CN110656057A

CN110656057A - 异养硝化-好氧反硝化的副球菌菌株、种子液及其制备方法和应用

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Publication number: CN110656057A
Application number: CN201810694638.8A
Authority: CN
Inventors: 孙巍; 夏春雨; 宋玉文; 洪维祎; 杨雅玲; 苏全榕; 阙才英; 魏清斯; 魏登枭; 林彩琴; 龚丽梅
Original assignee: Longyan University
Current assignee: Longyan University
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN110656057B

Abstract

本发明公开了一种异养硝化‑好氧反硝化的副球菌菌株，所述菌株为副球菌LJ2(Paracoccus versutus LJ2)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60338。本发明的副球菌LJ2，具有极高的耐受高浓度有机物的能力，在高有机负荷条件下也具有极佳的脱氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的能力；并且在极宽C/N比范围内仍具有稳定的脱氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的能力。因而副球菌LJ2可为高浓度有机物含氮废水生物脱氮处理提供种菌资源，具有巨大的应用价值。

Description

异养硝化-好氧反硝化的副球菌菌株、种子液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种异养硝化-好氧反硝化的副球菌菌株、种子液及其制备方法和应用。

背景技术

随着社会的不断发展，人们的生活水平也在不断提高，为了满足人们的需求，养殖业也在不断的壮大，但养殖业的快速发展和高密度的养殖模式，导致严重的环境污染。养殖废水是具有典型的“三高特征”，CODcr高达几千至几万mg·L^-1，NH₄ ⁺-N高达800～2200mg·L^-1，SS超标数十倍，是高氮、高有机物负荷污染废水。未经处理的养殖废水中富含大量无机氮，包括：硝酸盐、亚硝酸盐及铵盐3种物质，是排入水体中的主要污染源之一。

生物脱氮是在不同种类的微生物作用下，将有机氮和无机氮转化为氮气的过程。生物脱氮工艺具有成本低、操作简单、无二次污染和处理效果好等特点，广泛应用于养殖废水处理上。传统的生物脱氮工艺即自养硝化-厌氧反硝化工艺，一般过程包括氨化，硝化和反硝化3个过程，存在基建费用高、水力停留时间长、能耗大、抗冲击能力弱等不足。

异养硝化-好氧反硝化菌能利用有机碳作为碳源进行硝化作用，并且能在有氧条件下进行反硝化作用，现已广泛应用于废水处理的新型脱氮工艺过程中。近年来，越来越多的异养硝化-好氧反硝化菌被发现，主要包括泛养硫球菌(Thiosphaera pantoropha)、副球菌(Pseudomonas)、不动杆菌(Acinetobacter)等。这些细菌因具有生长快、活性高、增殖底物广泛、能同时进行异养硝化和好氧反硝化等优势，具有显著的工程应用价值。

目前，异养硝化菌在养殖废水中的实际脱氮能力达不到理论值，这可能是由于实际养殖废水的成分更加复杂，如废水有机物过高，抑制了异氧硝化菌中的酶活性，甚至导致菌株死亡，致使其脱氮能力下降。因此，筛选出具有良好脱氮性能且能适应高浓度有机物废水环境的异养硝化-好氧反硝化菌成为研究热点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能适应高浓度有机物废水环境的异养硝化-好氧反硝化副球菌。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种异养硝化-好氧反硝化的副球菌菌株，所述菌株为副球菌LJ2(Paracoccusversutus LJ2)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60338。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种副球菌种子液，所述副球菌种子液由上述的副球菌菌株经活化培养后制备得到。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种如上述的副球菌种子液的制备方法，包括以下步骤：

将副球菌菌株LJ2接种到LB培养基中培养至对数期，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水，得到副球菌种子液。

在其中一个实施例中，所述培养的过程为：在温度为25～35℃、转速为100～180rpm下振荡培养36～60h。

在其中一个实施例中，所述LB培养基的成分为：胰蛋白胨10g·L^-1，酵母浸膏5g·L^-1，NaCl 10g·L^-1，pH 7.0。

在其中一个实施例中，加无菌水至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的异养硝化-好氧反硝化的副球菌菌株在处理含氮废水中的应用。

在其中一个实施例中，所述含氮废水含NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述含氮废水中还含有碳源。

在其中一个实施例中，所述碳源为琥珀酸钠和乙酸钠中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明的副球菌LJ2(Paracoccus versutus LJ2)，具有极高的耐受高浓度有机物的能力，在高有机负荷条件下也具有极佳的脱氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的能力；并且在极宽C/N比范围内仍具有稳定的脱氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的能力。具体地，异养硝化过程中，以琥珀酸钠为碳源，在NH₄ ⁺-N浓度为50mg·L^-1，C/N高达150的废水中，副球菌LJ2的NH₄ ⁺-N去除率能达到95.69％；C/N在8～150的范围内，LJ2的NH₄ ⁺-N去除率均能达到85％以上。好氧反硝化过程中，在NO₃ ^--N浓度为50mg·L^-1，C/N高达120的废水中，副球菌LJ2的NO₃ ^--N的去除率将近100％，且TN去除率达91.25％；C/N在15～120的范围内，LJ2的NO₃ ^--N去除率均将近100％，TN去除率均将近90％。好氧亚硝化过程中，在NO₂ ^--N浓度为50mg·L^-1，C/N高达120的废水中，NO₂ ^--N的去除率将近100％，且TN去除率将近90％；C/N在15～120的范围内，LJ2的NO₂ ^--N去除率均将近100％，TN去除率均将近90％。

