CN102703364B

CN102703364B - 一株厌氧芽孢杆菌utm501及其应用

Info

Publication number: CN102703364B
Application number: CN2012102271776A
Authority: CN
Inventors: 刘永跃; 周顺桂; 许宜北; 汪涌
Original assignee: DADI LVYUAN ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY (BEIJING) CO LTD
Current assignee: DADI LVYUAN ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY (BEIJING) CO LTD
Priority date: 2012-05-14
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: CN102703364A

Abstract

本发明提供了一株厌氧芽孢杆菌（Anoxybacillus mongoliensis）菌株UTM501，其保藏编号为CGMCC No.5928，该菌株UTM501在中温至高温范围均能代谢有机物质进行生长。本发明还提供了利用该菌株制备堆肥接种剂的方法，将制得的堆肥接种剂用于污泥堆肥，能够促进有机物的降解，使堆体快速起温，迅速进入堆肥高温阶段并维持较长的高温（50-70℃），促进污泥脱水和生物灭菌，加快污泥中有机物质的稳定和腐熟进程，提高堆肥的质量和发酵效率。该堆肥接种剂生产成本低，质量稳定，可应用于污泥堆肥，且绿色环保，无污染，性能优良，具有较好的经济效益和社会效益。

Description

一株厌氧芽孢杆菌UTM501及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，具体地，涉及一种生长温度广谱的厌氧芽孢杆菌菌株UTM501及其应用。

背景技术

随着我国城市化进程的加快和环境质量标准的提高，污水处理率和处理程度逐年提高，污泥的产生量也急剧增加。城市污泥的处理与处置已成为限制城市污水处理行业发展的瓶颈。污泥堆肥与其他处理方法，如填埋、焚烧相比，具有建设投资少，运行费用低，基本无二次污染等优点。并且，污泥经堆肥处理后可土地利用，可充分利用其有机质和氮、磷等营养元素，是适合我国国情的处置方式。但是，堆肥工厂化的发展一直受到因堆肥时间和场地带来的成本问题的困扰，堆肥的快速化具有重要的现实意义。

污泥有机物中，水溶性有机物质、蛋白质、半纤维素（淀粉、果胶、木聚糖）等易降解成分达到了重量的一半以上，此类有机物的降解情况在一定程度上影响污泥的腐熟和肥效：在堆肥初期，有机物的快速降解有利于快速起温，迅速进入堆肥高温阶段（50℃）；有机物质的继续降解，有利于维持高温（50-70℃），促进污泥脱水和生物灭菌及腐殖质的形成，对堆肥的腐熟起着重要作用。高温期出现的早晚以及维持时间的长短，直接影响堆肥的质量和发酵效率。

污泥堆肥接种已成为提高堆肥质量和发酵效率的重要手段之一。目前，已有多种微生物被应用于堆肥接种。但这些菌株大多为中温菌，主要的作用体现在促进堆肥起温方面，但当堆温达到45℃以上时，要么由于无法忍受高温、要么以孢子形态存在，不能继续有效发挥降解的作用，使有机物的分解效率下降，污泥脱水和减量、无害化效果较差，还制约腐殖质的形成，影响污泥腐熟。因此，迫切需要寻找一类既能在中温、又能在高温的条件下，代谢有机物的温度广谱性微生物，并且，把这类微生物接种到污泥堆肥中，在堆肥的中温期和高温期利用有机物进行生长代谢，促进迅速达到高温期及维持较长的时间，实现污泥的快速生物干化，提高污泥有机物质的稳定化和堆肥产品的无害、腐熟水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种厌氧芽孢杆菌（Anoxybacillusmongoliensis）及其应用。

本发明菌株UTM501是从采自大地绿源环保科技（北京）有限公司堆肥发酵车间的腐熟的污泥堆肥样品中分离筛选得到的一株在中温至高温范围均能代谢有机物质进行生长的芽孢杆菌菌株，该菌株已于2012年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为Anoxybacillus mongoliensis，保藏号CGMCC No.5928。

本发明菌株UTM501具有如下特性：

UTM501菌株具有蛋白酶和α-淀粉酶活性，可降解蛋白质和淀粉。生长pH值范围为5.5~8.0，生长温度范围为37~70℃。UTM501在细菌培养基平板（牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，植物凝胶10g，蒸馏水1000ml，pH7.2）上的菌落特征是：形态为圆形，表面湿润，边缘整齐浅黄色，啮蚀状，扁平，生长迅速，60℃培养下24小时菌落直径约2mm。UTM501菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，形成内生孢子，芽孢圆形中生，接触酶反应阳性，V．P试验结果阳性。本发明菌株UTM501的16S rRNA序列与EzTaxon数据库(http://www.eztaxon.org/)进行比对分析显示，相似性在97%以上的菌株均为厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus.sp）的菌株。结合其其他特性，将该菌株鉴定为Anoxybacillus mongoliensis，并命名Anoxybacillus mongoliensis.UTM501。

