培养基中接种4重量份的枯草芽孢杆菌的菌株(ACCC11089，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽孢杆菌的活菌数为0.5×109个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为0.5重量％、NaCl的含量为0.5重量％、牛肉膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，pH为7.0。
(3)在100重量份的营养肉汁培养基中接种2重量份的解淀粉芽孢杆菌的菌株(ACCC10388，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至解淀粉芽孢杆菌的活菌数为0.5×109个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为0.5重量％、NaCl的含量为0.5重量％、牛肉膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，pH为7.0。
(4)在100重量份的用于培养链霉菌的豆饼粉培养基中接种2重量份的链霉菌的菌株(ACCC40044，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，28℃发酵培养，在发酵培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至链霉菌的活菌数为0.5×109个/克的培养基，其中，所述豆饼粉培养基中，玉米淀粉(广东汕头市西陇化工厂)的含量可以为4.5重量％、蔗糖的含量为1重量％、豆饼粉(北京恩希培养基技术有限公司)的含量为3重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为7.0。
(5)在100重量份的用于培养烟曲霉的豆饼粉培养基中接种4重量份的烟曲霉菌株(ACCC30367，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，28℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至烟曲霉的活菌数为0.5×109个/克的培养基。其中，所述豆饼粉培养基中，葡萄糖的含量为3重量％、蛋白胨的含量为1.5重量％、豆饼粉的含量为3重量％、酵母膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为6.0。
(6)将步骤(1)至(5)中得到的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中的总活菌数为0.5×109个/克的培养基，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的28％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的28％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的6％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的8％，得到微生物菌剂A1。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的微生物菌剂及其制备方法。
(1)在100重量份的营养肉汁培养基中接种5重量份的地衣芽孢杆菌的菌株(ACCC11080，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至地衣芽孢杆菌的活菌数为1.5×109个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为0.5重量％、NaCl的含量为0.5重量％、牛肉膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，pH为7.0。
(2)在100重量份的营养肉汁培养基中接种3重量份的枯草芽孢杆菌的菌株(ACCC11089，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽孢杆菌的活菌数为1.5×109个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为0.5重量％、NaCl的含量为0.5重量％、牛肉膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，pH为7.0。
(3)在100重量份的营养肉汤培养基中接种3重量份的解淀粉芽孢杆菌的菌株(ACCC10388，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至解淀粉芽孢杆菌的活菌数为1.5×109个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为0.75重量％、NaCl的含量为0.75重量％、牛肉膏的含量为0.2重量％、余量为无菌水，pH为7.0。
(4)在100重量份的用于培养链霉菌的豆饼粉培养基中接种4重量份的链霉菌的菌株(ACCC40044，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，28℃发酵培养，在发酵培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至链霉菌的活菌数为1.5×109个/克的培养基，其中，所述豆饼粉培养基中，玉米淀粉的含量为2.5重量％、蔗糖的含量为1.2重量％、豆饼粉的含量为2重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为7.0。
