CN103484398A

CN103484398A - 异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌及其培养和应用

Info

Publication number: CN103484398A
Application number: CN201310380437.8A
Authority: CN
Inventors: 周茂洪; 赵肖为; 叶海仁; 蒋张亮
Original assignee: Wenzhou University
Current assignee: Wenzhou University
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-08-28
Also published as: CN103484398B

Abstract

本发明公开了一株异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌及其培养和应用。该菌株为门多萨假单胞菌（Pseudomonasmendocina）WZUF22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.7523。本发明的菌株WZUF22进行异养硝化和好氧反硝化的适宜pH和温度范围广，对NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的去除率高，可为同步硝化和反硝化提供种源。

Description

异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌及其培养和应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌及其培养和应用。

背景技术

氮素给环境造成的污染问题近年来日益突出，其危害性也日益被人们认识和重视。如氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有可能转化为致癌、致突变和致畸的亚硝胺；又如氮素流入水体造成水体富营养化，引起水质恶化以至湖泊退化。生物脱氮具有处理效果好、处理过程稳定可靠、操作管理方便等的优点而得到广泛应用。

传统的生物脱氮由自养硝化菌的硝化作用和厌氧反硝化菌的反硝化作用完成。20世纪80年代以后，人们发现许多细菌如荧光假单胞菌( Pseudomonas flur- escens ) 、粪产碱菌( Alaligenes facealis ) 、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)等可以进行异养硝化，脱氮副球菌( Paracoccus denitrificans)、Pseudmonas spp. 和Alcaligenes faecalis等能进行好氧反硝化，Paracoccus pantotrophus等可以异养硝化-好氧反硝化（微生物学通报，2009,36（2）：255～260）。与自养型硝化菌比较, 异养硝化菌的生长速率快, 细胞产率高，需要的溶解氧浓度低, 能耐受酸性环境且活性高，并且能够代谢各种形态的氮化合物, 同时提高COD的去除率。好氧反硝化和异养硝化的发现打破了传统的生物脱氮理论，使得同步硝化和反硝化成为可能，不仅可以降低运行成本, 减少工艺上繁琐的操作, 还可以扩大自养硝化菌所不能处理的水质范围。

到目前为止，已有许多异养硝化或好氧反硝化或异养硝化-好氧反硝化的菌株被分离获得。分离自不同环境的菌株，其生理特性和除氮能力各具特色，它们可为实际应用或进一步的菌株改造提供丰富的种源。如李小龙等从鱼塘水样中分离到1株不动杆菌 ( Acinetobacter sp.) ，以KNO₃、( NH₄)₂ SO₄、NaNO₂为唯一氮源的培养液中，可在24 h内将培养液中NO₃ ^--N 从161.61 mg·L^-1 降至55.69 mg·L^-1，去除速率为4.41 mg·L^-1 h^-1 NO₃ ^--N ；15 h内将NH ₄ ⁺ -N由220.24 mg·L^-1降至14.78 mg ·L^-1，去除速率为13.70 mg·L^-1h^-1 NH₄ ⁺–N ；12 h内NO₂ ^--N 浓度由101.27 mg·L^-1降至21. 85 mg·L^-1，去除速率为6.62mg·L^-1h^-1 NO₂ ^--N；但其脱氮的适宜pH为偏碱性的；20℃时不生长， 40℃时在NH₄ ⁺-N测定液中生长缓慢，在NO₂ ^--N测定液中不生长，最佳生长温度为30℃（微生物学报，2011,51（8）:1062-1070），其对pH值和温度的要求较高，适用范围小。又如Jibin Zhang等从猪粪污水中分离获得1株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri YZN-001），在10℃、20℃、30℃和37℃下，NH₄ ⁺-N的硝化速率分别约为1.48、4.20、5.53和5.59 mg·L^-1h^-1 NH₄ ⁺–N；在30℃下硝酸硝化率和亚硝酸硝化率分别为11.46 mg·L^-1h^-1 NO₂ ^--N和10.99 mg·L^-1 h^-1 NO₃ ^--N（Bioresource Technology,2011,102 : 9866–9869），其去除铵态氮能力较弱。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一株异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌及其培养和应用。