本发明还提供含有厌氧芽孢杆菌UMT501的堆肥接种剂。优选的菌剂含有108~109cfu/g活菌数的厌氧芽孢杆菌UMT501。

本发明提供了厌氧芽孢杆菌UTM501或其发酵产物在污泥堆肥中的应用。

本发明提供了厌氧芽孢杆菌UTM501或其发酵产物在制备堆肥接种剂中的应用。

本发明还提供制备含有厌氧芽孢杆菌UMT501的堆肥接种剂的方法，包括在种子培养基中发酵厌氧芽孢杆菌UMT501，再将发酵种子液与稻壳等基质进行混合，进行二次发酵定殖制备得到堆肥接种剂。

本发明提供的制备堆肥接种剂的方法，包括以下步骤：

1）菌种活化：取厌氧芽孢杆菌菌株UTM501的菌种接种于培养基，在50-60℃条件下培养2-5d；

2）发酵种子液制备：将活化的菌种接种于液体培养基中，进行一级、二级扩大培养；培养条件均为40-60℃，转速为100-200r/min，培养时间为2-7d；

3）在含水量为50%-60%的稻壳堆中添加尿素或碳酸氢铵，12-24h后，再在稻壳堆中均匀泼洒玉米粉、米糠和/或麸皮、发酵种子液与红糖的混合液进行堆置发酵，期间翻堆，至温度稳定在环境温度时，停止发酵，将发酵产物干燥制得堆肥接种剂。

其中，步骤1）和步骤2）所述的培养基含有3~5g/L的牛肉膏、1~3g/L的酵母提取物、5~10g/L胰蛋白胨、3~5g/L的氯化钠，pH7.0-7.4。

其中步骤2）所述的一级扩大培养，当培养液OD600在0.6~1.8之间时停止培养，得一级种子；所述的二级扩大培养为将一级种子按体积比10%接种至1L以上液体培养基中进行二级扩大培养，当培养液OD600在1.5~3.0之间时停止培养，得二级种子，即为最终发酵种子液。

其中步骤3）可稻壳用水浸泡8~24小时，使水分含量达到50-60%。

其中步骤3）所述添加尿素或碳酸氢铵的方法为，按稻壳干重质量比0.3%-0.8%添加尿素；或按稻壳干重质量比的1%-3%添加碳酸氢铵；添加方法为将尿素或碳酸氢铵与水按重量比1:10-20配成溶液，均匀泼洒稻壳堆中；

所述在稻壳堆中均匀泼洒玉米粉、发酵种子液与红糖的混合液的方法是将稻壳堆干重3%的玉米粉和2%的发酵种子液与红糖混合液混拌，均匀泼洒在稻壳堆中，所述发酵种子液与红糖的质量比为1:1；使稻壳堆体高度0.5-2m，占地面积＜40m²，盖上透气性覆盖物进行堆置发酵。

其中，所述步骤3）的翻堆是当发酵温度达到60-65℃并持续24-48h后，进行第1次翻堆，按照前述方法再翻堆4-8次，直到温度稳定在环境温度后，将发酵产物在40-60℃烘干，即得固态堆肥接种剂。

本发明还提供上述方法制备得到的堆肥接种剂。

本发明提供了厌氧芽孢杆菌UMT501菌株在污泥堆肥处理中的应用。具体的，将所述厌氧芽孢杆菌UMT501制备成堆肥接种剂，按干重量比5%~15%接种到堆肥中，提高堆肥的质量和发酵效率。

本发明从腐熟的污泥堆肥样品中分离筛选到一种能同时利用淀粉、蛋白质的广谱性温度生长菌株厌氧芽孢杆菌UMT501。将其制成堆肥接种剂用于污泥堆肥中，能促进有机物的降解，使堆体快速起温，迅速进入堆肥高温阶段（50℃）并维持较长的高温（50-70℃），促进污泥脱水和生物灭菌，加快污泥中有机物质的稳定和腐熟进程，提高堆肥的质量和发酵效率。因此，本发明的厌氧芽孢杆菌菌株UTM501具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于污泥堆肥中，可推广使用。