(5)在100重量份的用于培养烟曲霉的豆饼粉培养基中接种3重量份的烟曲霉菌株(ACCC30367，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，28℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至烟曲霉的活菌数为1.5×108个/克的培养基。其中，所述豆饼粉培养基中，葡萄糖的含量可以为2重量％、蛋白胨的含量为1重量％、豆饼粉的含量为3重量％、酵母膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为6.0。
(6)将步骤(1)至(5)中得到的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中的总活菌数为1.5×109个/克的培养基，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的20％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的10％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的10％，得到微生物菌剂A2。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的微生物菌剂及其制备方法。
(1)在100重量份的营养肉汁培养基中接种3重量份的地衣芽孢杆菌的菌株(ACCC11080，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至地衣芽孢杆菌的活菌数为1×109个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为0.5重量％、NaCl的含量为0.5重量％、牛肉膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，pH为7.0。
(2)在100重量份的营养肉汁培养基中接种2重量份的枯草芽孢杆菌的菌株(ACCC11089，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽孢杆菌的活菌数为1×109个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为0.5重量％、NaCl的含量为0.5重量％、牛肉膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，pH为7.0。
(3)在100重量份的营养肉汤培养基中接种4重量份的解淀粉芽孢杆菌的菌株(ACCC10388，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至短小芽孢杆菌的活菌数为1×109个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为0.5重量％、NaCl的含量为0.5重量％、牛肉膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，pH为7.0。
(4)在100重量份的用于培养链霉菌的豆饼粉培养基中接种4重量份的链霉菌的菌株(ACCC40044，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，28℃发酵培养，在发酵培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至链霉菌的活菌数为1×109个/克的培养基，其中，所述豆饼粉培养基中，玉米淀粉的含量可以为3重量％、蔗糖的含量为1重量％、豆饼粉的含量为3重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为7.0。
(5)在100重量份的用于培养烟曲霉的豆饼粉培养基中接种3.5重量份的烟曲霉菌株(ACCC30367，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，28℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至烟曲霉的活菌数为1×109个/克的培养基。其中，所述豆饼粉培养基中，葡萄糖的含量为3重量％、蛋白胨的含量为3重量％、豆饼粉的含量为3.5重量％、酵母膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为6.0。
(6)将步骤(1)至(5)中得到的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中的总活菌数为1×109个/克的培养基，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的25％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的5％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的10％，得到微生物菌剂A3。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的微生物菌剂及其制备方法。
