CN111534448B - 一种异养硝化-好氧反硝化假单胞菌及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种异养硝化‑好氧反硝化假单胞菌，所述菌株为假单胞菌YG5(Pseudomonas sihuiensis YG5)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年12月25日，保藏编号为GDMCC No：60533。该菌株耐受高浓度的NH₄ ⁺‑N、NO₃ ^‑‑N和NO₃ ^‑‑N，且在高浓度范围内对NH₄ ⁺‑N、NO₃ ^‑‑N和NO₃ ^‑‑N脱除率高，表明菌株YG5具有处理高浓度NH₄ ⁺‑N、NO₃ ^‑‑N，NO₃ ^‑‑N废水的潜能。

Description

一种异养硝化-好氧反硝化假单胞菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种异养硝化-好氧反硝化假单胞菌及其培养方法和应用。

背景技术

随着经济的快速发展，人们对自然环境的过度开发以及工农业的快速发展，造成了自然水体的严重污染，其中氮是水体的主要污染物，其主要以四种形态存在，分别为有机氮、氨氮、亚硝酸氮和硝酸盐氮。水体中氨氮浓度过高会造成水体富营养化；硝酸盐氮浓度超标，会引发人类高血压、高铁血红蛋白等疾病；硝酸盐在体内能够转化为亚硝酸盐，容易诱发各种疾病甚至致癌。因此，解决水体中氮素污染问题以及对氮素处理的研究成为目前污水处理领域的热点之一。

目前，我国污水脱氮处理技术主要包括物理化学法和生物法。物理化学法通常只能除去水中特定形式的氮，其反应简单易控制，基建投资小，但是工艺复杂，成本高，对环境易产生二次污染，且吸附与过滤材料再生困难，适合规模较小的污水处理厂。生物脱氮以其安全，高效，经济，可持续等特点被认为是去除水体中氮元素最具有发展前景的方法。传统生物脱氮途径一般包括硝化和反硝化两个阶段，由于硝化和反硝化过程中微生物生长缓慢，且因过程所需条件的不同导致硝化作用和反硝化作用不能同时在同一反应器中进行，在实际污水处理过程中的脱氮效率低，大大增加了污水处理过程的难度。

随着国内外技术的不断进步，生物脱氮技术发生了质的提高，各种新技术应运而生，包括厌氧氨氮化技术，短程硝化反硝化技术、同步硝化反硝化技术等等。其中同步硝化反硝化技术因具有反应容器小、反应系统pH稳定、系统反应时间短、投资和运行成本低等优势成为现生物脱氮领域的热门研究对象。同步硝化反硝化技术的关键微生物为HN-AD菌，其分离纯化及脱氮性能研究成为目前研究热点与重点，现已发现Pseudomonas sp、Acinetobacter sp、Bacillus sp、Arthrobacter sp、Zobellella sp、Alcaligenes sp、Vibrio sp等多种具有HN-AD功能的菌属。

尽管HN-AD菌的研究很多，其在污水治理领域扮演越来越重要的角色，但仍面临着一些问题，例如HN-AD菌适应的氮浓度范围较窄、耐受的氮素负荷较低、低C/N比条件下脱氮性能较差等问题。因此，仍有必要进行HN-AD菌的筛选，寻找在实际应用中适应性能更强的优势脱氮菌株。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种耐受NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N，且对高浓度的NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的脱除率均比较高的异养硝化-好氧反硝化假单胞菌，还相应提供该假单胞菌的培养方法，以及在处理含氮废水中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种异养硝化-好氧反硝化假单胞菌，所述假单胞菌菌株为假单胞菌YG5(Pseudomonas sihuiensis YG5)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年12月25日，保藏编号为GDMCC No：60533。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的假单胞菌的培养方法，包括如下步骤：

将假单胞菌YG5接种于LB培养基中培养至指数生长期，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水制成OD₆₀₀为0.6～0.8的菌悬液。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的异养硝化-好氧反硝化假单胞菌在处理含氮废水中的应用。

上述的应用，优选的，假单胞菌YG5以有机酸为碳源、NH₄ ⁺为氮源进行异养硝化脱氮。

上述的应用，优选的，所述含氮有机废水的pH值为7～9，温度为30～35℃，C/N比为10～30，NH₄ ⁺-N浓度为100～500mg·L^-1。

上述的应用，优选的，假单胞菌YG5以有机酸为碳源、NO₃ ^-为氮源进行好氧反硝化脱氮。

上述的应用，优选的，所述含氮有机废水的pH值为7～9，温度为30～35℃，C/N比为15～80，NO₃ ^--N浓度为100～800mg·L^-1。

上述的应用，优选的，假单胞菌YG5以有机酸为碳源、NO₂ ^-为氮源进行好氧亚硝化脱氮。

上述的应用，优选的，所述含氮有机废水的pH值为7～9，温度为30～35℃，C/N比为15～80，NO₂ ^--N浓度为100～300mg·L^-1。

上述的应用，优选的，所述有机酸为琥珀酸钠和/或柠檬酸钠。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、菌株YG5异养硝化脱氮率高，当NH₄ ⁺-N浓度为100～500mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N，TN脱除率达97.00％以上，无论是高氮负荷还是低氮负荷NO₃ ^--N和NO₂ ^--N都无明显积累；且菌株YG5可耐受NH₄ ⁺-N最高浓度可达2000mg·L^-1。表明菌株YG5具有处理高浓度NH₄ ⁺-N废水的潜能。

2、菌株YG5好氧反硝化与好氧亚硝化C/N高，并且范围广，C/N为15～80时，以上两种反硝化过程中NO₃ ^--N与NO₂ ^--N的脱除率都分别达到90.00％以上。当NO₃ ^--N浓度为100～800mg·L^-1时，NO₃ ^--N脱除率达到96.00％以上；当NO₂ ^--N浓度为100～300mg·L^-1时，菌株YG5对NO₂ ^--N脱除率均为100.00％；且菌株YG5能耐受的NO₃ ^--N和NO₂ ^--N最高浓度分别为1500mg·L^-1和1000mg·L^-1，表明菌株YG5具有处理高浓度NO₃ ^--N，NO₃ ^--N废水的潜能。