附图说明

图1为厌氧芽孢杆菌菌株UTM501在不同温度下对淀粉和蛋白质的降解效果。

图2为本发明制得的堆肥接种剂应用于污泥堆肥带来的堆肥温度变化。

图3为本发明制得的堆肥接种剂应用于污泥堆肥含水率的变化。

图4为本发明制得的堆肥接种剂在堆肥过程中有机物含量与发芽指数的变化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1厌氧芽孢杆菌UTM501的分离

（1）驯化

分别取采自大地绿源环保科技（北京）有限公司堆肥发酵车间的3个腐熟堆肥样品，每个样品5g，加入至50ml的无菌水中，在160rp的摇床上摇1小时，静置30分钟，无菌环境中吸取10ml上清液转接至90ml的已灭菌的细菌液体培养基中，在180rpm的水浴摇床中变温驯化培养：第1天30℃，第2天40℃，第3天50℃，第4天60℃，第5天70℃。一个驯化周期后，无菌吸取10ml的驯化菌液接种至新鲜的细菌培养基中进行第二个周期的驯化，如此，驯化至六个周期。

（2）初筛

分别吸取驯化后的菌液1ml，加入到9mL无菌水中，以梯度稀释法制成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7的稀释度，取0.1mL平板涂布，每个稀释度涂布于3个细菌培养基平板上。取1mL的无菌水做上述同样的操作，作为对照处理。在50℃下培养3天，选择菌落分散较好的平板（在一定的稀释度下的平板），挑取生长旺盛的单菌落，在细菌培养基上，反复划线分离纯化3次，再将形态一致的菌落制片，进行简单染色，在油镜下观察菌体形态，多视野下观察菌体细胞形态，确认菌体形态一致后，接种至细菌斜面培养至丰厚，在4℃下保存，备用。

（3）复筛

将初筛得到的单菌株在多温度（30℃，37℃，40℃，50℃，60℃，70℃）下进行有机物降解鉴定实验，最终筛选出一株在37℃~70℃下能同时有效降解蛋白质和淀粉的温度广谱性菌株UTM501。

实施例2厌氧芽孢杆菌UTM501鉴定

（1）UTM501的菌株特性

生化试验结果显示，UTM501菌株具有蛋白酶和α-淀粉酶活性，可降解蛋白质和淀粉。生长pH值范围为5.5~8.0，生长温度范围为37~70℃。UTM501在细菌培养基平板（牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，植物凝胶10g，蒸馏水1000ml，pH7.2）上的菌落特征是：形态为圆形，表面湿润，边缘整齐浅黄色，啮蚀状，扁平，生长迅速，60℃培养下24小时菌落直径约2mm。UTM501菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，形成内生孢子，接触酶反应阳性，V．P试验结果阳性，参考《伯杰士细菌鉴定手册》（第8版），初步判定UTM501为芽孢杆菌。

（2）16S rRNA序列分析

以UTM501的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA序列，引物为（27f）：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和（1492r）：5′-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3′。PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No.1所示。获得的16S rRNA基因序列通过EzTaxon数据库(http://www.eztaxon.org/)进行比对，结果显示相似性在97%以上的菌株均为厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus sp.）的菌株，把该菌株命名为UTM501，并于2012年3月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为Anoxybacillus mongoliensis，保藏号CGMCC No.5928。

实施例3不同温度下厌氧芽孢杆菌UTM501对有机物的降解特性

（1）种子液制备

将实施例2鉴定的菌株厌氧芽孢杆菌UTM501原始菌株在无菌环境中接种至细菌固体培养基上，在50℃下培活化养2天，然后在无菌环境中，用接种针挑取一环UTM501，接种至装有100ml已灭菌的细菌培养基中，在160rpm，55℃下振荡培养2天，得种子液。

（2）降解实验样品制备

分别取步骤（1）中种子液10ml接种至分别装有100ml淀粉发酵培养基和蛋白质发酵培养基的250ml三角瓶中，在160r/min水浴摇床中，分别于恒温37℃，40℃，50℃，60℃，70℃下培养3天后将培养液离心，上清液作为样品液，在4℃冰箱中保存。淀粉发酵培养基配方为：蛋白胨10g，氯化钠3g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000mL，pH7.2，121℃灭菌30分钟。蛋白质发酵培养基配方为：蛋白胨15g，酵母膏3g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.2，121℃灭菌30分钟。

（3）淀粉含量测定

取步骤（2）中的淀粉发酵培养基样品液10mL，放入三角瓶中，加入2%HCl 10mL，在沸水浴中沸腾3小时，用5moL/L NaOH中和，加入Ba(OH)₂3mL加入一滴酚酞指示剂，边搅拌边加入ZnSO₄溶液，直到红色褪去，过滤，稀释至250mL，吸取50mL测定葡萄糖的含量，粗淀粉含量=葡萄糖含量×0.9(葡萄糖含量用比色法测定)