根据与实施例3相同的方法制备微生物菌剂A4，不同在于，分别在步骤(1)至(5)中培养枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉，直至它们的活菌数为1.2×109个/克的培养基，之后按照比例将它们进行混合，使得到的微生物菌剂中的总活菌数为1.2×109个/克的培养基，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的30％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的20％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的10％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的10％，得到微生物菌剂A4。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的微生物菌剂及其制备方法。
根据与实施例3相同的方法制备微生物菌剂A5，不同在于，分别在步骤(1)至(5)中培养枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉，直至它们的活菌数为1.3×109个/克的培养基，之后按照比例将它们进行混合，使得到的微生物菌剂中的总活菌数为1.3×109个/克的培养基，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的25％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的15％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的15％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的15％，得到微生物菌剂A5。
实施例6
本实施例用于说明本发明提供的微生物菌剂及其制备方法。
根据与实施例3相同的方法制备微生物菌剂A6，不同在于，分别在步骤(1)至(5)中培养枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉，直至它们的活菌数为0.8×109个/克的培养基，之后按照比例将它们进行混合，使得到的微生物菌剂中的总活菌数为0.8×109个/克的培养基，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的20％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的10％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的10％，得到微生物菌剂A6。
实施例7
本实施例用于说明本发明的使用甘蔗制糖残渣生产生物腐植酸的方法。
在100重量份的甘蔗制糖的残渣中接种0.5重量份的实施例1中制备的微生物菌剂A1，之后将所述残渣装入透气性编织袋(松溪县包装厂，PP编织袋)中并将残渣的含水量调节至75重量％，之后进行发酵，发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至55℃以上，随后自然下降到50℃，得到生物腐植酸D1。
实施例8
在100重量份的甘蔗制糖的残渣中接种5重量份的实施例2中制备的微生物菌剂A2，之后将所述残渣装入透气性编织袋(松溪县包装厂，PP编织袋)中并将残渣的含水量调节至48重量％，之后进行发酵，发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至55℃以上，随后自然下降到50℃，得到生物腐植酸D2。
实施例9
在100重量份的甘蔗制糖的残渣中接种1重量份的实施例3中制备的微生物菌剂A3，之后将所述残渣装入透气性编织袋(松溪县包装厂，PP编织袋)中并将残渣的含水量调节至55重量％，之后进行发酵，发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至55℃以上，随后自然下降到50℃，得到生物腐植酸D3。
实施例10
在100重量份的甘蔗制糖的残渣中接种10重量份的实施例4中制备的微生物菌剂A4，之后将所述残渣装入透气性编织袋(松溪县包装厂，PP编织袋)中并将残渣的含水量调节至60重量％，之后进行发酵，发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高55℃以上，随后自然下降到50℃，得到生物腐植酸D4。
实施例11
在100重量份的甘蔗制糖的残渣中接种10重量份的实施例5中制备的微生物菌剂A5，之后将所述残渣装入透气性编织袋(松溪县包装厂，PP编织袋)中并将残渣的含水量调节至60重量％，之后进行发酵，发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至65℃以上，随后自然下降到40℃，得到生物腐植酸D5。
实施例12
在100重量份的甘蔗制糖的残渣中接种4重量份的实施例6中制备的微生物菌剂A6，之后将所述残渣装入透气性编织袋(松溪县包装厂，PP编织袋)中并将残渣的含水量调节至60重量％，之后进行发酵，发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至68℃以上，随后自然下降到38℃，得到生物腐植酸D6。
实施例13-18
本实施例用于说明本发明的生物腐植酸的检测方法。
(一)分别采用本领域中通用的容量法分别对实施例7-12中制备的生物腐植酸D1-D6中的主要成分黄腐酸的含量进行检测，具体步骤如下：