3、YG5氮平衡结果表明：相对于异养硝化过程，菌株YG5好氧反硝化过程中对TN去除能力更强。菌株YG5异养硝化与好氧反硝化作用转化气态氮的能力都强于其细胞同化作用转化为胞内氮，这表明菌株YG5具有很强的脱氮能力。

假单胞菌YG5(Pseudomonas sihuiensis YG5)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏时间为2018年12月25日，保藏编号为GDMCC No：60533。

附图说明

图1为菌株YG5的菌落形态图。

图2为菌株YG5的透射电镜图。

图3为菌株YG5的16S rRNA与napA基因PCR电泳图。

图4为菌株YG5 16s rRNA系统发育树图。

图5为菌株YG5 napA基因系统发育树图。

图6为菌株YG5好氧反硝化性能变化情况图。

图7为菌株YG5好氧亚硝化性能变化情况图。

图8为碳源对菌株YG5生长及异养硝化性能的影响图。

图9为C/N对菌株YG5生长及异养硝化性能的影响图。

图10为各交互项影响NH₄ ⁺-N去除率的等高线图和响应面图，其中，上两幅图中的左图为pH与装量对菌株YG5 NH₄ ⁺-N脱除率的相互影响的等高线图，上两幅图中的右图为pH与装量对菌株YG5 NH₄ ⁺-N脱除率的相互影响的响应面图；中间两幅图中的左图为pH和温度对菌株YG5 NH₄ ⁺-N脱除率的相互影响的等高线图，中间两幅图的右图为pH和温度对菌株YG5NH₄ ⁺-N脱除率的相互影响的响应面图；下两幅图中的左图为装量和温度对菌株YG5 NH₄ ⁺-N脱除率的相互影响的等高线图，下两幅图中的右图为装量和温度对菌株YG5 NH₄ ⁺-N脱除率的相互影响的响应面图。

图11为NH₄ ⁺-N浓度对YG5异养硝化脱氮性能的影响图。

图12为C/N对菌株YG5生长及好氧反硝化性能的影响图。

图13为NO₃ ^--N浓度对YG5好氧反硝化脱氮性能的影响图。

图14为C/N对菌株YG5生长及好氧亚硝化性能的影响图。

图15为NO₂ ^--N浓度对菌株YG5好氧亚硝化脱氮性能的影响图。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

菌株来源：以福建省龙岩市龙津污水厂采集的活性污泥为菌株来源。通过富集、分离纯化、初筛和复筛，选取具有HN-AD性能的YG5为目的菌株。YG5采用了斜面保藏和低温冷冻保藏法保存菌种。短期内工作用菌种保藏在4℃牛肉膏蛋白胨斜面，长期使用-80℃甘油悬液低温冷冻保藏。

实验培养基：实验过程所用培养基配方如表1所示：

表1实验培养基及配方

(注：将琼脂加入在上述的培养基中以形成固体培养基，琼脂的量以1.5～2％为宜，并将在培养基在121℃、灭菌20min。本实验过程中装量为100mL的各式培养基均装于250mL三角瓶中；装量为200mL的各式培养基均装于500mL三角瓶中。)

实验过程所用主要仪器与设备，罗列至表2：

表2仪器设备表

菌株的鉴定

菌株形态与生理生化鉴定：筛选后的菌株划线到牛肉膏蛋白胨平板中培养，并在24小时后进行观察，观察内容包括菌落形态，革兰氏染色以及经过透射电镜观察的菌体形态。

形态学鉴定结果：菌株YG5菌落形态如图1所示：菌株YG5为圆形小菌落，呈乳白色半透明状，表面光滑湿润，黏稠不易挑取。革兰氏染色结果表明菌株YG5为革兰氏阴性。菌株YG5透射电镜结果如图2所示：菌株YG5属于短杆菌，有鞭毛，无荚膜，无芽孢。

生理生化鉴定结果：测定菌株YG5的生理生化特性，结果见表3：乳糖氧化发酵、尿素水解、甲基红、V.P反应、硝酸盐还原、绿脓菌素、吲哚实验、石蕊牛奶、乙酸氧化、明胶液化实验为阴性。氧化酶、接触酶、葡萄糖氧化发酵、淀粉水解、油脂水解、柠檬酸盐、果胶水解实验为阳性，说明菌株YG5具有氧化酶、接触酶、淀粉酶、脂肪酶、水解酶活性和分解葡萄糖产生有机酸和气体，能够利用柠檬酸钠为C源产生碳酸盐的能力。初步判断YG5与假单胞菌的生理生化特性相符。

表3 YG5菌株的生化特性

注：表中“+”代表阳性，有此项反应；“－”代表阴性，无此项反应。

分子生物学鉴定：菌株生理生化试验根据相关手册来进行。使用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒对细菌DNA进行提取，其提取方法严格按照试剂盒标准步骤进行，提取出来的DNA用细菌的通用引物扩增。PCR引物及其序列如表4，反应体系如表5，反应所需条件如表6。PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，在220V下进行30min的电泳，凝胶成像系统成像拍照，确定扩增条带后送至苏州金唯智公司进行序列的测定。

表4 PCR扩增引物

表5 PCR反应体系

反应体系	体积(μL)
		10×PCR buffer	2.5
dNTP	0.5
		F	0.5
R	0.5
		Taq酶	0.25
ddH<sub>2</sub>O	20.75
		Total	25

表6 16S rRNA、napA基因的PCR反应程序

分子生物学鉴定结果：菌株YG5 16S rRNA和napA基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳成像，结果见图3所示：从中可以明显的看出其PCR产物的条带亮度更高，其中没有蕴含杂质，条带位置分别在1000～2000、750～1000bp之间，说明得到了16S rRNA与napA基因目标产物。对其产物纯化，测序处理，分析其结果的同源性，这里使用的分析方法是BLAST程序，利用MEGA7绘制系统发育树。结果如图4、5所示：菌株YG5的16S rRNA基因序列与Pseudomonas sihuiensis KCTC 32246序列的相似性达99.57％；napA基因与Pseudomonassihuiensis KCTC 32246的序列相似度最高达99.67％。综合菌株YG5的形态学特征和生理生化特性将其命名为Pseudomonas sihuiensis YG5，以下简称为YG5。