本发明提供的一株异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌，该菌株为门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）WZUF22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO. 7523。

本发明还提供上述门多萨假单胞菌的培养方法，包括如下步骤：

1）保藏菌株WZUF22接种于LB培养基中，培养12 h以上，离心，得菌体，菌体用无菌水洗涤后制成OD ₆₈₀为0.900～1.000的菌悬液；

2）步骤1）得到的菌悬液接种于硝化培养基或反硝化培养基中，进行培养；

其中，所述硝化培养基的构成为：氮源，碳源，Mg SO₄，K₂HPO₄，NaCl，MnSO₄，FeSO₄，H₂O，所述碳源为柠檬酸钠、丁二酸钠或乙酸钠的其中一种或其组合，所述氮源为含铵离子的化合物提供；所述反硝化培养基的配方为：碳源，氮源，K₂HPO₄，FeSO₄，MgSO₄，H₂O，所述碳源为柠檬酸钠、丁二酸钠或乙酸钠的其中一种或其组合，所述氮源为含硝酸根或亚硝酸根的化合物。

优选地，：氮源的NH₄ ⁺的质量 0.34 g，碳源，Mg SO₄·7H₂O 0.1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.02g，FeSO₄ 0.02g，H₂O 1000 ml，pH值为5.0~10，所述碳源与氮源的NH₄ ⁺的质量比为5:0.34~15:0.34；反硝化培养基：碳源，氮源，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄ ·7H₂O 0.20g，MgSO₄ ·7H₂O 0.10 g，H₂O 1000 ml，pH值为5.0~10，所述氮源为含硝酸根的化合物时，氮源中硝酸根的质量为0.61g，所述碳源与NO₃ ^-的质量比为5:0.61~15:0.61，所述氮源为含亚硝酸根的化合物时，氮源中亚硝酸根的质量为0.67g，所述碳源与NO₂ ^-的质量比为5:0.0.67~15:0.67。

优选地，步骤1）保藏菌株WZUF22接种于LB培养基中，于20～40℃，溶氧3.5～6.1 mg·L^-1的条件下培养；步骤2）的菌悬液接种于硝化培养基或反硝化培养基中，于20~40℃，溶氧3.5～6.1 mg·L^-1下培养。

优选地，所述硝化培养基或反硝化培养基的pH值为5.0~10，pH以HCl或NaOH水溶液进行调节。

优选地，步骤2）中所述菌悬液以5%的体积比接种于硝化培养基或反硝化培养基中。

本发明还提供上述的门多萨假单胞菌的应用，将所述门多萨假单胞菌WZUF22接种于含氮水溶液中，进行异养硝化脱氮和/或好氧反硝化脱氮。

作为优选技术方案，所述含氮水溶液为含有NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-的一种或其组合的水溶液。

优选地，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH₄ ⁺-N与好氧反硝化脱NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的碳源含有柠檬酸钠、乙酸钠或丁二酸钠的其中一种或其组合。含氮水溶液中的氮源只为NH₄ ⁺-时，碳源与含氮水溶液中NH₄ ⁺的质量比为5:0.34~15:0.34；含氮水溶液中的氮源只为NO₃ ^--时，碳源与含氮水溶液中NO₃ ^--的质量比为5:0.61~15:0.61；含氮水溶液中的氮源只为NO₂ ^--时，碳源与含氮水溶液中NO₂ ^--的质量比为5:0.67~15:0.67。

作为优选技术方案，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH₄ ⁺-N与好氧反硝化脱NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的pH为4～10.5。

作为优选技术方案，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH₄ ⁺-N与好氧反硝化脱NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的温度为10℃～40℃。