1)称取生物腐植酸样品0.5克并将其加入到装有80ml蒸馏水的250ml锥形瓶中，在瓶口插上玻璃漏斗，置于100℃沸水浴中震荡保温30min，取出冷却至室温；
2)将溶液及残渣全部转入到250ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至250ml，摇匀，用干燥的中速定性滤纸过滤，准确移取滤液5ml于250ml锥形瓶中，加入2ml 0.8mol/L重铬酸钾溶液，缓慢加入10ml浓硫酸，于沸水浴中加热氧化30min；将氧化后的溶液从水浴中取下，冷却至室温，加入约70ml蒸馏水、100μl邻菲罗啉-硫酸亚铁铵混合指示剂；
3)使用硫酸亚铁铵标准滴定溶液c[(NH4)2Fe(SO4)2]＝0.1mol/L进行滴定，溶液由橙色经亮绿色转变为砖红色为终点。同时做空白试验。
黄腐酸质量(C)通过以下公式计算：
C = ( V 0 - V 1 ) × C 1 × 0.003 × 100 % ( m + D × 0.5 )
式中：
V0-空白试验时，消耗的硫酸亚铁铵标准滴定溶液的体积，单位为毫升(ml)；V1-测定试样时，所消耗的硫酸亚铁铵标准滴定溶液的体积，单位为毫升(ml)；
C1-硫酸亚铁铵标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
m-生物腐植酸样品的质量，单位为克(g)；
D-定容体积与吸取体积之比；
0.003-与1L的浓度为1.000mol/L的硫酸亚铁铵标准滴定溶液相当的碳质量，g；
0.5-黄腐酸的碳系数。
将得到的黄腐酸的质量除以生物腐植酸样品再乘以100％，得到生物腐植酸样品中黄腐酸的质量百分比含量。
(二)生物腐植酸D1-D6以及发酵前的甘蔗制糖残渣中黄腐酸的量如表1所示。
采用本领域通用的稀释涂板法分别检测生物腐植酸D1-D6中有益微生物的数量，具体步骤如下：
将5克生物腐植酸样品加到含45ml无菌水的锥形瓶中，再从摇匀的锥形瓶中取1ml液体加入到9ml无菌水中(此时为10-1)，之后依次做10倍递增稀释直到10-8，根据所用培养基选取三个合适的稀释度。分别吸取0.1ml稀释度为10-5、10-6、10-7的稀释液，注入平板计数培养基(培养放线菌的改良高氏一号培养基，海博生物技术有限公司，HB8550)的培养皿中，每个稀释度做3个平行重复。在30℃恒温培养，选取菌落数在30-300之间的培养皿，计数并计算菌落数，取平均值。
生物腐植酸D1-D6以及发酵前的甘蔗制糖残渣中有益微生物的数量如表1所示。
此处，术语“有益微生物”泛指对除致病微生物以外的其他微生物，主要包括对农业有益微生物和能降解农药、N、P、有机废弃物的环境有益微生物，在显微镜下，致病微生物与有益微生物可以通过其各自的形态特征被区别开，这使得微生物菌落数的计数得以进行。
表1
Figure G2009102413629D0000171
从上表1可以看出，使用本发明的微生物菌剂A1-A6对蔗糖残渣进行发酵处理而得到的生物腐植酸D1-D6中黄腐酸的含量显著提高，提高了77.2％以上；并且有益微生物的数量也显著的增加，提高了两个数量级以上。
特别地，与实施例13和14相比，实施例15-18中检测的D3-D6的黄腐酸的含量更高，并且有益微生物的数量更多，这说明在发酵之前将甘蔗制糖残渣的含水量控制在50-70重量％之内时发酵效果更好。
此外，与实施例16相比，实施例17和18中检测的D5和D6的黄腐酸的含量更进一步地提高，并且有益微生物的数量也进一步地增多，这说明在优选的发酵条件下(发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至65℃以上，随后自然下降至40℃以下)，能够进一步地提高发酵效果，从而进一步地提高得到的生物腐植酸中的黄腐酸的含量和有益微生物的数量。
实施例19-24
将从猪场取新鲜粪水装于聚氯乙烯桶(直径0.4m，高0.6m)，每桶装50kg废水。分别将实施例7-12中制备的生物腐植酸D1-D6制备成1重量％浓度的灭菌生物腐植酸(在115℃下灭菌20分钟后得到的生物腐植酸)溶液和未灭菌的生物腐植酸溶液，各1L。
分别将灭菌的生物腐植酸溶液和未灭菌的生物腐植酸溶液加入到聚氯乙烯桶中与粪水混匀。自然发酵8天，将未加入溶液而直接发酵粪水的组作为空白对照组。
发酵前后通过重铬酸盐法(GB11914-89)测定粪水的CODCr，见表2。
表2
Figure G2009102413629D0000181
空白对照组发酵8天后的CODCr为1820mg L-1，CODCr去除率只有31.4％，而从表2可以看出添加本发明的生物腐植酸D1-D6进行发酵的，相对于空白对照组去除率均显著提高，并且，未灭菌的去除率高于灭菌的处理的去除率，这说明有益微生物的代谢，能促进黄腐酸的作用，加快有机物的分解，以使CODCr降低。由此可以看出，使用本发明提供的微生物菌剂制得的生物腐植酸中，黄腐酸和有益微生物二者相辅相成，协同促进了有机废物的分解，从而可以应用于水体修复。
实施例25-30
将实施例7-12中制备的生物腐植酸D1-D6稀释100倍，配制成灭菌的生物腐植酸(在115℃下灭菌20分钟后得到的生物腐植酸)溶液和未灭菌的生物腐植酸溶液。在无菌条件下，用镊子将20粒玉米种子放入无菌培养皿中，每皿种子称量初重，用无菌移液管取40mL浸种液加入培养皿内，置于28℃培养箱内，浸种12h。12h后，把种子移入铺有无菌滤纸的培养皿中，加入无菌水，置于28℃培养箱中催芽。并随时观察催芽情况，补水，保持平皿内湿润环境。催芽24h后，记录发芽数。将催芽后的种子转移至无菌的250mL三角瓶内，每瓶装10粒种子，加入定量无菌水，置于25℃光照培养箱内培养72h，随时观察生长情况，定量补水。培养72h后，测量种子根增长长度、茎叶增长长度、粒量。试验以无菌水来浸种作为空白对照处理。结果如表3所示。