并且，该菌株还具有耐受高浓度氨氮、高浓度硝酸盐氮及高浓度亚硝酸盐氮的能力，该菌株耐受最大氨氮浓度为400mg·L^-1，耐受最大硝酸盐氮浓度为300mg·L^-1，耐受的最佳亚硝酸盐氮浓度为200mg·L^-1。

综上，副球菌LJ2可为高浓度有机物含氮废水生物脱氮处理提供种菌资源，具有巨大的应用价值。

副球菌LJ2(Paracoccus versutus LJ2)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC NO：60338，保藏时间为2018年3月21日。

附图说明

图1为本发明的副球菌LJ2的菌落形态图。

图2为本发明的副球菌LJ2的透射电镜图。

图3为本发明的副球菌LJ2的16S rDNA扩增电泳图。

图4为本发明的副球菌LJ2的系统进化树。

图5为本发明的副球菌LJ2的napA基因PCR扩增电泳图。

图6为本发明的副球菌LJ2的nosZ基因PCR扩增电泳图。

图7为本发明的副球菌LJ2的异养硝化性能变化规律曲线。

图8为本发明的副球菌LJ2的好氧反硝化性能变化规律曲线。

图9为本发明的副球菌LJ2的好氧亚硝化性能变化规律曲线。

图10为不同碳源对本发明的副球菌LJ2的异养硝化脱氮性能的影响曲线。

图11为不同C/N对本发明的副球菌LJ2的异养硝化脱氮性能的影响曲线。

图12为不同pH值对本发明的副球菌LJ2的异养硝化脱氮性能的影响曲线。

图13为不同温度对本发明的副球菌LJ2的异养硝化脱氮性能的影响曲线。

图14为不同接种量对本发明的副球菌LJ2的异养硝化脱氮性能的影响曲线。

图15为不同转速对本发明的副球菌LJ2的异养硝化脱氮的影响曲线。

图16为不同氨氮浓度对本发明的副球菌LJ2的异养硝化脱氮性能的影响曲线。

图17为不同C/N对本发明的副球菌LJ2的好氧反硝化性能的影响曲线。

图18为不同C/N对本发明的副球菌LJ2的好氧亚硝化性能的影响曲线。

图19为不同硝酸盐氮浓度对本发明的副球菌LJ2的好氧反硝化脱氮性能的影响曲线。

图20为不同亚硝酸盐氮浓度对本发明的副球菌LJ2的好氧亚硝化脱氮性能的影响曲线。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例中用到的培养基配方如下：

反硝化富集培养基(DM)(g·L^-1)：Na₂HPO₄·7H₂O 7.9，KH₂PO₄1.5，NH₄Cl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.1，(CH₂COONa)₂·6H₂O 4.7，KNO₃0.3，微量元素溶液2mL·L^-1。

DM初筛培养基(g·L^-1)：Na₂HPO₄·7H₂O 7.9¹，KH₂PO₄1.5，MgSO₄·7H₂O 0.1，(CH₂COONa)₂·6H₂O 4.7，KNO₃0.3，微量元素溶液2mL·L^-1

微量元素溶液(g·L^-1)：EDTA50，ZnSO₄2.2，CaCl₂5.5，MnCl₂·4H₂O 5.1，FeSO₄·7H₂O5.0，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1，CuSO₄·5H₂O 1.6，CoCI₂·6H₂O 1.6。

异养硝化培养基(g·L^-1)：(NH₄)₂SO₄0.24，(CH₂COONa)₂·6H₂O 2.25，维氏盐溶液50mL·L^-1。

好氧反硝化培养基(g·L^-1)：KNO₃0.36，(CH₂COONa)₂·6H₂O 2.25，维氏盐溶液50mL·L^-1。

好氧亚硝化培养基(g·L^-1)：NaNO₂0.25，(CH₂COONa)₂·6H₂O 2.25，维氏盐溶液50mL·L^-1。

维氏盐溶液(g·L^-1)：K₂HPO₄5.0，MgSO₄·7H₂O 2.5，NaCl 2.5，MnSO₄·4H₂O 0.05，FeSO₄·7H₂O 0.05。

LB液体培养基(g·L^-1)：胰蛋白胨10，酵母浸膏5，NaCl 10，pH值为7.0。

注：所有液体培养基均在121℃条件下灭菌20min后备用，固体培养基在以上液体培养基中添加1.5～2％琼脂。

实施例中用到的实验仪器如表1所示：

表1实验仪器

设备名称	型号	生产厂家
			生化培养箱	SHP-250型	上海森信实验仪器有限公司
紫外分光光度计	UV-1800	上海美谱达仪器有限公司
			清洁工作台	SW-CJ-1F	苏州安泰空气技术有限公司
立式自动高压灭菌锅	HVE-50	厦门柏嘉生物科技有限公司
			空气培养摇床	SPH-100B	SHIPINGOSCILLATOR
超微量分光光度计	MULTISKAN-GO	赛默飞世尔科技(中国)有限公司
			梯度PCR仪	MULTISKAN-GO	赛默飞世尔科技(中国)有限公司
大容量高速冷冻离心机	ST16R	赛默飞世尔科技(中国)有限公司
			双目显微镜	BA210	麦克奥迪实业集团有限公司

实施例中的水质检测分析项目及方法如表2所示：

表2水质检测分析的项目及方法

实施例：

一种本发明的异养硝化-好氧反硝化的副球菌菌株，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC)，保藏编号为GDMCC NO：60338。该副球菌GDMCC NO：60338被命名为副球菌LJ2(Paracoccus versutus LJ2)。