作为优选技术方案，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH₄ ⁺-N与好氧反硝化脱NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的溶氧为1.3～7.3mg·L^-1，更优选3.5~6.1 mg·L^-1。

本发明能够达到以下技术效果：

1、本发明的菌株WZUF22进行异养硝化和好氧反硝化的适宜pH和温度范围广，对NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的去除率高，可为同步硝化和反硝化提供种源。

2、本发明经研究提供了适合菌株WZUF22培养的硝化、反硝化培养基和培养方法，可培养获得大量菌体。

3、在菌株WZUF22的最佳脱氮条件下，含氮水溶液中的NH₄ ⁺-N的去除率能够达到70%以上，并且无NO₃ ^--N和NO₂ ^--N积累；NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的去除率能够达到100%。

4、利用本发明的菌株能够有效地对废水进行处理，降低废水COD，并且脱氮效果良好。

附图说明

图1是采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌株WZUF22与相关种的16S rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株(P., Pseudomonas)。

图2是菌株去除人工配制的NH₄ ⁺-N污水进程。

图3是菌株去除人工配制的NO₃ ^--N污水进程。

图4 是菌株去除人工配制的NO₂ ^--N污水进程。

菌株保藏

本发明的门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）WZUF22，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO. 7523，保藏起始日期为2013年4月26日。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例一：异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌菌株的分离

样品为取自温州西片污水处理厂的活性污泥，采用常规分离法，将一定量活性污泥接种于富集培养基（NH₄Cl 1g，柠檬酸钠 5g，Mg SO₄·7H₂O 0.1g，K₂HPO₄ 0.5g ，NaCl 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.02g，FeSO₄ 0.02g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）于30℃ 160～180 rpm下进行富集培养3～4天，待长出细菌后转接新的富集培养基继续富集培养，如此重复4～5次。然后将经适当稀释的菌液涂布于分离培养基（琼脂 18g·L^-1，其他成分同富集培养基）于30℃下培养48 h，挑取单菌落转接新的分离培养基进行划线纯化，直至经镜检为纯培养物，然后转接保藏培养基（牛肉膏10g, 蛋白胨10g, NaCl 5g, 琼脂18g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）于30℃下培养后保藏。

分别将保藏菌株接种于硝化培养基（柠檬酸钠10g·L^-1，其他成分同富集培养基）于30℃ 160～180 rpm下培养（250ml锥形瓶装培养基100ml），定时取样分别用纳氏试剂、格利斯试剂Ⅰ和Ⅱ以及二苯胺检测NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N和NO₃ ^--N，根据NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的生成和降解情况以及NH₄ ⁺-N的降解情况，对保藏菌株的异养硝化-好氧反硝化性能进行初步筛选。对初步筛选获得的异养硝化-好氧反硝化菌株进行反硝化性能测定，测定方法按文献进行（东秀珠，常见细菌系统鉴定手册，北京：科学出版社，2001），以进一步确定异养硝化-好氧反硝化性能。

将初筛获得的异养硝化-好氧反硝化菌株进行异养硝化性能的复筛，方法为将菌株接种于硝化培养基（柠檬酸钠10g·L^-1，其他成分同富集培养基）于30℃ 160～180 rpm下培养24 h（250ml锥形瓶装培养基100ml），然后于8000rpm下离心10min后测定上清液的NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N和NO₃ ^--N浓度，计算NH₄ ⁺-N的去除率和NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的积累情况，筛选NH₄ ⁺-N去除能力强NO₂ ^--N和NO₃ ^--N积累低甚至没有积累的优良菌株。