表3
空白对照组的玉米种子发芽率、增重、根增长长度、茎叶增长长度分别为86.9％、1.1克/粒、125.15毫米、63.83毫米。从表3可以看出，相对于空白对照组，使用灭菌的或未灭菌的实施例7-12中制备的生物腐植酸稀释液处理种子的效果显著提高，为灭菌的稀释液的处理效果明显好于灭菌的稀释液，这说明有益微生物的代谢，能提高黄腐酸对植物生长的促进的作用。由此可以看出，使用本发明提供的微生物菌剂制得的生物腐植酸中，黄腐酸和有益微生物二者相辅相成，能够协同促进植物的生长，可以用作肥料。
实施例31-36
采用温室盆栽试验来研究实施例7-12中制备的生物腐植酸D1-D6的肥效。
供试植物为紫花苜蓿，试验土样采自中国农科院河北廊坊实验站，基本养分指标为有机质2.69g·kg-1；全氮0.65g·kg-1；速效磷8.63mg·kg-1；速效钾105.15mg·kg-1；Cu1.07mg·kg-1；Fe6.00mg·kg-1；Zn3.11mg·kg-1；Mn5.44mg·kg-1。
每个花盆称取1600g土，分别加入0.05重量％的灭菌生物腐植酸(在115℃下灭菌20分钟后得到的生物腐植酸)和未灭菌的生物腐植酸，并将未加入生物腐植酸的花盆设为空白对照组，试验时间3个月。
在紫花苜蓿种下2个月后，用无菌打孔器在花盆中五点取样，取样深度0-10cm，所取土样风干，过1mm筛，用水合热重铬酸钾氧化-比色法测定土壤有机质，具体方法参照鲁如坤的《土壤农业化学分析方法》。在紫花苜蓿种下3个月时，取紫花苜蓿地上部分，105℃烘2-3h，至恒重后，称重得到紫花苜蓿生物量。实验结果见表4。
表4
Figure G2009102413629D0000211
空白对照组中的土壤有机质含量和生物量分别为6.13g·kg-1和0.17g/株。从表4的结果可以看出，相对于空白对照组，加入灭菌的和未灭菌的生物腐植酸D1-D6的使土壤有机质含量、植物生物量都得到较快而显著的提高，说明实施例7-12中制备的生物腐植酸D1-D6能使土壤质量得到很到改善，具有较好的肥效。
实施例37-42
采用小区试验来研究实施例7-12中制备的生物腐植酸D1-D6对退化土壤的修复作用。
试验地位于新疆阜康222团80亩核心示范基地，属大陆性中温带气候区，年均气温6.7℃；日照时数2931.3h；有效积温3551.5℃；无霜期174d；降雨量205mm。试验地前茬为小麦。
土壤类型为盐碱度中等的砂质土，基本养分指标如下：pH 8.42；全氮0.244g·kg-1；全磷0.726g·kg-1；全钾15.0g·kg-1；有机质4.97g·kg-1。在播种甘草种子前深耕30cm左右，翻耕后整平耙细。每个小区面积为1/15hm2，播种前每个小区施入生物腐植酸30kg。
本试验所用甘草的种源为乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)的干燥成熟种子。播前用碾米机磨种皮，使种皮粗糙，增加透水性，再将种子在45℃温水中浸泡10h。
播种方法为机械播种，采用条播，播深2-3cm，行距为25cm，播后适当镇压。播种量折合45kg·hm-2。播种6个月后，取土样测定土壤主要理化指标，包括土壤机械组成、土壤全氮、全磷、全钾、有机质；土壤酶活性，包括碱性磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶；土壤微生物学指标，主要包括：土壤中功能微生物，即自生固氮菌和氨氧化细菌的数量，微生物生物量碳，微生物商。
土壤各理化指标测定方法及具体操作步骤参见鲁如坤的《土壤农业化学分析方法》。土壤机械组成分析采用吸管法，土壤粒级划分如下：极粗砂粒2-1mm；粗砂粒1-0.5mm；中砂粒0.5-0.25mm；细砂粒0.25-0.1mm；极细砂粒0.1-0.05mm；粉粒0.05-0.005mm；粘粉粒＜0.005mm；粘粒＜0.002mm，各粒级土壤所占含量如表5所示。
表5单位(％)
  实施例的编号   腐植酸的编号   极粗砂粒   粗砂粒   中砂粒   细砂粒   极细砂粒   粉粒   粘粉粒   粘粒
  实例37   D1   0.41   0.51   0.19   11.88   12.34   30.94   32.96   10.77
  实例38   D2   0.41   0.44   0.17   10.23   12.76   31.42   34.34   10.23
  实例39   D3   0.43   0.43   0.19   10.04   11.74   31.86   33.05   12.26
  实例40   D4   0.36   0.39   0.2   9.82   11.23   32.88   33.56   11.56
  实例41   D5   0.24   0.41   0.16   8.89   12.07   31.08   35.02   12.13
  实例42   D6   0.23   0.33   0.11   8.97   11.42   30.59   36.96   11.39
  CK   0.52   0.65   0.19   14.54   11.94   31.13   30.18   10.85
采用采用凯氏消煮法检测土壤全氮；采用碱溶-钼兰比色法检测全磷；采用氢氧化钠熔融-火焰光度计法检测土壤全磷；采用油浴加热重铬酸钾容量法检测土壤有机质，结果见表6。
表6
  实施例的编号   生物腐植酸的编号   全氮g·kg-1   全磷g·kg-1   全钾g·kg-1   有机质g·kg-1
  实例37   D1 0.821 1.13 13.91 8.12
