CN111394260B - 一种处理废水的微生物的分离及其应用 - Google Patents

一种处理废水的微生物的分离及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种处理废水的微生物的分离及其应用，属于微生物法处理废水领域。本发明分离得到的拟青霉YS‑2能够强酸环境，在工业生产所产生的强酸性废水中能够进行生长繁殖，并且其对叶酸废水中对环境有害的物质都能有一定的降解作用，能够使COD值下降88.88％，几乎完全去除氨氮，同时对于废水中的TDS也有很好的去除作用，去除率可达97.2％，此外还能降低叶酸废水中的酸度，使处理后的废水呈弱酸性。因此，本发明的拟青霉YS‑2能够适应工业化叶酸废水的恶劣环境，能够应用于工业化处理叶酸废水，并且有利于生态环境的可持续发展。

Description

一种处理废水的微生物的分离及其应用
技术领域
本发明涉及一种处理废水的微生物的分离及其应用，属于微生物法处理废水领域。
背景技术
叶酸是一种水溶性维生素，是米切尔(H.K.Mitchell，1941)从菠菜中提取纯化的，是人和动物生长发育的必要物质，也是机体细胞生长和繁殖所必须的氨基酸之一。叶酸广泛存在于植物的叶子中，纯品为深黄色或橙色结晶化物，无臭无味。目前，叶酸广泛应用于饲料、食品和医药等领域。在饲料方面，添加叶酸可以提高动物的免疫力，促进动物的生长。在医药食品方面，叶酸作为营养元素，具有保健、抗贫血、促进儿童智力发育以及抗尿酸浓度过高的功效。因此，合成叶酸广泛用于医疗、养殖、食品等行业，市场对合成叶酸的需求很大。目前，工业上合成叶酸采用的方法主要是用1,1,3-三氯丙酮与对氨基甲苯酰-L-谷氨酸反应，加入2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶，调节并维持pH至3.5，抽滤之后加以精制脱色即得叶酸。
叶酸生产过程中产生的废水呈黄色，废水组成复杂，主要含酸(盐酸或硫酸)、蝶啶类化合物、嘧啶、对氨基苯甲酰谷氨酸、氯化钠、三氯丙酮等化合物。属于有机物浓度较高、色度高、高盐度、难降解物质多的化工废水，若不经处理直接排放到环境中，会对环境产生巨大的影响。我国生产叶酸历史悠久，目前针对叶酸废水处理主要采用絮凝沉降法、化学氧化法、离子交换法和超滤膜过滤法等常规的物理化学法，然而上述工艺存在易产生二次污染、处理费用高等问题。采用传统生物法处理叶酸废水，有机物难以去除，处理时间长，处理效率低。叶酸废水问题一直未得到有效解决，不仅成为制约叶酸生产发展和应用的瓶颈，还会造成严重的环境污染。
发明内容
本发明提供了一株拟青霉(Paecilomyces sp.)，已于2020年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19610，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明提供了所述拟青霉YS-2的培养方法，所述方法是将拟青霉YS-2以体积比1～5％的接种量接种至培养基中，于200～300rpm、30～40℃恒温环境中培养10～24h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将拟青霉YS-2以体积比1～3％的接种量接种至培养基中，于200～300rpm、35～40℃恒温环境中培养12～24h。
本发明提供了一种降低叶酸废水中COD的方法，所述方法是将所述拟青霉YS-2接种至叶酸废水中进行处理，处理15～30h。
在本发明的一种实施方式中，叶酸废水接种拟青霉YS-2后处理时间为22～26h。
在本发明的一种实施方式中，所述拟青霉YS-2接种量为废水体积的2～6％，OD600为1～2。
在本发明的一种实施方式中，所述处理条件为：温度30～40℃，200～300r/min。
本发明提供了一种完全降解叶酸废水中氨氮的方法，所述方法是将所述拟青霉YS-2接种至叶酸废水中进行处理，处理15～30h。
在本发明的一种实施方式中，叶酸废水接种拟青霉YS-2后处理时间为22～26h。
在本发明的一种实施方式中，所述拟青霉YS-2接种量为废水体积的2～6％，OD600为1～2。
在本发明的一种实施方式中，所述处理条件为：温度35～40℃，200～300r/min。
本发明提供了一种降低叶酸废水中酸度的方法，所述方法是将所述拟青霉YS-2接种至叶酸废水中进行处理，处理15～30h。
在本发明的一种实施方式中，叶酸废水接种拟青霉YS-2后处理时间为22～26h。
在本发明的一种实施方式中，所述拟青霉YS-2接种量为废水体积的2～6％，OD600为1～2。
在本发明的一种实施方式中，所述处理条件为：温度35～40℃，200～300r/min。
本发明提供了一种降低叶酸废水中TDS的方法，所述方法是将所述拟青霉YS-2接种至叶酸废水中进行处理，处理15～30h。
在本发明的一种实施方式中，叶酸废水接种拟青霉YS-2后处理时间为22～26h。
在本发明的一种实施方式中，所述拟青霉YS-2接种量为废水体积的2～6％，OD600为1～2。
在本发明的一种实施方式中，处理条件为：温度35～40℃，200～300r/min。
本发明提供了一种所述拟青霉YS-2在处理强酸性废水中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述强酸性废水的pH≤3。
在本发明的一种实施方式中，所述强酸性废水的pH≤2。