水质测定方法：NH₄ ⁺-N，NO₃ ^--N，NO₂ ^--N，TN，COD等实验常规分析指标，根据《水和废水监测分析方法》进行检测。OD₆₀₀与pH分别使用超微量分光光度计，pH计测定。具体方法见表7：

表7水质常规指标的检测项目与方法

编号	指标	方法
			1	生物量(OD<sub>600</sub>)	采用超微量分光光度法在600nm出测定
2	pH	玻璃电极法
			3	氨氮(NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N)	纳式试剂分光光度法
4	硝酸盐氮(NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N)	麝香草酚分光光度法
			5	亚硝酸盐氮(NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N)	N-(1-萘基)-乙二胺光度法
6	总氮(TN)	碱性过硫酸钾消解分光光度法
			7	化学需氧量(COD)	COD仪器消解法

菌株YG5硝化性能研究

制备种子液：将菌株YG5接入LB液体培养基，于30℃恒温摇床培养至指数生长期。菌悬液4000r·min^-1离心10min，用无菌水清洗3次，随后用无菌水调节菌浓度OD₆₀₀值为0.60～0.80，制得种子液。

硝化性能研究：为了研究菌株YG5对不同氮源的脱除规律，初始氮浓度为100mg·L^-1，以柠檬酸钠为C源，C/N＝10，3％接种量，将YG5接入装量为200mL的不同培养基中培养，每6h取样测定。氮源、培养基、培养条件及测定指标等如表8所示：

表8菌株YG5硝化性能研究

异养硝化性能结果：异养硝化培养体系中，以NH₄ ⁺-N为氮源，0～12h，菌株的生物量增长迅速，OD₆₀₀从0.05增长至0.43，为对数生长期；18h，生物量达到最大值，OD₆₀₀为0.45；随后生长曲线较为平缓，进入稳定生长期。体系的pH值随培养时间的增加而逐渐递增，从初始的7.13提高到8.77，说明YG5生长过程中产碱。这与目前报道的许多异养硝化菌类似，例如Acinetobacter calcoaceticus N7培养的24h，pH从7.50上升至8.80；Pseudomonasaeruginosa YL培养的24h，pH从7.00增长至9.00；Alteromonas macleodii 8D在培养的48h中，pH无明显变化，基本维持在7.57。

0～12h，菌株YG5对NH₄ ⁺-N和TN降解迅速，NH₄ ⁺-N去除速率最高达8.37mg·(L·h)^-1，NO₃ ^--N开始积累；12～30h，菌株YG5对NH₄ ⁺-N和TN降解缓慢；30h，菌株YG5的NH₄ ⁺-N脱除率为100.00％，TN脱除率最高达96.57％。菌株YG5的异养硝化与生长规律一致，这说明氮的去除与菌体生长有很大的关系，该结果与Alcaligenes faecalis Ni3-1，Pseudomonassp.DK1的脱氮作用主要发生在对数生长期情况一致。另外，菌株YG5异养硝化过程中几乎没有NO₃ ^--N，NO₂ ^--N的积累，这与Klebsiella sp.y6情况相一致。一般异养硝化菌，适应期长，不能在短时间内将体系中的氮完全去除，例如在初始NH₄ ⁺-N浓度都为100mg·L^-1的情况下，Pseudomonas putida YH培养48h NH₄ ⁺-N脱除率为98.90％，Acinetobacter sp JQ1004 33h菌株NH₄ ⁺-N脱除率为99.45％，而YG5仅需30h NH₄ ⁺-N脱除率就能达到100.00％，说明YG5的NH₄ ⁺-N去除速率更高，具有较强的脱氮性能。

好氧反硝化性能结果：好氧反硝化培养体系中，菌株YG5以NO₃ ^--N为氮源，其生长和脱氮性能变化结果如图6所示：0～18h，菌株YG5生物量增长迅速，为对数生长期，生物量在18h上升到最高值，OD₆₀₀为0.35；18～24h，菌株YG5处于下降的状态，这是因为C源不足，代谢产物累积，抑制菌的生长；24h后，菌株YG5生长曲线较为平缓，处于稳定期。0～18h，NO₃ ^--N，TN的脱除率逐渐增加，NO₂ ^--N积累量为1.32mg·L^-1，反应过程中还伴有少量的NH₄ ⁺-N积累；18h，NO₃ ^--N与TN的脱除率分别达到77.80％和64.76％；18～48h，NO₃ ^--N和TN降解缓慢；24h，TN脱除率最高达68.81％；36h，NO₃ ^--N脱氮率最高达78.43％；48h，NH₄ ⁺-N积累量为3.20mg·L^-1，NO₂ ^--N积累量为1.10mg·L^-1。已报道大部分HN-AD菌利用NO₃ ^--N作为氮源进行反硝化时，反应过程中检测到中间产物NO₂ ^--N的积累。例如Pseudomonas sp.CD1在初始NO₃ ^--N浓度为253.50mg·L^-1的情况下，培养48h后NO₂ ^--N的积累量为3.20mg·L^-1；Pseudomonasaeruginosa YL在初始NO₃ ^--N浓度为200mg·L^-1的情况下，培养48h后NO₂ ^--N的积累量为59.90mg·L^-1；Pseudomonas putida YH在初始NO₃ ^--N浓度为100mg·L^-1的情况下，培养48h后所积累的NO₂ ^--N最终完全去除。以上结果表明，NO₂ ^--N是异养硝化好氧反硝化菌好氧反硝化脱氮过程的中间产物。