1)菌种分离筛选

上述本实施例的副球菌LJ2主要通过以下方法筛选得到：

将从福建省龙岩市龙津污水厂采集的活性污泥100mL活性污泥加入到200mL反硝化富集培养基中，培养基中加入无菌玻璃珠。30℃，150rpm·min^-1摇床震荡，连续培养5天，将以上细菌悬液以10％的接种量转接于新鲜的DM培养基中，以这种培养方式重复培养两次，得到富集的细菌悬液。

采用10倍稀释法，将0.2mL的富集细菌悬液涂布于DM琼脂培养基中(1.5％的琼脂)，于30℃培养。挑选具有明显不同特征的细菌菌落，进行平板划线，获得单菌落。纯化的菌落再重新接种于新鲜的琼脂培养基中。将分离出的菌株培养于KNO₃为唯一氮源的DM初筛培养基中进行初筛，将能存活于DM初筛培养基的菌株接种到LB斜面培养基中-4℃保存。然后，测定初筛菌株NH₄ ⁺-N以及NO₃ ^--N去除率，得到脱氮性能较好的菌株LJ2再进行研究。

2)菌种鉴定

上述本实施例的副球菌LJ2菌种鉴定过程及结果如下：

2.1)形态学鉴定

对微生物形态结构的观察采用肉眼观察法、光学显微镜观察法及投射电子显微镜观察法。

菌株LJ2在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态如图1所示：菌落为乳白色，边缘整齐，圆形微微隆起，表面光滑湿润，不透明。LJ-2革兰氏染色鉴定为革兰氏阴性菌。LJ2透射电镜图如图2所示：菌体呈短杆状，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，LJ2横直径约为0.49μm，长度约为1.07μm。

2.2)生理生化鉴定

细菌详细分类的典型做法是以生理生化试验的结果为基础的，本实验中菌株的生理生化特性参照文献及《伯杰明细菌鉴定手册》进行实验。

测定菌株LJ2进行生理生化特性，结果见表3：LJ2的糖发酵实验均为阴性，不产酸不产气；接触酶与氧化酶实验均为阳性，初步判断LJ2与副球菌(Paracoccus versutus)的生理生化特性相符：

表3菌株LJ2生理生化实验特性

实验名称	实验结果	实验名称	实验结果
				氧化酶	+	V.P	-
接触酶	+	油脂水解	+
				葡萄糖氧化发酵	-	乙酸氧化	-
乳糖氧化发酵	-	石蕊牛奶	产酸
				尿素水解	-	吲哚实验	+
淀粉水解	-	氨基酸脱羧酶	-
				甲基红	-	硝酸盐还原	-

注：表中“+”代表阳性，有此项反应；“-”代表阴性，无此项反应。在糖发酵实验中，“o+”表示产酸产气；“+”表示产酸不产气；“-”表示不产酸不产气。

2.3)分子生物学鉴定

本实验中菌株DNA按Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取细菌基因组DNA。

2.3.1)16S rRNA基因的扩增和测序

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。16S rRNA基因的相对分子量适中，序列分析的重现性极高，16S rRNA基因是细菌的系统分类研究中最常用的方法之一。现在普遍采用16S rRNA基因作为序列分析对象鉴定细菌的种属。本实验中采用通用引物27F和1492R对菌株的16S rRNA进行PCR扩增，纯化后进行测序。

16S rRNA基因的PCR反应体系见表4。

表4 16S rRNA基因的PCR反应体系

10×PCRbuffer	2.5μL
		dNTP	0.5μL
F	0.5μL
		R	0.5μL
Taq酶	0.25μL
		ddH<sub>2</sub>O	20.75μL
Total	25μL

16SrRNA基因PCR扩增结果如图3，片段长度1400bp左右，条带扩增位置正确。测序分析结果如图4所示：菌株LJ-2与副球菌(Paracoccus vereutus)的相似度为99％，因此判定LJ2为一株副球菌(Paracoccus versutus)，该菌株命名为Paracoccus versutus LJ2。

2.3.2)功能基因鉴定

好氧反硝化过程中，有氧条件下，周质硝酸还原酶基因(nap基因)会优先表达，NO₃ ^--N无需通过细胞膜就可以到达周质硝酸还原酶所在的活性区域，周质硝酸还原酶能够直接将NO₃ ^--N还原生成NO₂ ^--N；氧化亚氮还原酶(NOSZ)能够将NO₂ ^--N还原生成N₂，在细菌的反硝化过程中也起着关键作用。所以为了进一步验证菌株的好氧反硝化功能，本实验对菌株周质硝酸还原酶基因(napA，片段长度为800bp～900bp)和氧化亚氮还原酶基因(nosZ，片段长度约为300bp)进行PCR扩增，PCR所利用的引物对分别为nap1/nap2(nap1：5’-TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA-3’，nap2：5’-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3’)和nosZ-F/nosZ-R(nosZ-F：5’-CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3’，nosZ-R：5’-CGSACCTTSTTGCCSTYGCG-3’)。

16S rRNA、napA基因、nosZ基因的PCR反应程序见表4。

表4 16S rRNA、napA基因、nosZ基因的PCR反应程序

LJ2菌株基因扩增片段电泳结果如图5所示：得到片段大小为700bp～1000bp左右的特异条带，大小与预测片段大小相符，因此可初步判断，该菌含有napA基因，这表明菌株LJ2具有将NO₃ ^--N转化为NO₂ ^--N的功能。