本发明提供了一种含有所述拟青霉YS-2的污水处理剂。
在本发明的一种实施方式中，所述污水处理剂中含有质量百分数为50～90％拟青霉YS-2。
本发明保护所述污水处理剂，或所述拟青霉YS-2在污水处理中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为降低废水的COD。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为去除废水中的氨氮。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为降低废水中的苯胺含量。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为降低废水的酸度。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为降低废水中的盐度。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为降低废水TDS。
有益效果：本发明从叶酸废水中分离出拟青霉YS-2，该菌株能够强酸环境，在工业生产所产生的强酸性废水中能够进行生长繁殖，并且其对叶酸废水中对环境有害的物质都能有一定的降解作用，能够使COD值下降88.88％，几乎能完全去除废水中的氨氮，同时对于废水中的TDS也有很好的去除作用，去除率可达97.2％，此外还能降低叶酸废水中的酸度，使处理后的废水呈弱酸性。因此，本发明的拟青霉YS-2能够适应工业化叶酸废水的恶劣环境，能够应用于工业化处理叶酸废水，并且有利于生态环境的可持续发展。
生物材料保藏
一株拟青霉(Paecilomyces sp.)，已于2020年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19610，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为拟青霉YS-2菌落形态及细胞形态图。
图2为拟青霉YS-2菌株的rDNA电泳图；DL2000条带分布：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道2为本发明菌株的电泳条带。
具体实施方式
COD测定方法：按照GB11914-89《化学需氧量的测定》。
氨氮测定方法：参照HJ 535-2009《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》。
溶解性总固体(TDS)测定方法：参照GB/T 14415-2007《工业循环冷却水中溶解性固体的测定》中重量法测定水中溶解性总固体。
盐度测定方法：F-HZ-DZ-HS-0052《海水—盐度的测定—盐度计法》。
实施例1：菌株的筛选
酸性PDA固体培养基：马铃薯洗净皮，称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30 分钟，能被玻璃棒戳破即可)；用8层纱布过滤，加热，再加20g琼脂；继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再加水至1L，于121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。
酸性LB液体培养液：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸出膏5g/L，加入蒸馏水并加入盐酸调节至pH为1.5。
(1)将取回的叶酸废水进行降温和调整pH的预处理，将废水温度降至室温，将pH依次调整为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5。
(2)将pH调整为6.5的叶酸废水150mL装入500mL的锥形瓶中，加入终浓度为1g/L的葡萄糖，1.5g/L的K2HPO4，0.1g/L的CaCl2，0.1g/L的MgSO4，0.05g/L的FeSO4，加入 25mL取回的含活性污泥的泥水混合物，将锥形瓶放入摇床中，设定温度为37℃，摇床转速为140r/min。连续测定COD的数值，当COD的测定值不断降低并趋于稳定(本试验中COD 值降低并稳定在100mg/L)时，表示这一阶段驯化完成。
(3)将锥形瓶中的活性污泥取出，投加到pH为6的叶酸废水中，重复步骤(2)，直到锥形瓶中的叶酸废水的pH为2时，完成pH为2的活性污泥的驯化。
(4)从步骤(3)驯化后的活性污泥中蘸取5μL液体加入到灭过菌的LB液体培养基中。在37℃、140r/min下的摇床中培养24h后，用枪头吸取100μL液体，于PDA固体培养基上涂布。
(5)PDA固体培养基放在37℃的培养箱中培养1～2d，观察菌落的形态。在每个菌落上挑取少量菌种于pH为1.5的酸性LB液体培养基中，培养12～24h后接种于pH为1.5的酸性PDA固体培养基上。
(6)将步骤(5)重复多次，直至每个PDA固体培养基中都获得单一的菌种。
(7)从长出单一菌种的培养基中挑取单菌种接种至2mL pH为1.5的LB培养基，在37℃、140rpm培养12～14h至OD600为1.0；
(8)将步骤(7)中OD600为1的菌液以体积比3％的接种量接种至300mL酸性LB培养基(pH1.5)，在37℃、140rpm培养12～24h。
实施例2：菌株的鉴定
利用光学显微镜观菌株形态特征，结果如图1所示，该菌株菌体呈杆形，菌株在pH1.5的酸性PDA培养基上菌落呈乳白色、圆形、湿润、边缘完整且清晰，凸的，菌落不透明。