好氧亚硝化性能结果：好氧亚硝化培养体系中，YG5以NO₂ ^--N为氮源，生长和脱氮性能变化规律如图7所示：0～6h，菌株YG5生物量增长较慢，为菌株生长适应期；6～12h，菌株YG5生物量增长迅速，为菌株指数生长期；42h OD₆₀₀最大达0.38；42～48h，菌株YG5生物量开始下降，菌株进入生长衰亡期。0～18h，NO₂ ^--N，TN的脱除率增长迅速，在反应的时候会有少量的NH₄ ⁺-N和NO₂ ^--N生成；18h，NO₂ ^--N与TN脱除率分别达到74.29％和75.21％；18～30h，NO₂ ^--N和TN降解速度降低，30h时NO₂ ^--N，TN脱除率最高分别达到82.12％，76.73％；30h后，NO₂ ^--N，TN的脱除率逐渐降低；48h，NH₄ ⁺-N的积累量达到了11.03mg·L^-1，而NO₃ ^--N几乎没有积累。好氧亚硝化过程中有少量的NH₄ ⁺-N积累，这部分氮源可能来自于少量衰亡的细菌，例如Alteromonas macleodii 8D好氧亚硝化过程中也检测到NH₄ ⁺-N的明显积累，40h NH₄ ⁺-N浓度达3.11mg·L^-1，48h下降至1.99mg·L^-1；Arthrobacter arilaitensis Y-10好氧亚硝化过程中有微量NH₄ ⁺-N积累。YG5的好氧反硝化性能变化规律与好氧亚硝化性能变化规律相似。这与Pseudomonas sp.y3对NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的利用情况相似，而Bacillushwajinpoensis SLWX₂好氧亚硝化性能强于好氧反硝化性能，综上所述，不同种属的异养硝化菌对NO₃ ^--N或NO₂ ^--N的利用情况存在差异。

异养硝化脱氮性能影响因素

C源对YG5异养硝化性能的影响：分别使用柠檬酸钠、乙酸钠、草酸钠、琥珀酸钠、葡萄糖、蔗糖作为C源，无机C源碳酸氢钠和无C培养基作为对照。根据3％的接种量，将菌株YG5种子液接种到装有100mL的异养硝化培养基的250mL三角瓶中，其C/N为10，NH4+-N浓度为100mg·L-1，30℃，150r·min-1培养24h，测定菌液中菌体生物量OD600、pH值和NH4+-N、TN的含量。

微生物细胞的正常生长周期中，C源是一种不可或缺的营养物，不但在微生物组织结构中发挥着重要作用，也是微生物生命活动中一种重要的能量来源。不同种类的C源对YG5异养硝化脱氮性能的影响结果如图8所示：柠檬酸钠为C源时，菌株YG5 OD₆₀₀值最大为0.31，NH₄ ⁺-N和TN脱除率最大分别达到89.48％和81.92％；以琥珀酸钠为C源时，菌株YG5OD₆₀₀值为0.30，NH₄ ⁺-N和TN的脱除率分别为82.98％和78.09％。C源是乙酸钠和草酸钠时，OD₆₀₀分别为0.10、0.06，NH₄ ⁺-N脱除率分别为25.99％、3.48％，TN脱除率分别为25.29％、3.03％，这说明了在C来源于有机酸的时候，菌株YG5生物量比较高，脱氮效果较好。当C源是葡萄糖，蔗糖时，菌株YG5基本没有增长。以碳酸氢钠为C源时，OD₆₀₀为0.06，NH₄ ⁺-N脱除率为50.23％，说明菌株YG5可以利用无机C源，具有自养硝化的能力，但无机C源不适合菌株YG5的生长和NH₄ ⁺-N去除。综上，选择柠檬酸钠为菌株YG5脱氮性能研究的C源。

菌株YG5与目前报道大部分异养硝化菌一样，相对于糖类，更容易高效利用有机酸。原因是琥珀酸钠与柠檬酸钠是微生物将复杂有机物转化为简单小分子有机物时三羧酸循环中的中间产物，可以直接参与TCA循环，而糖类需要转化为有机酸再利用。例如，菌株Klebsiellasp.y6以琥珀酸钠为C源时，NH₄ ⁺-N脱除率为93.85％，明显高于其他C源，这说明小分子的有机酸C更适合y6菌的生长；当NH₄ ⁺-N浓度为100mg·L^-1，以柠檬酸钠为C源，菌株Enterobacter asburiae YBNH₄ ⁺-N脱除率最大达81.20％。但不同种属的异养硝化菌对C源的利用情况也不尽相同，例如Bacillus pumilus BP-171以葡萄糖为C源，NH₄ ⁺-N的去除效果最佳，培养12h NH₄ ⁺-N脱除率达74.07％；Diaphorobacter sp.PDB3以苯酚为C源，当初始NH₄ ⁺-N为40mg·L^-1时，培养21h NH₄ ⁺-N完全去除。

C/N对YG5异养硝化性能的影响：接种量为3％，以柠檬酸钠为C源，以(NH₄)₂SO₄为氮源，初始NH₄ ⁺-N浓度为100mg·L^-1，将YG5接入装量为100mL不同C/N异养硝化培养基，其C/N为10、30、50、100、150、200，30℃、150r·min^-1培养24h，测定菌液中菌体生物量OD₆₀₀、pH值和NH₄ ⁺-N，TN的含量。

不同C/N对菌株YG5的生长情况以及异养硝化脱氮性能的影响结果如图9所示:当C/N为10～30时，菌株YG5 OD₆₀₀都达到0.35以上；C/N从30增加至200时，菌株YG5菌体OD₆₀₀明显下降，由0.36下降到0.08。当C/N为10～30时，NH₄ ⁺-N和TN不低于95％，；当C/N提高至50、100、150、200时，NH₄ ⁺-N脱除率出现了一定的降低，分别为56.87％、33.30％、19.30％、16.89％。综上所述，菌株YG5最适C/N范围为10～30。C/N对菌株的生长和NH₄ ⁺-N降解有显著影响，由于菌株的多样性与代谢机理的不同，异养硝化菌C/N的适应范围也不同。例如当初始NH₄ ⁺-N浓度为100mg·L^-1时，Enterobacter asburiae YT C/N的最适范围是10～12，当C/N为12，OD₆₀₀与NH₄ ⁺-N脱除率最高分别达到1.94和98.90％；Pseudomonas aeruginosa YL C/N的最适范围是10～15，当C/N为10，OD₆₀₀与NH₄ ⁺-N脱除率最高分别达到1.38和90.80％。综上所述，与YT、YL相比，菌株YG5在高碳氮比下脱氮更具有优势，说明了菌株YG5在高负荷C源条件下可以高效的脱氮，具有潜在的废水处理应用优势与潜能。