利用引物nos1/nos2对LJ2菌株基因进行扩增，扩增片段电泳结果如图6所示：得到片段大小为250bp～500bp左右的特异条带，大小与预测大小相符。因此也可判断，该菌含有nosZ基因，这表明了菌株LJ2具有将NO₂ ^--N转化为N₂的功能。

本实施例的副球菌LJ2具有良好的异养硝化-好氧反硝化性能，而且具有耐高碳氮比的性能，可用于高C/N废水中的氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的脱氮处理。应用时，先将副球菌LJ2制成副球菌LJ2种子液，再进行废水脱氮处理，该副球菌LJ2种子液采用以下方式制得：

将菌株接入LB液体培养基中，于30℃的恒温摇床中培养48小时，再将LB培养基中的菌液倒入离心管中，4000rpm离心10min，收集菌体，菌体用无菌水清洗三遍，最后用无菌水调节OD₆₀₀至0.6～0.8的菌悬液，制成种子液。

应用实施例：

(1)异养硝化性能研究

将菌株的种子液以3％接入异养硝化培养基中，150rpm，30℃摇床培养，培养48小时，每隔6小时测定一次培养基NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N和COD含量及pH值和OD₆₀₀，并绘制以上指标的曲线变化图。

菌株LJ2以NH₄ ⁺-N为唯一氮源，培养48h的生长情况及异养硝化脱氮性能变化规律如图7所示：0～12h，生长曲线变化较大，为LJ2指数生长期；12h后，生长曲线趋于平缓，LJ2进入生长稳定期；42h，生长曲线达到顶峰，OD₆₀₀最大值0.28；48h，OD₆₀₀呈下降趋势，LJ2进入生长衰亡期。pH值是随培养时间呈逐渐递增趋势，从7.05提高到8.50，这说明菌株LJ2在生长过程中产碱。菌株LJ2在0～6h，NH₄ ⁺-N开始降解，NO₂ ^--N开始积累；12h，NH₄ ⁺-N去除率达到100％，NO₂ ^--N积累量约为2.25mg·L^-1；24h，NO₂ ^--N积累量达到2.87mg·L^-1；36h，NO₂ ^--N完全去除；42h，COD去除率达到最大90.42％；整个异养硝化过程中，均无NO₃ ^--N的积累。传统硝化反应的概念指出通过细菌的硝化作用NH₄ ⁺-N应该转变为NO₃ ^--N或NO₂ ^--N。本实验中，NO₃ ^--N无积累以及NO₂ ^--N少量积累后又被去除，可说明LJ2能够同时发生硝化和反硝化反应，硝化过程中产生的中间产物可作为反硝化过程的底物加以利用。

(2)好氧反硝化性能研究

将两份菌株LJ2的种子液以3％分别接入好氧反硝化培养基和好氧亚硝化培养基中，150rpm，30℃摇床培养，培养48小时，每隔6小时测定一次培养基NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N和COD含量及pH值和OD₆₀₀，并绘制以上指标的曲线变化图。

菌株LJ2以NO₃ ^--N为唯一氮源，培养48h的生长情况及好氧反硝化脱氮性能变化规律如图8所示：0～12h，生长曲线变化幅度较大，LJ2进入生长指数期；12h，生长曲线趋于平缓，LJ2进入生长稳定期；30h，OD₆₀₀达到最大0.329；36h，OD₆₀₀呈下降趋势，LJ2进入生长衰亡期。pH值是随培养时间呈逐渐递增趋势，从7.38提高到8.49，这说明菌株LJ2在生长过程中产碱。0～6h，NO₃ ^--N开始去除，无NH₄ ⁺-N的积累，有0.02mg·L^-1的NO₂ ^--N积累；18h，COD去除率最大达到83.04％；24h，NO₃ ^--N去除率最大为93.20％；30h，NH₄ ⁺-N积累量2.82mg·L^-1；48h，NO₃ ^--N的去除率下降至78.40％，NH₄ ⁺-N的积累量为0.77mg·L^-1，NO₂ ^--N的积累量为0.08mg·L^-1。以上结果表明：菌株LJ2可利用NO₃ ^--N生长及脱氮，LJ2进入生长衰亡期时，NO₃ ^--N去除率也随之下降，LJ2的好氧反硝化脱氮能力与菌株的生长密切相关。

菌株LJ2以NO₂ ^--N为唯一氮源，培养48h的生长情况及好氧亚硝化脱氮性能变化规律如图9所示：0～12h，OD₆₀₀值大幅上升，LJ2进入指数生长期；12h，OD₆₀₀值最大达到0.275；18～36h，生长曲线趋于平缓，OD₆₀₀值无大幅度变化，LJ2进入生长稳定期；42～48h，OD₆₀₀值下降，LJ2进入生长衰亡期。pH值随培养时间呈逐渐递增趋势，从7.92提高到8.78，这说明菌株LJ2在生长过程中产碱。0～6h，NO₂ ^--N开始去除，NO₃ ^--N积累量为0.28mg·L^-1，无NH₄ ⁺-N积累；12h，NO₃ ^--N和NH₄ ⁺-N均无积累，COD去除率最高为78.40％；24h，NO₃ ^--N积累量0.28mg·L^-1，NH₄ ⁺-N积累量1.79mg·L^-1；30h，NO₂ ^--N去除率最高达到64.81％，NH₄ ⁺-N的积累量最大达到4.10mg·L^-1；36h，NO₂ ^--N去除率下降为62.33％；42～48h，积累的NO₃ ^--N和NH₄ ⁺-N完全去除。

综上所述，菌株LJ2可利用NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N及NO₂ ^--N生长并具有脱氮性能，氮去除率分别可达到100％、93.20％及64.81％，说明LJ2具有异养硝化和好氧反硝化能力。