然后对异养硝化-好氧反硝化菌株进行好氧反硝化性能的复筛，方法为将菌株接种于反硝化培养基（丁二酸钠10g，KNO₃1.0g，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄·7H₂O 0.20g，MgSO₄ ·7H₂O 0.10 g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）于30℃ 160～180 rpm下培养24 h（250ml锥形瓶装培养基100ml），然后于8000rpm下离心10min后测定上清液的NO₂ ^--N和NO₃ ^--N浓度，计算NO₃ ^--N的去除率和NO₂ ^--N的积累情况，筛选NO₃ ^--N去除能力强NO₂ ^--N积累低甚至没有积累的优良菌株。

经上述方法获得1株优良的异养硝化-好氧反硝化菌株，编号为WZUF22。

其中，NO₃ ^--N测定采用酚二磺酸法分光光度法，NO₂ ^--N测定采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法，NH₄ ⁺-N测定采用纳氏试剂比色法（国家环境保护局.水和废水监测分析方法（第三版）.北京：中国环境科学出版社，1989）。

NH₄ ⁺-N去除率(%)=（培养前上清液NH₄ ⁺-N浓度-培养后上清液NH₄ ⁺-N浓度）/培养前上清液NH₄ ⁺-N浓度×100%

NO₃ ^--N去除率(%)=（培养前上清液NO₃ ^--N浓度-培养后上清液NO₃ ^--N浓度）/培养前上清液NO₃ ^--N浓度×100%

实施例二：异养硝化-好氧反硝化菌株的鉴定

菌株WZUF22在分离培养基培养48h后菌落呈圆形、半透明、表面不光滑、边缘不整齐、菌落呈淡黄色，菌细胞短杆状，大小0.7～0.8×1.5～3.2μm，无芽孢，革兰氏阴性，单极鞭毛。

以细菌基因组DNA为模板扩增16SrDNA，扩增采用一对通用引物：上游引物（P1）：5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3’，下游引物（P6）：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’，PCR产物的纯化和测序由上海生物工程有限公司完成，测序结果通过GeenBank Blast进行比对分析。与GeenBank中的假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的16SrDNA序列具有很高同源性，与P. mendocina的同源性为99.4%。采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌株WZUF22与相关种的16S rDNA序列系统发育树见图1。

门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）WZUF22，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏中心登记入册编号为CGMCC NO. 7523，保藏起始日期为2013年4月26日。

实施例三：菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的特性

采用单因子试验法，研究菌株WZUF22分别进行异养硝化去除NH₄ ⁺-N和好氧反硝化去除NO₃ ^--N的特性。

实验过程为：保藏菌株WZUF22（2.0ml冷冻管融化的菌液）接种于装有200ml LB培养基（牛肉膏10g, 蛋白胨10g, NaCl 5g, 琼脂18g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）的500ml锥形瓶中，于30℃，150rpm下培养24 h，在8000rpm下离心 10min后得菌体，用无菌水洗涤2次后制成OD ₆₈₀为0.900～1.000的菌悬液；

菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100ml硝化培养基（NH₄Cl，碳源，Mg SO₄·7H₂O，K₂HPO₄，NaCl，MnSO₄·4H₂O，FeSO₄，H₂O，pH 4~10.5）或反硝化培养基（碳源，KNO₃，K₂HPO₄，FeSO₄ ·7H₂O，MgSO₄ ·7H₂O，H₂O，pH 4~10.5）的250ml锥形瓶中，于一定温度（10~40℃）、一定转速（0~250rpm）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NH₄ ⁺-N浓度、NO₂ ^--N浓度和NO₃ ^--N浓度，异养硝化过程计算NH₄ ⁺-N的去除率和NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的积累情况，好氧反硝化过程计算NO₃ ^--N的去除率和NO₂ ^--N的积累情况。

NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的测定以及NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N去除率计算同实施例一。

主要探讨碳源、碳源与氮源（NH₄Cl 或KNO₃）的重量比、温度、pH和溶氧对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响，结果如表1～表5所示。