（4）蛋白质含量的测定

取步骤（2）中的蛋白质发酵培养基样品液，置于1cm的石英比色皿中，于751型风光光度计波长280nm和260nm处，分别读取OD₂₈₀和OD₂₆₀，蛋白质含量（mg/mL）=1.55OD₂₈₀－0.76OD₂₆₀

不同温度下，UTM501菌株对淀粉和蛋白质的降解情况见图1。由图1可知，UTM501在培养温度37℃，40℃，50℃，60℃，70℃下均能有效降解淀粉和蛋白质，淀粉的降解率在60.8%~40.5%之间，蛋白质的降解率在63.5%~35.2%之间。

实施例4堆肥接种剂的制备（1）

（1）菌株活化培养：取本发明分离鉴定的厌氧芽孢杆菌UTM501原始菌株在无菌环境中接种至细菌固体培养基上，在50℃下培养5天，使菌种活化。

（2）发酵种子液制备：将步骤（1）中活化培养的菌种在无菌环境中，用接种针挑取一环UTM501，接种至装有100ml已灭菌的细菌培养基中，进行一级扩大培养，当培养液OD₆₀₀在0.6时停止培养，得一级种子；将一级种子按体积比10%接种至1L以上的摇瓶中进行二级扩大培养，当培养液OD₆₀₀在1.5时停止培养，得二级种子，此为最终发酵种子液。一级、二级扩培的条件均为：培养温度40℃，转速200r/min，发酵时间2天。

（3）堆肥接种剂制备：将稻壳用水浸泡8小时，水分含量为50%，然后取稻壳干重0.3%的尿素，并与水按重量比1:10配成溶液，均匀地泼洒在稻壳堆中，再经过12小时后，取稻壳干重3%的玉米粉与步骤（2）中的稻壳干重2%的（发酵种子液与等量红糖，质量比1:1）的混合液，再均匀地撒在稻壳堆内，最后堆积成高度0.5m，占地面积15平方米的堆体；立即盖上透气性覆盖物草席。当发酵温度达到60℃，并持续48小时后，进行第1次翻堆，此后，再翻堆4次，直到温度稳定在环境温度，发酵产物在40℃烘干获得堆肥接种剂。

实施例5堆肥接种剂的制备（2）

（1）菌株活化培养：取本发明分离鉴定的厌氧芽孢杆菌UTM501原始菌株在无菌环境中接种至细菌固体培养基上，在55℃下培养4天，使菌种活化。

（2）发酵种子液制备：将步骤（1）中活化培养的菌种在无菌环境中，用接种针挑取一环UTM501，接种至装有100ml已灭菌的细菌培养基中，进行一级扩大培养，当培养液OD₆₀₀在1.2之间时停止培养，得一级种子；将一级种子按体积比10%接种至1L以上的摇瓶中进行二级扩大培养，当培养液OD₆₀₀在2.2时停止培养，得二级种子，此为最终发酵种子液。一级、二级扩培的条件均为：培养温度50℃，转速160r/min，发酵时间7天。

（3）堆肥接种剂制备：将稻壳用水浸泡16小时，水分含量为55%，然后取稻壳干重0.4%的尿素，并与水按重量比1:20配成溶液，均匀地泼洒在稻壳堆中，再经过18小时后，取稻壳干重3%的米糠与步骤（2）中的稻壳干重2%的（发酵种子液与等量红糖，质量比1:1）的混合液，再均匀地撒在稻壳堆内，最后堆积成高度0.8m，占地面积20平方米的堆体；立即盖上透气性覆盖物草席。当发酵温度达到62℃，并持续30小时后，进行第1次翻堆，此后，再翻堆5次，直到温度稳定在环境温度，发酵产物在50℃烘干获得堆肥接种剂。

实施例6堆肥接种剂的制备（3）

（1）菌株活化培养：取本发明分离鉴定的厌氧芽孢杆菌UTM501原始菌株在无菌环境中接种至细菌固体培养基上，在60℃下培养2天，使菌种活化。

（2）发酵种子液制备：将步骤（1）中活化培养的菌种在无菌环境中，用接种针挑取一环UTM501，接种至装有100ml已灭菌的细菌培养基中，进行一级扩大培养，当培养液OD₆₀₀在1.8之间时停止培养，得一级种子；将一级种子按体积比10%接种至1L以上的摇瓶中进行二级扩大培养，当培养液OD₆₀₀在3.0之间时停止培养，得二级种子，此为最终发酵种子液。一级、二级扩培的条件均为：培养温度60℃，转速100r/min，发酵时间5天。