(3)LJ2异养硝化性能影响因素

(3.1)碳源对菌株异养硝化性能的影响

根据微生物对不同碳源的利用情况，可将微生物分为两大类，自养型微生物和异养型微生物。异养型是指微生物以环境中的有机物作为碳素营养的一种异养类型。异养硝化细菌的氨氮去除能力受碳源种类的影响。因此本实验研究了菌株对不同碳源的利用情况。

本实验选用琥珀酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、乙醇、葡萄糖、蔗糖等碳源作为实验组，碳酸氢钠与无碳作为对照组，考察所选碳源对菌株异养硝化性能的影响。对异养硝化培养基中的碳源进行等摩尔替换，其他成分不变，配制多种培养基。将种子液按3％的接种量分别接种于装有100mL不同碳源培养基的250mL锥形瓶内(每一种碳源做3个重复)。接种后的培养基置于150rpm、30℃的摇床中培养24小时后，测定不同培养基中的OD₆₀₀、NH₄ ⁺-N和TN含量。

碳源对LJ2异养硝化性能的影响如图10所示：菌株LJ2在无碳源培养基中，NH₄ ⁺-N去除率为0，生物量不增加，这说明LJ2的生长需要碳源；添加所选择的不同碳源的培养基中，菌株LJ2均能生长，但LJ2对不同碳源的利用情况不同，以碳酸氢钠为碳源时，LJ2的OD₆₀₀值为0.229，NH₄ ⁺-N的去除率为40.28％，TN去除率为30.34％，这说明LJ2可利用无机碳源生长，但脱氮性能较弱。以琥珀酸钠为碳源的培养基时，LJ2的OD₆₀₀值最大为0.34，LJ2对NH₄ ⁺-N和TN的去除率最大，分别达到98.50％和75.82％。因此，琥珀酸钠为LJ2异养硝化脱氮过程中的最佳碳源。

(3.2)碳氮比(C/N)对菌株异养硝化性能的影响

培养基中的碳氮比，会对微生物的生长和代谢产物的积累产生影响。本实验研究了不同碳氮比对菌株的生长和氨氮降解性能的影响。

本实验固定氮源硫酸铵的含量，以琥珀酸钠为碳源，通过调整碳源的含量来改变碳氮比。C/N设定为8、10、15、20、25、30、35、40、50、60、100和150，每组实验分别设置3个重复，异养硝化培养基其他成分与培养条件不变，150rpm，30℃摇床培养，培养24h后，测定不同培养基中的OD₆₀₀、NH₄ ⁺-N和TN含量。

C/N对LJ2异养硝化性能的影响如图11所示：C/N在8～150的范围内，LJ2的NH₄ ⁺-N去除率均能达到85％以上。其中C/N为35时，LJ2的OD₆₀₀最大达到0.953，NH₄ ⁺-N去除率为92.83％，TN去除率为80.87％。C/N增加到40时，OD₆₀₀下降到0.843，NH₄ ⁺-N去除率下降为91.03％，TN去除率也随之下降为78.35％，这说明随着C/N升高，LJ2的脱氮能力下降。但C/N再提高至60时，OD₆₀₀再次升高为0.904，NH₄ ⁺-N去除率可达到92.76％，TN去除率达到85.16％。在C/N为100、150时，OD₆₀₀分别降低到0.796、0.744，NH₄ ⁺-N去除率为96.43％、95.69％，TN去除率为78.26％、67.30％，综上所述，LJ2生长和脱氮适应的C/N范围较宽。

异养硝化-好氧反硝化菌通常是以有机物作为碳源和能源，但一般来说，过高的C/N会抑制菌株的生长和硝化反应。一般异养硝化-好氧反硝化菌脱氮的最适C/N为5-8，较少达到20以上。，而菌株LJ2适应的C/N范围更大，当NH₄ ⁺-N浓度为50mg·L^-1，C/N＝150时，NH₄ ⁺-N去除率仍可达到95.69％，这说明大量的碳源仍能使LJ2生长以及保持良好的脱氮性能，这说明LJ2在高有机负荷下也具有较强的NH₄ ⁺-N去除能力，所以LJ2能够更好的应用于高有机负荷废水的处理中。

(3.3)pH对菌株异养硝化性能的影响

溶液的酸碱性是菌体生长的重要因素之一。酸碱性通过菌体中酶的作用，而对菌体的生长性能及硝化性能产生影响。微生物可在一个较宽的pH范围内进行生长，但都有一个最适合的pH。因此，本实验研究了培养基中不同初始pH值对菌株的生长性能及氨氮降解能力的影响。

通过加入低浓度氢氧化钠或盐酸溶液，将培养基的初始pH值依次调整为6.5、7、7.5、8、8.5、9，每组实验分别设置3个重复，150rpm，30℃摇床培养，24小时后测定菌株的OD₆₀₀、NH₄ ⁺-N和TN含量。

pH对LJ2的异养硝化性能影响如图12所示：不同pH值对LJ2的NH₄ ⁺-N去除能力影响不大，但对TN的去除能力有较大影响。pH值6.5时，LJ2的OD₆₀₀为0.867，NH₄ ⁺-N去除率为94.77％，TN去除率只有74.84％，这可能是由于培养基中的NH₄ ⁺-N可能被转化为NO₂ ^--N或者是NO₃ ^--N；pH值为7～8的范围内，LJ2的OD₆₀₀值分别为0.869、0.863、0.85，NH₄ ⁺-N去除率分别为95.16％、92.24％、93.99％，TN去除率分别为92.02％、93.27％、90.60％。在pH值大于8之后，LJ2的TN去除率明显下降。因此，结合LJ2的生长情况、NH₄ ⁺-N去除率和TN去除率，培养基初始pH值7～8合适，7.5最佳。