1、碳源对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响

菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100ml硝化培养基（NH₄Cl 1g（NH₄ ⁺ 0.34g），碳源 10g，Mg SO₄·7H₂O 0. 1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.02g，FeSO₄ 0.02g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）或反硝化培养基（碳源10g ，KNO₃1.0g(NO₃ ^-0.61g)，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄ ·7H₂O 0.20g，MgSO₄ ·7H₂O 0.10 g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）的250ml锥形瓶中，于温度30℃、转速150rpm（溶氧4.9mg·L^-1）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NH₄ ⁺-N浓度、NO₂ ^--N浓度和NO₃ ^--N浓度，异养硝化过程计算NH₄ ⁺-N的去除率和NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的积累情况，好氧反硝化过程计算NO₃ ^--N的去除率和NO₂ ^--N的积累情况。

表1 碳源对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响结果

由表1可知，菌株WZUF22异养硝化和好氧反硝化的适宜碳源均为柠檬酸钠、丁二酸钠和乙酸钠，它们为碳源时，NH₄ ⁺-N去除率超过70%，NO₃ ^--N去除率超过90%，且无NO₃ ^--N、NO₂ ^--N的积累。

2、碳源与氮源（NH₄Cl 或KNO₃）的重量比对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响

菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100ml硝化培养基（NH₄Cl 1g (NH₄ ⁺ 0.34g)，碳源（其与NH₄Cl的质量比为2:1~15:1），Mg SO₄·7H₂O 0. 1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.02g，FeSO₄ 0.02g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）或反硝化培养基（碳源（其与KNO₃的质量比为2:1~15:1），KNO₃1.0g(NO₃ ^-0.61g)，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄ ·7H₂O 0.20g，MgSO₄ ·7H₂O 0.10 g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）的250ml锥形瓶中，于温度30℃、转速150rpm（溶氧4.9mg·L^-1）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NH₄ ⁺-N浓度、NO₂ ^--N浓度和NO₃ ^--N浓度，异养硝化过程计算NH₄ ⁺-N的去除率和NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的积累情况，好氧反硝化过程计算NO₃ ^--N的去除率和NO₂ ^--N的积累情况。

表2 碳源与氮源重量比对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响的结果

由表2可知，随着碳源和氮源重量比的增加对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的去除率均增加，但超过10:1后又下降，最适宜的碳源和氮源重量比为10:1。

1g·L^-1NH₄Cl的硝化培养基相当于含0.34 g·L^-1NH₄ ⁺，1g·L^-1KNO₃的反硝化培养基相当于含0.61 g·L^-1NO₃ ^-。因此碳源与NH₄ ⁺最适宜的质量比为10:0.34，碳源与NO₃ ^-最适宜的质量比为10:0.61。

3、温度对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响

菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100ml硝化培养基（NH₄Cl 1g，柠檬酸钠 10g，Mg SO₄·7H₂O 0. 1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.02g，FeSO₄ 0.02g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）或反硝化培养基（丁二酸钠10g ，KNO₃1.0g，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄ ·7H₂O 0.20g，MgSO₄ ·7H₂O 0.10 g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）的250ml锥形瓶中，于温度10~40℃、转速150rpm（溶氧4.9mg·L^-1）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NH₄ ⁺-N浓度、NO₂ ^--N浓度和NO₃ ^--N浓度，异养硝化过程计算NH₄ ⁺-N的去除率和NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的积累情况，好氧反硝化过程计算NO₃ ^--N的去除率和NO₂ ^--N的积累情况。

表3 温度对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响的结果

由表3可知，在20℃～35℃范围内，菌株WZUF22对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的去除率相似，10℃或40℃时对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的去除率下降。