培养条件对YG5异养硝化性能的影响

温度，pH及装量对YG5异养硝化脱氮能力的影响采用响应面法进行研究。以柠檬酸钠为C源，C/N为10。根据Design-Expert 8.0.6Trial软件中的Box-Behnken设计方法，对温度、pH、装量进行三因素三水平的响应面分析。根据NH₄ ⁺-N脱除率拟合出响应面数学模型，最终确定YG5的最适温度、pH、装量。采用Box-Behnken设计方法，对影响菌株脱氮效果的三个因素进行编码，三个水平对应的编码值分别为-1、0、1。各因素水平取值如表9：

表9响应面实验设计的因素和水平

(1)实验方案与结果：pH(A)，装量(B)，温度(C)这三个参数作为自变量，NH₄ ⁺-N去除率(R₁)为响应值，采用响应面试验设计方案及结果如表10所示：

表10响应面实验设计方案及结果

编号	pH(A)	装量(mL)(B)	温度(℃)(C)	NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N去除率(％)
					1	0	0	0	97.92
2	1	0	1	82.96
					3	0	1	-1	83.28
4	0	0	0	96.58
					5	0	0	0	96.58
6	1	1	0	81.39
					7	-1	0	-1	94.15
8	1	-1	0	93.04
					9	-1	-1	0	93.09
10	-1	0	1	78.81
					11	0	0	0	95.78
12	0	-1	1	76.25
					13	0	1	1	73.01
14	0	-1	-1	95.33
					15	1	0	-1	95.76
16	0	0	0	97.65
					17	-1	1	0	80.99

(2)方差分析：利用Design-Expert 8.0.6Trial软件对实验数据进行多元线性回归拟合，得到拟合二次回归模型方程：

R₁＝96.90+0.76A-4.88B-7.19C+0.11AB+0.63AC+2.20BC-1.91A²-7.86B²-7.07C²

其中R₁代表NH₄ ⁺-N去除率，A，B，C分别代表pH，装量，温度的编码值。对上述模型方程进行方差分析，其结果如表11所示：

表11实验结果方差分析

方差来源	平方和	自由度	均方	F值	p值
						模型	1157.86	9	128.65	56.86	**
A	4.67	1	4.67	2.06	0.19
						B	190.51	1	190.51	84.20	**
C	413.08	1	413.08	182.56	**
						AB	0.053	1	0.053	0.023	0.88
AC	1.60	1	1.60	0.71	0.42
						BC	19.37	1	19.37	8.56	*
A<sup>2</sup>	15.37	1	15.37	6.79	*
						B<sup>2</sup>	260.29	1	260.29	115.04	**
C<sup>2</sup>	210.47	1	210.47	93.02	**
						残差	15.84	7	2.26
失拟项	12.78	3	4.26	5.58	0.06
						纯误差	3.06	4	0.76
总误差	1173.70	17

注：*为显著(p<0.05)，**为极显著(p<0.01)

模型的p<0.01，为极显著，说明用响应面法建立的回归模型是有意义的。失拟项的p>0.05，说明无失拟因素存在，这个回归模型具备了较高的拟合度，因此通过这个模型来研究分析实验结果是可行的。由方差分析结果可知模型方程一次项B，C(p<0.01)，达到极显著差异水平；二次项B²，C²(p<0.01)也达到了极显著差异水平；BC(p<0.05)达到显著水平；AB，AC(p>0.05)没有达到显著水平。这能够看出各个因素之间对响应值并不是单一的线性关系，且对响应值的影响存在一个极值点，这个极值点正是最佳条件。根据模型方程可预测当pH为8.07，250mL三角瓶装量为82.61mL，温度为31.67℃时，反应体系的异养硝化能力为最佳。

(3)模型分析：将三种因素分别进行两两的分析比较，通过回归方程绘制的响应面图和等高线图，可以根据等高线的形状看出相互作用的强弱，圆形代表相互作用不显著，椭圆形代表相互作用显著，其最小椭圆，然后经过回归分析，将等高线图和响应面图绘制出来，在等高线图中，可以根据其形状来判断相互作用的大小，若是等高线表现为圆形，则表示相互作用不显著，若等高线表现为椭圆形，则表示相互作用是显著的，在所有椭圆中，面积最小的一个的的中心点即为响应面的最高点。响应面的作用在于当某一变量的编码值处于0时，可以看出其余两个独立变量之间的相互影响。

pH与装量对菌株YG5 NH₄ ⁺-N脱除率的相互影响结果如图10的上两幅图所示：上图左图的等高线的形状为椭圆形，说明当温度一定时，pH与装量之间的交互作用显著。上图右图的整体响应面较为陡峭，响应值随着装量的变化率大于随着pH的变化率，表示装量比pH对菌株YG5 NH₄ ⁺-N脱除率的影响程度大。pH和温度对菌株YG5 NH₄ ⁺-N脱除率的相互影响结果如图10的中间两幅图所示：在中图左图的等高线图中，可以发现图线多呈椭圆，说明了pH与温度之间有显著的影响关系，其中图右图的响应面不平缓，在温度发生改变的时候，响应值改变量更大，说明温度比pH对NH₄ ⁺-N脱除率的影响程度大。装量和温度对菌株YG5NH₄ ⁺-N脱除率的相互影响结果如图10的下两幅图所示：在下图左图的等高线图中，其图线为椭圆，说明装量温度之间有显著的影响关系，其下图右图的响应面不陡峭，响应值随着温度的变化率与随着pH的变化率相当，表示装量与温度对NH₄ ⁺-N脱除率的影响程度相当。

(4)模型验证：由响应面分析得出菌株YG5脱氮最适条件：pH 8.07，装量为250mL三角瓶约装82.61mL，温度31.67℃，此时NH₄ ⁺-N脱除率预测值为96.58％。为验证模型预测的准确性和有效性，在最优条件下进行三组水平实验，150r·min^-1培养24h，测得实际平均NH₄ ⁺-N脱除率为99.11％。可见实际值与回归方程所得到的理论值非常接近，菌株YG5优化后NH₄ ⁺-N脱除率与优化前相比提高了16.13％。同时，检测了菌株YG5优化后TN脱除率为98.39％，与优化前TN脱除率相比较提高了20.30％。以上结果表明采用响应面法优化菌株YG5的脱氮条件，取得了良好的效果。