  实例38   D2 0.823 1.11 13.92 8.15
  实例39   D3 0.853 1.08 13.83 8.56
  实例40   D4 0.895 1.12 13.5 8.63
  实例41   D5 0.907 1.14 14.01 8.79
  实施例的编号   生物腐植酸的编号   全氮g·kg-1   全磷g·kg-1   全钾g·kg-1   有机质g·kg-1
  实例42   D6 0.91 1.13 14.06 8.75
  CK   0.758   1.16   14.5   7.55
土壤沙化的特征是土壤粘粉粒、有机质和全氮含量的下降，并且土壤有机质和全氮的损失主要是源于由风蚀所引起的土壤粘粉粒比例的减少，土壤质地(尤其是粘粉粒含量)与土壤养分具有非常密切的关系。评价修复效果的好坏，就是要看土壤质地(尤其是粘粉粒含量)是否得到了改善，以及土壤全氮、有机质等重要养分含量是否得到了有效积累。
从表5和表6可看出施用了本发明的生物腐植酸D1-D6后，使土壤的机械组成发生了变化，土壤粗粒含量减少，粘粉粒和粘粒含量显著增加，土壤质地得到明显改善，并且显著地提高了土壤全氮和有机质的含量，这充分说明了使用本发明提供的微生物菌剂得到的生物腐植酸对退化土壤的修复具有良好的效果。
综上所述，通过本发明的微生物菌剂发酵得到的生物腐植酸可以用作水体、土壤的修复制剂和肥料，从而使甘蔗制糖残渣得到了有效的处理和利用，真正的实现了变废为宝。

Claims (9)

1.一种微生物菌剂，该微生物菌剂包括培养基和菌体，其特征在于，所述菌体包括：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitlis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、链霉菌(Streptomyces sp)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，其中，每克所述复合微生物菌剂所含的总活菌数为0.5-1.5×109个，其中，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的10-30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的5-15％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的5-15％。
2.权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其中，该方法包括将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉接种于培养基中进行培养，使得到的每克微生物菌剂的总活菌数为0.5-1.5×109个，其中，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的10-30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的5-15％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的5-15％。
3.根据权利要求2所述的制备方法，所述将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉接种于培养基中进行培养的方法包括：在各自独立的培养体系中分别培养枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉；并将分别培养得到的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、链霉菌和烟曲霉按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-30％，所述地衣芽孢杆菌的总活菌数为总活菌数的10-30％，所述链霉菌的活菌数为总活菌数的5-15％，所述烟曲霉的活菌数为总活菌数的5-15％。
4.一种生产生物腐植酸的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1所述的微生物菌剂接种于甘蔗制糖残渣中，之后将所述残渣装入透气性包装体中进行发酵，发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至55℃以上，随后自然下降至50℃以下，得到生物腐植酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述发酵的条件使得所述透气性包装体内的残渣的温度升高至65℃以上，随后自然下降至40℃以下。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，相对于100重量份的甘蔗制糖的残渣，所述微生物菌剂的接种量为0.5-10重量份。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其中，在进行发酵之前，将所述透气性包装体中的残渣的含水量调节至50-70重量％。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述透气性包装体的材料为透气性织物和/或透气性塑料薄膜。
9.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述透气性包装体为由非透气性材料制成的具有透气孔的包装体。
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