4、pH对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响

菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100ml硝化培养基（NH₄Cl 1g，柠檬酸钠 10g，Mg SO₄·7H₂O 0. 1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.02g，FeSO₄ 0.02g，H₂O 1000 ml，pH 4~10.5，pH以NaOH或HCl调节）或反硝化培养基（丁二酸钠10g ，KNO₃1.0g，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄ ·7H₂O 0.20g，MgSO₄ ·7H₂O 0.10 g，H₂O 1000 ml，pH 4~10.5，pH以NaOH或HCl调节）的250ml锥形瓶中，于温度30℃、转速150rpm（溶氧4.9mg·L^-1）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NH₄ ⁺-N浓度、NO₂ ^--N浓度和NO₃ ^--N浓度，异养硝化过程计算NH₄ ⁺-N的去除率和NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的积累情况，好氧反硝化过程计算NO₃ ^--N的去除率和NO₂ ^--N的积累情况。

表4 pH对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响结果

由表4可知，在pH5～10的范围内，菌株WZUF22对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的去除率接近，pH 4或10.5时对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的去除率下降。

5、溶氧对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响

菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100ml硝化培养基（NH₄Cl 1g，柠檬酸钠 10g，Mg SO₄·7H₂O 0. 1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.02g，FeSO₄ 0.02g，H₂O 1000 ml，pH 7）或反硝化培养基（丁二酸钠10g ，KNO₃1.0g，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄ ·7H₂O 0.20g，MgSO₄ ·7H₂O 0.10 g，H₂O 1000 ml，pH 7）的250ml锥形瓶中，于温度30℃下培养24 h，通过摇床转速控制溶氧量（溶氧的测定为装有100ml培养基的250ml锥形瓶在不同转速摇床下振荡24h后测定培养基的DO值），8000rpm下离心10min后测定上清液的NH₄ ⁺-N浓度、NO₂ ^--N浓度和NO₃ ^--N浓度，异养硝化过程计算NH₄ ⁺-N的去除率和NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的积累情况，好氧反硝化过程计算NO₃ ^--N的去除率和NO₂ ^--N的积累情况。

表5溶氧对菌株WZUF22去除NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的影响结果

由表5可知，溶氧为1.3mg·L^-1时，菌株WZUF22对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的去除率很低；随着溶氧增加，对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的去除率随之增加；溶氧为3.5～6.1 mg·L^-1时，对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的去除率接近，且无NO₃ ^--N、NO₂ ^--N或NO₂ ^--N的积累；溶氧为7.3 mg·L^-1时，对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的去除率下降。

实施例四：菌株去除人工配制的NH₄ ⁺-N污水进程

保藏菌株（2.0 ml冷冻管融化的菌液）接种于装有200ml LB培养基（配方同实施例三）的500ml锥形瓶中，于30℃150rpm下培养24 h，在8000rpm下离心 10min后得菌体，用无菌水洗涤2次后制成OD ₆₈₀为0.900～1.000的菌悬液；然后按5%(V/V)的接种量转接于人工配制的NH₄ ⁺-N污水（500ml锥形瓶装培养基200ml，配方：NH₄Cl 1g，柠檬酸钠 10g，Mg SO₄·7H₂O 0. 1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.02g，FeSO₄ 0.02g，H₂O 1000 ml，pH 7）于30℃ 150 rpm（DO值4.3 mg·L^-1）下培养，定时取样测定生物量（OD ₆₈₀），然后于8000rpm下离心10min后测定上清液的NH₄ ⁺-N浓度、NO₂ ^--N浓度和NO₃ ^--N浓度，计算NH₄ ⁺-N的去除率和NO₃ ^--N、NO₂ ^--N的积累情况。NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的测定和NH₄ ⁺-N去除率计算同实施例一，结果见图2。

由图2看出，菌株WZUF22可在24 h内将1g·L^-1 NH₄Cl所含的NH₄ ⁺-N（经测定平均含0.260 mg·ml^-1 NH₄ ⁺-N）去除73.50%，去除速率为7.96 mg ·L^-1h^-1 NH₄ ⁺-N，其生物量也在24 h内达到最大，生长与去除NH₄ ⁺-N是同步的；3 h后NO₃ ^--N开始逐渐积累，至9h达到最大，然后逐渐降低，至24 h时已降至接近零；NO₂ ^--N的积累情况与NO₃ ^--N相似，积累高峰在13h。