NH₄ ⁺-N浓度对YG5异养硝化性能的影响：3％接种量，C/N＝10，调节柠檬酸钠和(NH₄)₂SO₄含量，使NH₄ ⁺-N浓度为100、300、500、1000、1500、2000mg·L^-1，将YG5接入装量为100mL异养硝化培养基，30℃、150r·min^-1培养7d，每天取样检测菌液中菌体生物量OD₆₀₀、pH值，NH₄ ⁺-N和TN的含量以及NO₃ ^--N、NO₂ ^--N的积累量。

菌株YG5在不同NH₄ ⁺-N浓度培养基中的生长情况以及异养硝化脱氮性能的影响结果如图11所示：初始NH₄ ⁺-N浓度分别为100、300、500、1000、1500、2000mg·L^-1，菌株YG5在异养硝化培养基中经过7d的不间断培养：当NH₄ ⁺-N浓度为100～300mg·L^-1时，菌株YG5生物量随着氮浓度的增加而增加，OD₆₀₀由0.98上升到2.23；当NH₄ ⁺-N浓度为300～2000mg·L^-1时，菌株生物量发生明显的降低，OD₆₀₀由2.23下降到0.06，说明氮浓度过高对菌的生长和脱氮性能产生抑制作用，抑制了菌株的生长代谢以及有效反应。当NH₄ ⁺-N浓度为100～500mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N，TN脱除率达97.00％以上，其中NH₄ ⁺-N浓度为500mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N，TN脱除率最高分别达100.00％，98.80％；NH₄ ⁺-N浓度分别为1000、1500、2000mg·L^-1时，随着氮浓度上升，其脱除率越来越低，分别为35.07％、7.83％、10.31％。同时，测定了NO₃ ^--N，NO₂ ^--N积累情况，结果表明无论是高氮负荷还是低氮负荷二者都无明显积累。综上所述，菌株YG5能够适应较宽范围的NH₄ ⁺-N负荷，在高NH₄ ⁺-N负荷下仍具有较高的异养硝化能力，高于目前报道的一些好氧反硝化菌株，例如当初始NH₄ ⁺-N浓度为20～160mg·L^-1时，Pseudomonasalcaliphila AD-28对NH₄ ⁺-N脱除率达到90.00％以上，NH₄ ⁺-N浓度上升到到200mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N脱除率为86.60％；当NH₄ ⁺-N浓度在50～200mg·L^-1时，Pseudomonas putida YH对NH₄ ⁺-N脱除率达到98.00％以上，NH₄ ⁺-N浓度增大到500mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N脱除率为66.70％；当NH₄ ⁺-N浓度为50～100mg·L^-1时，Acinetobacter sp YN3对NH₄ ⁺-N脱除率达到98.00％以上，NH₄ ⁺-N浓度增大到150mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N脱除率下降到18.70％。比起前面所说的这些菌株来说，YG5在处理NH₄ ⁺-N含量较高的污水具备相当强的潜力。

好氧反硝化脱氮性能影响因素

C/N对YG5好氧反硝化性能的影响：接种量为3％，以柠檬酸钠为C源，以KNO₃为氮源，初始NO₃ ^--N浓度为100mg·L^-1，将YG5接入装量为100mL不同C/N好氧反硝化培养基，其C/N为5、10、15、20、30、50、80，30℃、150r·min^-1培养24h，取样检测菌液中菌体生物量OD₆₀₀、pH值以及NO₃ ^--N、TN的含量。

C/N是衡量反硝化体系中电子供体和电子受体比率的指标，是好氧反硝化细菌在呼吸过程中获得高效脱氮效率的重要因素。不同C/N对菌株YG5的生长情况以及好氧反硝化脱氮的影响结果如图12所示:当C/N为5～30时，菌株YG5 OD₆₀₀随着C/N的增加而增加，这是由于低的C源含量不能满足菌株YG5的生长，其中C/N为30时，YG5 OD₆₀₀最大达到0.88；当C/N为50和80时，菌株YG5 OD₆₀₀随着C/N的增加而降低，分别为0.75和0.59，说明C源已经超过了菌体所需的量，对菌株生长产生了一定抑制作用。菌株YG5对C/N的适应范围较宽，C/N为15～80时，24h NO₃ ^--N和TN脱除率都达到90.00％以上。总体来说YG5好氧反硝化的C/N较高，适用范围较广，优于目前报道的大部分好氧反硝化菌株，例如初始NO₃ ^--N浓度为100mg·L^-1的情况下，当C/N为8～10时，Pseudomonas sp.HG-7对NO₃ ^--N脱除率达到98.00％以上，当C/N不超过4时，NO₃ ^--N去除效果有所减弱；NO₃ ^--N浓度为100mg·L^-1的情况下，当C/N为12～20时，Pseudomonas citrohellolis AD-9对NO₃ ^--N脱除率达到90.00％以上，当C/N为20时，NO₃ ^--N去除效果有一定的减弱；NO₃ ^--N浓度为100mg·L^-1的情况下，当C/N为8和10时，Pseudomonasstutzerri XL-2的NO₃ ^--N脱除率达到96.00％以上，TN脱除率分别为87.00％，87.60％，当C/N为15时，TN脱除率为83.00％。综上YG5在好氧反硝化过程中所能适应C/N较高，适用范围较广，有利于其在实际工程的应用，适合处理高C/N及有机质丰富的废水，其在高C/N废水反硝化脱氮过程中具有潜在的利用价值。

NO₃ ^--N浓度对YG5好氧反硝化性能的影响：3％接种量，C/N＝10，调节柠檬酸钠和KNO₃含量，使NO₃ ^--N浓度为100、300、500、800、1200、1500mg·L^-1，将YG5接入装量为100mL好氧反硝化培养基，30℃、150r·min-1培养7d，每天取样检测菌液中菌体生物量OD₆₀₀、pH值，NO₃ ^--N和TN的含量以及NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N的积累量。