（3）堆肥接种剂制备：将稻壳用水浸泡24小时，水分含量为60%，然后取稻壳干重2%的碳酸氢铵，并与水按重量比1:15配成溶液，均匀地泼洒在稻壳堆中，再经过24小时后，取稻壳干重3%的麸皮与步骤（2）中的稻壳干重2%的（发酵种子液与等量红糖，质量比1:1）的混合液，再均匀地撒在稻壳堆内，最后堆积成高度2m，占地面积30平方米的堆体；立即盖上透气性覆盖物草席。当发酵温度达到65℃，并持续24小时后，进行第1次翻堆，此后，再翻堆8次，直到温度稳定在环境温度，发酵产物在60℃烘干获得堆肥接种剂。

实施例7堆肥接种剂的应用和效果

将实施例5中制备的堆肥接种剂按10%的接种量接种至以生污泥为主料的堆肥体系中，并以灭活的该堆肥接种剂为对照，以花生壳粉为辅料，调节碳氮比为25，含水率55%，进行堆肥，堆肥周期为30天，每隔5天翻堆，每天测定堆肥温度，当堆肥温度上升至65℃并持续24小时后进行翻堆。每隔5天取样测定含水率、发芽指数，对第30天的堆肥样品还检测其腐殖质、养分指标。检测结果如图2-4。

从图2可见，与灭活对照比，实施例5的堆肥接种剂接菌处理在第2天就超过了55℃，使堆肥高温期(大于50℃)提前；接菌处理的最高温度比灭活对照高6℃（接菌处理：68℃；灭活对照：62℃），接菌处理的高温期比灭活对照长4天（接菌处理：19天；灭活对照：15天）。说明本堆肥接种剂用于污泥堆肥中，能促进有机物的降解，使堆体快速起温，迅速进入堆肥高温阶段（50℃）并维持较长的高温（50-70℃），保证卫生无害化效果。

从图3可见，实施例5的堆肥接种剂接菌处理的含水量在污泥堆肥后一直低于灭活对照的，说明接菌（实施例5的堆肥接种剂）处理有利于污泥溶解，增加堆体水分的散失量，脱水减量化效果明显。

从图4可见，堆肥后，本发明堆肥接种剂接菌处理的有机物含量一直明显小于灭活对照的，接菌处理的发芽指数从第20天起，比灭活处理的高10%以上，说明接菌后加速了有机物的降解，明显促进污泥堆肥腐熟。

按照上述同样的方法，采用实施例4和6制备的固体堆肥接种剂进行堆肥应用，也获得了上述类似的试验结果。说明本发明提供的厌氧芽孢杆菌UTM501制得的堆肥接种剂能够使堆体快速起温，迅速进入高温阶段，并维持长时间高温，有利于有机物的快速降解和腐熟进程，提高了堆肥的质量和发酵效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.厌氧芽孢杆菌（Anoxybacillus mongoliensis）菌株UTM501，其保藏编号为CGMCC No.5928。

2.权利要求1所述的厌氧芽孢杆菌UTM501在污泥堆肥中的应用。

3.权利要求1所述的厌氧芽孢杆菌UTM501在制备堆肥接种剂中的应用。

4.含有权利要求1所述厌氧芽孢杆菌UTM501的堆肥接种剂。

5.一种制备权利要求4所述堆肥接种剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌种活化：取权利要求1所述厌氧芽孢杆菌菌株UTM501的菌种接种于培养基，在50-60℃条件下培养2-5d；

3）在含水量为50%-60%的稻壳堆中添加尿素或碳酸氢铵，12-24h后，再在稻壳堆中均匀泼洒玉米粉、米糠和/或麸皮、发酵种子液与红糖的混合液进行堆置发酵，期间翻堆，至温度稳定在环境温度时，停止发酵，将发酵产物干燥，制得堆肥接种剂；所述步骤3）的翻堆是当发酵温度达到60-65℃并持续24-48h后，进行第1次翻堆，按照前述方法再翻堆4-8次，直到温度稳定在环境温度后，将发酵产物在40-60℃下烘干，即得固态堆肥接种剂。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的一级扩大培养，当培养液OD₆₀₀在0.6~1.8之间时停止培养，得一级种子；所述的二级扩大培养为将一级种子按体积比10%接种至1L以上液体培养基中进行二级扩大培养，当培养液OD₆₀₀在1.5~3.0之间时停止培养，得二级种子，即为最终发酵种子液。