该菌菌属由上海美吉生物医药科技有限公司利用3730XL双向测序方法进行菌种鉴定。使用ITS通用引物扩增后，引物及扩增体系如下：将扩增得到的条带进行电泳检测。电泳图如图2所示，泳道2为菌株的电泳图。
(1)所用引物：
ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，
ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。
(2)PCR扩增反应体系：
Figure BDA0002473000690000041
Figure BDA0002473000690000051
(3)PCR反应条件：
Figure BDA0002473000690000052
实施例3：菌株的耐热性
(1)将筛选获得的拟青霉YS-2接种以体积比2％的接种量接种至10mL酸性LB培养基 (pH1.5)中37℃、220rpm下进行活化，将活化后的拟青霉YS-2接种至新鲜的酸性PDA培养基中，并使其在培养基中的OD600为0.1；
(2)分别在不同温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃静置培养24h；
(3)计算活菌数。
如表1所示该菌株的在35℃时相比而言具有较高的活菌数，因而其最适温度为35℃。
表1 拟青霉YS-2在不同温度下的活菌数(log CFU/mL)
Figure BDA0002473000690000053
实施例4：菌株在叶酸废水中的应用
(1)将筛选获得的拟青霉YS-2接种以体积比2％的接种量接种至10mL酸性LB培养基 (pH1.5)中37℃、220rpm下进行活化，当OD600达到0.6时，以废液体积的5％的接种量接种于300mL酸性LB液体培养基中37℃、220rpm培养14小时后，使OD600达到1.6。
(2)然后将菌液以体积比1％的接种量接种至pH约为1.5的叶酸废水中，在37℃、220 rpm处理叶酸废水，进行处理。
(3)①在不同时段测定污水中COD值，未经处理过的废水COD为800.0mg/L，经拟青霉YS-2处理后废水中的COD为89.0mg/L，较对照降低了88.88％。
由表2可知，该菌株在处理0～24h之间对于废水中还原性物质的降解速率很高，能够降解88.3％的还原性物质，在处理72h之后，COD值能够降低88.9％。
表2 处理不同时间废水中COD值
Figure BDA0002473000690000061
②在不同时段测定污水中氨氮值，未经处理过的废水氨氮含量为35.7mg/L，经拟青霉 YS-2处理后废水中未检出氨氮，表明该拟青霉YS-2对于叶酸废水中氨氮去除率为100％(表 3)。
表3 处理不同时间废水中氨氮含量(mg/L)
Figure BDA0002473000690000062
③在不同时段测定水中TDS值，未经过处理的为43200mg/L，经过处理的为1220mg/L， TDS降低了97.2％(表4)；
表4 处理不同时间废水中TDS值
Figure BDA0002473000690000063
④在不同时段测定废水pH值，结果显示pH为6.9，较处理前的pH为1.2的强酸性废水pH值升高(表5)；
表5 处理不同时间废水中pH
Figure BDA0002473000690000064
⑤在不同时段测定水中的盐度，未经处理的盐度为10000mg/L，经过处理后废水的盐度为5000mg/L(表6)；盐度主要是指污水中所含盐分物质的浓度。
表6 处理不同时间废水中盐度
Figure BDA0002473000690000065
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株拟青霉(Paecilomyces sp.)，已于2020年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.19610。
2.一种处理叶酸废水的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述拟青霉加入叶酸废水中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述拟青霉接种量为废水体积的1～5％，接种时的OD600为0.8～2。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在30～40℃下处理12～48h。
5.一种污水处理剂，其特征在于，含有权利要求1所述拟青霉，所述污水处理剂用于处理叶酸废水。
6.根据权利要求5所述污水处理剂，其特征在于，所述拟青霉在污水处理剂中的质量百分数为40％～95％。
7.一种处理强酸性叶酸废水的方法，其特征在于，将权利要求1所述拟青霉，或权利要求5或6所述污水处理剂加入叶酸废水中；所述强酸性叶酸废水的pH不高于3。
8.权利要求1所述拟青霉，或权利要求5或6所述污水处理剂在叶酸废水处理中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下(a)～(f)至少一种：
(a)降低废水的COD；
(b)去除废水中的氨氮；
(c)降低废水中的苯胺含量；
(d)降低废水的酸度；
(e)降低废水中的盐度；
(f)降低废水TDS。
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