菌株YG5在不同NO₃ ^--N浓度培养基中的生长情况以及好氧反硝化脱氮性能的影响结果如图13所示：初始NO₃ ^--N浓度分别为100、300、500、800、1200、1500mg·L^-1，菌株YG5好氧反硝化培养基中经过7d的不间断培养：当NO₃ ^--N浓度为100～300mg·L^-1时，菌株生物量随着氮浓度的增加而增加；当NO₃ ^--N浓度为300mg·L^-1时，菌株YG5的OD₆₀₀最高达1.86；当NO₃ ^--N浓度为300～1500mg·L^-1时，菌株生物量随着氮浓度的增加而下降。当NO₃ ^--N浓度为100～800mg·L^-1时，NO₃ ^--N脱除率达到96.00％以上；当NO₃ ^--N浓度为1500、2000mg·L^-1时，菌体的NO₃ ^--N脱除率非常低，分别为6.31％、6.58％。同时，检测了各培养基中NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N的浓度，发现只有微量的积累。综上所述，菌株YG5 NO₃ ^--N浓度最佳耐受范围为100～800mg·L^-1，优于目前报道的大部分好氧反硝化菌，例如初始NO₃ ^--N浓度在10～200mg·L^-1时，Bacillus hwajinpoensis SLWX₂对NO₃ ^--N基本降解完全，NO₃ ^--N浓度为500mg·L^-1时，NO₃ ^--N脱除率为24.00％；初始NO₃ ^--N浓度为10～500mg·L^-1，Paracoccus versutus AD-4对NO₃ ^--N脱除率均达到99.00％以上，NO₃ ^--N浓度大于500mg·L^-1时，NO₃ ^--N脱除率发生明显的降低^[46]；初始NO₃ ^--N浓度为50mg·L^-1时，Acinetobacte sp HY2对NO₃ ^--N脱除率达100.00％，NO₃ ^--N浓度为100～300mg·L^-1时，NO₃ ^--N脱除率随着氮浓度的升高而降低。综上比较，菌株YG5所耐受的NO₃ ^--N浓度更高，脱氮能力更强。

C/N对YG5好氧亚硝化性能的影响：接种量为3％，以柠檬酸钠为C源，以NaNO₂为氮源，初始NO₂ ^--N浓度为100mg·L^-1，将YG5接入装量为100mL不同C/N好氧亚硝化培养基，其C/N为5、10、15、20、30、50、80，30℃、150r·min^-1培养24h，取样检测菌液中菌体生物量OD₆₀₀、pH值以及NO₂ ^--N、TN的含量。

不同C/N对菌株YG5的生长情况以及好氧亚硝化脱氮性能的影响结果如图14所示：当C/N为5～30时，生物量较少，说明此时C源含量不能满足菌株YG5的生长；C/N为30时，菌株OD₆₀₀达到最大值0.83；当C/N为30～80时，生物量有所下降，说明C源已经超过了菌体所需的量，对菌株生长产生了一定抑制作用。当C/N为15～80时，24h NO₂ ^--N和TN脱除率都达到90％以上，其中C/N为30时，菌株YG5的NO₂ ^--N和TN脱除率都达到了100.00％，说明菌株YG5生长与好氧亚硝化脱氮的最适C/N范围为15～80。菌株YG5当C/N增加到一定程度的情况下，好氧亚硝化脱单性能呈现下降的趋势，这与Bacillus licheniformis FP6好氧亚硝化脱单性能规律一致。当C/N为4时，FP6 NO₂ ^--N的脱除率为48.00％，C/N值大于等于15时，NO₂ ^--N的脱除率都达到100.00％，C/N值为25时，TN的脱除率出现下降。菌株YG5与FP6在C/N增加到一定程度下，好氧亚硝化脱单性能出现下降的原因是高C/N容易造成溶氧量的不足，满足菌体生长代谢需求后，过剩的C源产生的中间产物发生积累，抑制了好氧亚硝化的进行。同时NO₂ ^--N可能对菌体有毒害作用，导致菌株对NO₂ ^--N的利用较差。

NO₂ ^--N浓度对YG5好氧亚硝化性能的影响：3％接种量，C/N＝10，调节柠檬酸钠和NaNO₂含量，使NO₂ ^--N浓度为100、300、500、800、1000mg·L^-1，将YG5接入装量为100mL好氧亚硝化培养基，30℃、150r·min-1培养7d，每天取样检测菌液中菌体生物量OD₆₀₀、pH值，NO₂ ^--N和TN的含量以及NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N的积累量。

不同NO₂ ^--N浓度对菌株YG5的生长情况以及好氧亚硝化脱氮性能的影响结果如图15可见:初始NH₄ ⁺-N浓度分别为100、300、500、800、1000mg·L^-1，菌株YG5好氧亚硝化培养基中经过7d的不间断培养：当NO₂ ^--N浓度为100～300mg·L^-1时，菌株生物量随着氮浓度的上升而增加，当NO₂ ^--N浓度为300mg·L^-1时，菌株YG5 OD₆₀₀值最高达到1.36，当NO₂ ^--N浓度为500、800、1000mg·L^-1时，其生物量有了显著的减少，分别为0.53、0.07、0.06。当NO₂ ^--N浓度为100～300mg·L^-1时，菌株YG5对NO₂ ^--N脱除率均为100.00％，当NO₃ ^--N浓度为500、800、1000mg·L^-1时，菌株YG5对NO₂ ^--N脱除率很低，分别为8.69％、9.25％、8.69％。菌株种类不同，其对NO₃ ^--N浓度的耐受程度也不同，例如当初始NO₂ ^--N浓度为10mg·L^-1时，Pseudomonastolaasii Y-11对NO₂ ^--N能完全去除，随着含氮量的增高，去除效果开始下降；当初始NO₂ ^--N浓度为20mg·L^-1时，Bacillus coagulans YX-6对NO₂ ^--N的脱除率接近100.00％，初始NO₂ ^--N浓度为100mg·L^-1，的NO₂ ^--N脱除率仅为20.00％；当初始NO₂ ^--N浓度为10～50mg·L^-1时，Bacillus hwajinpoensis SLWX₂对NO₂ ^--N几乎能完全去除，当NO₂ ^--N浓度为300mg·L^-1时，NO₂ ^--N脱除率为10.00％。比起前面所说的这些菌株，菌株YG5能够耐受较高浓度的NO₂ ^--N，能更有效的解决NO₂ ^--N积累问题，好氧反硝化反应过程不易被NO₂ ^--N抑制，可为含NO₂ ^--N废水处理提供菌种来源。