(3.4)温度对菌株异养硝化性能的影响

温度是微生物重要的生存因子适宜的温度会使微生物的生长和代谢速率达到最大值。生物体内的酶在适宜温度条件下，活性最强，菌内的酶活越强，生长性能和氨氮降解能力也越强。本实验研究了不同培养温度条件对菌株的生长性能及氨氮降解能力的影响。

将种子液以3％的接种量接种于最佳碳源，硫酸铵为氮源，最佳碳氮比，培养基最佳初始pH值的改良异养硝化培养基中。接种后的培养基分别置于25℃、30℃、35℃、40℃，每组实验分别设置3个重复，150rpm的摇床中培养24小时后，测定菌株的OD₆₀₀、NH₄ ⁺-N和TN含量。

不同温度对LJ2异养硝化脱氮性能的影响如图13所示：培养温度25℃时，LJ2的OD₆₀₀为0.628，NH₄ ⁺-N去除率为99.51％，TN去除率为73.76％；温度30℃时，LJ2的OD₆₀₀为0.875，NH₄ ⁺-N去除率可达95.15％，TN去除率可达92.05％；温度高于30℃，TN去除率明显下降。综上所述，LJ2的生长和脱氮的最佳温度为30℃。

(3.5)接种量对菌株异养硝化性能的影响

接种量不足达不到脱氨氮的作用，适量的接种量对提高脱氮效果及实际应用有重要作用。而且在一定范围内，适当的增加菌株的接种量，可以缩短甚至能消除菌株生长的延滞期。因此，本实验研究了菌株接种量对于菌株的生长性能及氨氮降解能力的影响。

分别按接种量3％、5％、7％、10％、15％接种于改良的异养硝化培养基中。培养条件为150rpm、30℃，每组实验分别设置3个重复，培养24小时后，测定OD₆₀₀、NH₄ ⁺-N和TN含量。

接种量对LJ2异养硝化性能的影响如图14所示：接种量为3％、5％、7％、10％、15％时，LJ2的OD₆₀₀值分别为0.795、0.837、0.837、0.865、0.878，pH值分别为8.49、8.49、8.47、8.47、8.47，NH₄ ⁺-N去除率分别98％、98％、96％、96％，TN去除率分别为65％、64％、55％、61％、61％。以上结果表明：不同接种量对LJ2的异养硝化脱氮能力的影响不显著，即脱氮性能并没有随着接种量的提高而升高。接种量过大会使菌株过快的消耗培养基中的营养物质，使得生长周期变短，且从经济方面考虑，接种量高投入的成本也高。因此，LJ2异养硝化接种量可选择3％。

(3.6)溶解氧对菌株异养硝化性能的影响

不同的溶解氧浓度会对微生物的硝化作用产生显著的影响，甚至可控制硝化代谢产物。研究表明，转速的变化可以表征培养液中溶解氧的变化，因此可以通过调节摇床转速来控制培养基中的溶解氧浓度。本实验考察了转速对菌株生长性能及氨氮降解能力的影响。

按最佳接种量接种于改良的异养硝化培养基中。培养条件分别为0rpm、90rpm、150rpm、180rpm，30℃，每组实验分别设置3个重复，培养24小时后，测定OD₆₀₀、NH₄ ⁺-N和TN含量。

随着转速的增加溶解氧(DO)会增大，能够促进好氧菌株的生长。转速对LJ2异养硝化脱氮性能的影响结果如图15所示：在转速为0时，即静止培养，NH₄ ⁺-N和TN去除率分别为40.26％和32.23％，说明培养基中的通气量不足，溶解氧不足，抑制了菌株的生长和脱氮性能；转速为90rpm～150rpm内，随转速的增加，菌株LJ2的OD₆₀₀、NH₄ ⁺-N和TN去除率逐渐升高，其中150rpm时，NH₄ ⁺-N去除率达到100％，TN去除率达97.59％；当转速继续升高至180rpm时，菌株LJ2的OD₆₀₀和TN去除率分别下降为0.854和95.14％。因此，LJ2异养硝化脱氮的转速选择150rpm。说明随着转速提高，DO增大，能够促进LJ2的生长和脱氮性能，转速提高到一定程度，过量的DO反而会抑制LJ2的生长和脱氮性能。

(3.7)氮浓度对菌株异养硝化性能的影响

NH₄ ⁺-N作为氨氮氧化细菌生长过程中的唯一氮源，基质中的NH₄ ⁺-N的浓度对异养硝化细菌的生长至关重要。NH₄ ⁺-N浓度过低，不能满足菌株生长的需要，浓度过高，又会导致对细胞的生长产生毒害作用，同时会通过底物抑制硝化反应中关键酶的活性，从而影响异养硝化细菌的硝化活性。本实验研究了不同的底物浓度对菌株异养硝化性能的影响。

基于改良异养硝化培养基，固定C/N为60，将培养基初始的氮浓度分别设置为50mg·L^-1、100mg·L^-1、200mg·L^-1、300mg·L^-1、400mg·L^-1。按最佳接种量接入不同氮浓度培养基中，每组设置3个重复，置于150rpm，30℃，培养7天，每天测定OD₆₀₀，NH₄ ⁺-N和TN含量。