实施例五菌株去除人工配制的NO₃ ^--N污水的进程

保藏菌株（2.0 ml冷冻管融化的菌液）接种于装有200ml LB培养基（配方同实施例三）的500ml锥形瓶中，于30℃ 150rpm下培养24 h，在8000rpm下离心 10min后得菌体，用无菌水洗涤2次后制成OD ₆₈₀为0.900～1.000的菌悬液；然后按5%(V/V)的接种量转接于人工配制的NO₃ ^--N污水（500ml锥形瓶装培养基200ml，配方：丁二酸钠10g ，KNO₃1.0g，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄ ·7H₂O 0.20g，MgSO₄ ·7H₂O 0.10 g，H₂O 1000 ml，pH 7）于30℃ 150 rpm（DO值4.3 mg·L^-1）下培养，定时取样测定生物量（OD ₆₈₀），然后于8000rpm下离心10min后测定上清液的NO₂ ^--N浓度和NO₃ ^--N浓度，计算NO₃ ^--N的去除率和NO₂ ^--N的积累情况。NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的测定以及NO₃ ^--N去除率计算同实施例一，结果见图3。

从图3看出，菌株WZUF22在12h内可去除培养基内1g·Ｌ^-1 KNO₃所含的NO₃ ^--N（经测定平均含0.105mg·ml^-1NO₃ ^--N），去除率达98.08%，去除速率为8.58 mg·L^-1h^-1NO₃ ^--N；其生物量也在12 h内达到最大，生长与去除NO₃ ^--N是同步的。在去除NO₃ ^--N的过程中，NO₂ ^--N逐渐积累，至9 h时达到最大（13.308 μg·ml^-1），随后又逐渐降低，至12 h后降至零，即没有NO₂ ^--N积累。　　　　　　　　　　　　　

实施例六：菌株去除人工配制的NO₂ ^--N污水的进程

保藏菌株WZUF22（2.0 ml冷冻管融化的菌液）接种于装有200ml LB培养基（配方同实施例三）的500ml 锥形瓶中，于30℃150rpm下培养24 h，在8000rpm下离心 10min后得菌体，用无菌水洗涤2次后制成OD ₆₈₀为0.900～1.000的菌悬液；然后按5%(V/V)的接种量转接于人工配制的NO₂ ^--N污水（500ml锥形瓶装培养基200ml；NO₂ ^--N污水配方为：丁二酸钠10g，NaNO₂1.0g，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄ ·7H₂O 0.20g，MgSO₄ ·7H₂O 0.10 g，H₂O 1000 ml，pH 7.0）于30℃ 150 rpm（DO值4.3 mg·L^-1）下培养，定时取样测定生物量（OD ₆₈₀），然后于8000rpm下离心10min后测定上清液的NO₂ ^--N浓度，计算NO₂ ^--N的去除率，结果见图4。

NO₂ ^--N的测定同实施例一。

NO₂ ^--N去除率(%)=（培养前上清液NO₂ ^--N浓度-培养后上清液NO₂ ^--N浓度）/培养前上清液NO₂ ^--N浓度×100%

从图4看出，菌株WZUF22在24h内可去除培养基内1g·Ｌ^-1 NaNO₂所含的NO₂ ^--N（经测定平均含0.200 mg·ml^-1NO₂ ^--N）的72.81%，去除速率为6.07 mg·L^-1h^-1NO₂ ^--N；其生物量也在24 h内达到最大，生长与去除NO₂ ^--N是同步的。