氮平衡分析：HN-AD细菌通过两种方式消耗氮，包括同化和反硝化，在生长和代谢过程中会将一部分氮同化，主要以有机胺，氨基酸等形式存在于细胞内；另外一部分氮通过反硝化作用以氮氧化合物或氮气等气态形式逸散到外界气体环境中。为了更好地分析菌株YG5同化作用和反硝化作用之间的氮平衡，C/N为10，pH为7条件下，将菌株YG5种子液分别接种到初始浓度为100mg·L^-1的异养硝化或好氧反硝化培养基中，30℃，150r·min^-1的条件下培养3d。测定未接菌时的初始TN含量，培养后每24h取样离心，测上清液中的TN，为剩余溶解性氮。用超声波细胞破碎仪处理未离心的菌液以释放细胞内部的氮，从而测定最终TN。超声波破碎后的样品4000r·min^-1离心10min，并将其上清液通过0.22μm的滤膜过滤，利用滤液来测定最终溶解性TN、NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N。计算方法如表12：

表12氮平衡分析的计算方法

菌株YG5在异养硝化与好氧反硝化过程中的氮平衡分析结果如表13所示：菌株YG5以NH₄ ⁺-N为氮源进行异养硝化过程时，随着培养时间由第1天到第3天，培养体系中有机氮的含量逐渐减少；细胞内同化的氮量逐渐降低，由55.45％下降到44.13％；TN的去除量逐渐升高，转化为气态氮的比例由28.71％上升至44.73％。3d后，最终NO₃ ^--N积累量2.91mg·L^-1，无NO₂ ^--N的积累。菌株YG5以NO₃ ^--N为氮源进行好氧反硝化过程时，随着培养时间由第1天到第3天，培养体系中有机氮的含量由16.33mg·L^-1增加到17.79mg·L^-1；细胞内同化的氮量逐渐降低，由37.03％下降到16.44％；TN的去除量逐渐升高，转化为气态氮的比例由43.16％上升至63.23％；有微量NO₂ ^--N的积累，无NH₄ ⁺-N的累积。由此可见，随着时间的延长，异养硝化与好氧反硝化两个培养体系中，菌株YG5将TN转化为气态氮的量都逐渐增加，且其好氧反硝化过程比异养硝化过程的TN去除能力更强。菌株YG5与目前报道的大部分异养硝化好氧反硝化菌一样，反硝化作用强于细胞同化作用。例如Pseudomonas stutzeriKK99初始NO₃ ^--N浓度为135.00mg·L^-1时，48h转化为气态氮为83.33％，同化到细胞的氮为12.53％；Pseudomonas putida DN1.2初始NH₄ ⁺-N浓度为89.00mg·L^-1时，24h转化为气态氮为52.80％，同化到细胞的氮为34.60％；Diaphorobacter.PDB3初始NO₃ ^--N浓度为277.20mg·L^-1时，12h转化为气体的氮为29.00％，同化到细胞的氮为67.30％。

表13 NH₄ ⁺-N与NO₃ ^--N为氮源的氮平衡分析

结论：

(1)以龙岩市的龙津污水处理厂的活性污泥为研究对象，从其中提取分离出一株具有高效脱氮性能的异氧硝化菌，将其命名YG5。菌株YG5为革兰氏阴性菌，呈杆状，有鞭毛。结合菌株生理生化及16S rRNA 同源性分析鉴定，确定该菌株为Pseudomonas sihuiensis。

(2)菌株YG5具有较好的HN-AD能力，以(NH₄)₂SO₄为氮源，48h NH₄ ⁺-N的脱除率达到100.00％。以KNO₃为氮源，48h NO₃ ^--N脱除率为78.43％。以NaNO₂为氮源，48h NO₂ ^--N脱除率为82.12％。

(3)采用单因素与响应面结合的方法研究菌株YG5的异养硝化影响因素结果表明：以C源为柠檬酸钠，C/N 30，pH 8.07，温度31.67℃，250mL三角瓶装量为82.61mL的条件下，菌株YG5对NH₄ ⁺-N，TN脱除率分别为99.11％，98.39％。菌株YG5可耐受NH₄ ⁺-N最高浓度可达2000mg·L^-1。

(4)菌株YG5好氧反硝化与好氧亚硝化C/N高，并且范围广，C/N为15～80时，以上两种反硝化过程中NO₃ ^--N与NO₂ ^--N的脱除率都分别达到90.00％以上。菌株YG5能耐受的NO₃ ^--N和NO₂ ^--N最高浓度分别为1500mg·L^-1和1000mg·L^-1，表明菌株YG5具有处理高浓度NO₃ ^--N，NO₃ ^--N废水的潜能。

(5)YG5氮平衡结果表明：相对于异养硝化过程，菌株YG5好氧反硝化过程中对TN去除能力更强。菌株YG5异养硝化与好氧反硝化作用转化气态氮的能力都强于其细胞同化作用转化为胞内氮，这表明菌株YG5具有很强的脱氮能力。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (9)

1.一种异养硝化-好氧反硝化假单胞菌，其特征在于，所述异养硝化-好氧反硝化假单胞菌为假单胞菌YG5(Pseudomonas sihuiensis YG5)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年12月25日，保藏编号为GDMCC No：60533。

2.权利要求1所述的假单胞菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

将假单胞菌YG5接种于LB培养基中培养至指数生长期，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水制成OD₆₀₀为0.6～0.8的菌悬液。

3.一种如权利要求1所述的异养硝化-好氧反硝化假单胞菌在处理含氮废水中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，假单胞菌YG5以琥珀酸钠和/或柠檬酸钠为碳源、NH₄ ⁺为氮源进行异养硝化脱氮。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述含氮废水的pH值为7～9，温度为30～35℃，C/N比为10～30，NH₄ ⁺-N浓度为100～500mg·L^-1。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，假单胞菌YG5以琥珀酸钠和/或柠檬酸钠为碳源、NO₃ ^-为氮源进行好氧反硝化脱氮。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述含氮废水的pH值为7～9，温度为30～35℃，C/N比为15～80，NO₃ ^--N浓度为100～800mg·L^-1。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，假单胞菌YG5以琥珀酸钠和/或柠檬酸钠为碳源、NO₂ ^-为氮源进行好氧亚硝化脱氮。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含氮废水的pH值为7～9，温度为30～35℃，C/N比为15～80，NO₂ ^--N浓度为100～300mg·L^-1。

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