不同NH₄ ⁺-N浓度对LJ2异养硝化脱氮性能的影响结果如图16所示：经过7天培养，当初始NH₄ ⁺-N浓度为50mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N去除率达到100％，OD₆₀₀为1.011；当初始NH₄ ⁺-N浓度为100mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N去除率也达到了100％，菌体生长良好，OD₆₀₀为1.065；但NH₄ ⁺-N浓度高于100mg·L^-1后，随着初始NH₄ ⁺-N浓度的提高，菌株LJ2的NH₄ ⁺-N去除率随之下降，当初始NH₄ ⁺-N浓度为200mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N的降解能力下降为93.76％，但菌体生长情况最优，OD₆₀₀值达到1.2；当初始NH₄ ⁺-N浓度为300mg·L^-1时，LJ2的OD₆₀₀值仅为0.384，但NH₄ ⁺-N去除率无明显下降；当初始NH₄ ⁺-N浓度为400mg·L^-1时，OD₆₀₀值降低至0.246，NH₄ ⁺-N去除率降低至11.02％。这说明随着NH₄ ⁺-N浓度的提高，菌株LJ2生长和脱氮性能受到抑制。LJ2在不同NH₄ ⁺-N浓度培养7天之后，均无NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的积累，说明LJ2具有较好的反硝化性能。

颜薇芝等分离的不动杆菌Acinetobacter.spYN3，随着初始NH₄ ⁺-N浓度的提高，NH₄ ⁺-N的去除能力越低，初始NH₄ ⁺-N浓度为200mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N去除率仅为2％；恶臭假单胞菌Pseudomonasputida LY1在初始NH₄ ⁺-N浓度为50mg·L^-1，NH₄ ⁺-N去除率最高达到64％，随着NH₄ ⁺-N浓度的升高，NH₄ ⁺-N去除率逐渐下降；一株耐受高浓度氨氮的贪铜菌Cupriavidussp.S1在初始NH₄ ⁺-N浓度高达200mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N去除率为94.98％。与上述菌株NH₄ ⁺-N浓度耐受性相比，LJ2可耐受NH₄ ⁺-N浓度达400mg·L^-1，且初始NH₄ ⁺-N浓度300mg·L^-1时，仍NH₄ ⁺-N去除率仍可达90％以上，说明LJ2具有较好的氨氮耐受能力。

据报道，某些种属的异养硝化-好氧反硝化菌能耐受更高浓度的NH₄ ⁺-N，但其NH₄ ⁺-N去除率较低，且所能耐受有机物浓度低于LJ2。例如：具有耐受高NH₄ ⁺-N能力的Acinetobacter sp.Y1当C/N＝14，NH₄ ⁺-N浓度为1600mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N去除率仅为21.3％；不动杆菌Acinetobacter SQ2在C/N＝12，NH₄ ⁺-N浓度为1400mg·L^-1时，OD₆₀₀值可达2.635，NH₄ ⁺-N去除率仅为38.6％。上述的这两株耐受高NH₄ ⁺-N浓度的菌株均需要较低C/N条件下，即有机物浓度相对较低情况下，表现较低的NH₄ ⁺-N去除率。与其相比，LJ2耐受的C/N高达60～150，是Y1和SQ2的四十倍左右。因此，LJ2在高负荷有机物的条件下，仍具有良好的NH₄ ⁺-N耐受能力和脱氮效果，其在高浓度有机物含氮废水处理中具有潜在的应用价值。

(4)好氧反硝化性能影响因素

(4.1)碳氮比(C/N)对菌株好氧反硝化性能的影响

好氧反硝化过程中，细菌利用有机碳作为电子供体，NO₃ ^--N和O₂作为电子受体，协同呼吸将NO₃ ^--N还原为N₂或N₂O等产物。C/N是影响好氧反硝化细菌在呼吸过程中获得高效脱氮效率的重要因素。

研究菌株好氧反硝化和好氧亚硝化性能，分别采用好氧反硝化和好氧亚硝化培养基，NO₃ ^--N或NO₂ ^--N浓度均固定为50mg·L^-1，调整碳浓度，使得C/N分别为8、15、30、60、120。将菌株种子液按3％接种量接入到不同C/N培养基中，置于150rpm，30℃摇床培养，24小时后测定OD₆₀₀，NO₃ ^--N、NO₂ ^--N和TN含量。

C/N也是影响反硝化脱氮的重要因素之一。C/N过低，会导致碳源不足，影响菌株的生长；当C/N过高时，过量的碳源不会被微生物利用，而且过高的C/N会抑制菌株的生长和硝化反应。C/N对LJ2好氧反硝化脱氮性能的影响结果如图17所示：在C/N为60时，LJ2的OD₆₀₀值最大为0.818；当C/N为15、30、60时，NO₃ ^--N及TN去除率均达到100％；当C/N升高到120时，TN去除率下降到91.25％。因此，C/N为60时，LJ2生长情况和好氧反硝化脱氮性能最佳，这与LJ-2的异养硝化最佳C/N一致。

C/N对好氧亚硝化脱氮性能的影响结果如图18所示：当C/N从15增加到30时，NO₂ ^--N去除率从100％降低到95.08％，TN去除率从93.38％升高到100％；而C/N为60时，NO₂ ^--N为99.87％，TN去除率为98.54％；当C/N升高到120时，TN去除率降低到88.91％。因此，C/N为60时，LJ-2的好氧亚硝化性能最佳，这与LJ2的异养硝化和好氧反硝化最优C/N一致。

一般好氧反硝化菌脱氮的最适C/N为5-8，较少达到20以上。与大部分好氧反硝化菌相比，菌株LJ2具有耐受较高C/N的能力，可为处理高C/N有机污染的提供新的菌种资源。

(4.2)NO₃ ^--N浓度对好氧反硝化性能的影响

采用好氧反硝化培养基，C/N固定，将培养基初始NO₃ ^--N调至50mg·L^-1、100mg·L^-1、150mg·L^-1、200mg·L^-1、250mg·L^-1、300mg·L^-1。将菌株种子液按3％接种量接入到不同氮浓度培养基中，置于150rpm，30℃摇床培养，培养24小时后，测定OD₆₀₀，NO₃ ^--N、NO₂ ^--N和TN含量。

不同NO₃ ^--N浓度对LJ2好氧反硝化脱氮性能的影响结果如图19所示：当NO₃ ^--N浓度100mg·L^-1时，LJ2的OD₆₀₀为1.083，NO₃ ^--N及TN去除率最高，分别为99.76％和81.07％；随着NO₃ ^--N浓度的升高，NO₃ ^--N及TN去除率降低；在NO₃ ^--N浓度为200mg·L^-1时，NO₃ ^--N去除率为70.84％；在NO₃ ^--N浓度提高至300mg·L^-1时，NO₃ ^--N去除率为7.83％，LJ2仍具有脱氮能力。

宋宇杰分离的一株能适应高浓度NO₃ ^--N的不动杆菌Acinetobactersp.Y1，当初始NO₃ ^--N浓度为50mg·L^-1，NO₃ ^--N去除率为100％；当NO₃ ^--N浓度为100mg·L^-1，NO₃ ^--N去除率为84.4％；当NO₃ ^--N浓度为200mg·L^-1，NO₃ ^--N去除率为65.3％。与Y1相比，LJ2在初始NO₃ ^--N为200mg·L^-1时，NO₃ ^--N去除率更高，LJ2比Y1更加适应高浓度NO₃ ^--N。有研究表明，某些好氧反硝化菌对NO₃-N的耐受高于LJ2，但其能耐受的C/N范围远远小于LJ2，例如：假单胞菌Pseudomonas stutzeristrain AD-2在硝态氮浓度为100～1000mg·L^-1的范围内，NO₃ ^--N去除率可达99％，且无NO₂ ^--N的积累，但AD-2所能耐受的C/N仅为7，远小于LJ2的C/N 60。综上所述，在高浓度有机物的条件下，LJ2具有良好的NO₃ ^--N耐受能力和脱氮效果，优于目前报道的好氧反硝化菌株。

(4.3)NO₂ ^--N浓度对好氧反硝化性能的影响

采用好氧亚硝化培养基，C/N固定，将培养基NO₂ ^--N浓度调至50mg·L^-1、100mg·L^-1、150mg·L^-1、200mg·L^-1、250mg·L^-1、300mg·L^-1。将菌株种子液按3％接种量接入到不同氮浓度培养基中，置于150rpm，30℃摇床培养，培养24小时后，测定OD₆₀₀，NO₂ ^--N、NO₃ ^--N和TN含量。

不同NO₂ ^--N浓度对LJ2好氧亚硝化脱氮性能的影响如图20所示：NO₂ ^--N浓度50mg·L^-1时，OD₆₀₀为0.796，NO₂ ^--N及TN去除率最高，分别为100％与76.04％；随着NO₂ ^--N浓度的提高，NO₂ ^--N及TN去除率降低，当NO₂ ^--N浓度提高到100mg·L^-1时，NO₂ ^--N去除率为68.93％；NO₂ ^--N浓度为200mg·L^-1时，LJ2仍能生长，NO2--N去除率仍有9.06％，

芽孢杆菌Bacillus coagulans YX-6当初始NO₂ ^--N浓度为20mg·L^-1时，NO₂ ^--N去除率接近100％，当NO₂ ^--N浓度提高到100mg·L^-1，NO₂ ^--N去除率仅为20％。因此，LJ2比YX-6耐受更高浓度的NO₂ ^--N。据报道，当亚硝态氮浓度为50mg·L^-1、100mg·L^-1、200mg·L^-1时，Acinetobacter sp.Y1均能够生长，且NO₂ ^--N的去除率均可达到60％以上，但Y1所能耐受的C/N为14，远低于LJ2的最佳C/N 60。因此，高浓度有机物的条件下，LJ2具有良好的NO₂ ^--N耐受能力和脱氮效果，优于目前报道的大部分好氧反硝化菌株。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims

1.一种异养硝化-好氧反硝化的副球菌菌株，其特征在于，所述菌株为副球菌LJ2(Paracoccus versutus LJ2)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60338。

2.一种副球菌种子液，所述副球菌种子液由权利要求1所述的副球菌菌株经活化培养后制备得到。

3.一种如权利要求2所述的副球菌种子液的制备方法，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的副球菌种子液的制备方法，其特征在于，所述培养的过程为：在温度为25～35℃、转速为100～180rpm下振荡培养36～60h。

5.根据权利要求3所述的副球菌种子液的制备方法，其特征在于，所述LB培养基的成分为：胰蛋白胨10g·L^-1，酵母浸膏5g·L^-1，NaCl 10g·L^-1，pH 7.0。

6.根据权利要求3所述的副球菌种子液的制备方法，其特征在于，加无菌水至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8。

7.一种如权利要求1所述的异养硝化-好氧反硝化的副球菌菌株在处理含氮废水中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述含氮废水含NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含氮废水中还含有碳源。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述碳源为琥珀酸钠和乙酸钠中的一种或多种。