实施例7 菌株对厌氧处理后的畜禽废水的净化效果

保藏菌株WZUF22（2.0 ml冷冻管融化的菌液）接种于装有200ml LB培养基（配方同实施例三）的500ml锥形瓶中，于30℃150rpm下培养24 h，在8000rpm下离心 10min后得菌体，用无菌水洗涤2次后制成OD ₆₈₀为0.900～1.000的菌悬液；然后菌悬液按5%(V/V)的接种量转接于经厌氧处理后的畜禽废水中，于30℃ 150 rpm（DO值4.3 mg·L^-1）下培养，每隔24 h取样测定生物量（OD ₆₈₀），然后于8000rpm下离心10min后测定上清液的NH₄ ⁺-N浓度、NO₃ ^--N浓度NO₂ ^--N浓度和COD值，结果见表6。

由表6可以看出，菌株WZUF22在48ｈ内可使经厌氧处理后畜禽废水的COD下降95.97 mg·L^-1，NH₄ ⁺-N下降94.38 mg·L^-1，NO₃ ^--N下降40.05 mg·L^-1，NO₂ ^--N下降20.50 mg·L^-1。

表6 菌株WZUF22对厌氧处理后的畜禽废水的净化效果

在经厌氧处理后的畜禽废水中加入碳源丁二酸钠，使其在废水中的浓度达到10g·L^-1，与不加入丁二酸钠的畜禽废水相同的方法，研究菌株WZUF22对畜禽废水的净化效果，结果见表7。

表7 菌株WZUF22对添加了碳源的厌氧处理后的畜禽废水的净化效果

由表7可知，在经厌氧处理后的畜禽废水中添加10 g·L^-1丁二酸钠后，废水的COD值增加823.52 mg·L^-1，培养72h后下降570.52 mg·L^-1；培养48 h 后NH₄ ⁺-N下降207.16 mg·L^-1。培养72 h 后NH₄ ⁺-N下降259.57 mg·L^-1；培养24 h 后，NO₃ ^--N下降42.09 mg·L^-1，NO₂ ^--N下降19.70 mg·L^-1。因此，菌株WZUF22具有良好的实际应用潜力。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一株异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌，其特征在于，该菌株为门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）WZUF22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO. 7523。

2.权利要求1所述门多萨假单胞菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

其中，所述硝化培养基的构成为：氮源，碳源，Mg SO₄，K₂HPO₄，NaCl，MnSO₄，FeSO₄，H₂O，所述碳源为柠檬酸钠、丁二酸钠或乙酸钠的其中一种或其组合，所述氮源为含铵离子的化合物；所述反硝化培养基的配方为：碳源，氮源，K₂HPO₄，FeSO₄，MgSO₄，H₂O，所述碳源为柠檬酸钠、丁二酸钠或乙酸钠的其中一种或其组合，所述氮源为含硝酸根或亚硝酸根的化合物。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤1）保藏菌株WZUF22接种于LB培养基中，于20～40℃，溶氧3.5～6.1 mg·L^-1的条件下培养；步骤2）的菌悬液接种于硝化培养基或反硝化培养基中，于20~40℃，溶氧3.5～6.1 mg·L^-1下培养。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述硝化培养基的配方为：氮源的NH₄ ⁺的质量 0.34 g，碳源，Mg SO₄·7H₂O 0.1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.02g，FeSO₄ 0.02g，H₂O 1000 ml，pH值为5.0~10，所述碳源与氮源的NH₄ ⁺的质量比为5:0.34~15:0.34；反硝化培养基：碳源，氮源，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄ ·7H₂O 0.20g，MgSO₄ ·7H₂O 0.10 g，H₂O 1000 ml，pH值为5.0~10，所述氮源为含硝酸根的化合物时，氮源中硝酸根的质量为0.61g，所述碳源与NO₃ ^-的质量比为5:0.61~15:0.61，所述氮源为含亚硝酸根的化合物时，氮源中亚硝酸根的质量为0.67g，所述碳源与NO₂ ^-的质量比为5:0.0.67~15:0.67。

5.权利要求1所述的门多萨假单胞菌的应用，其特征在于，将所述门多萨假单胞菌WZUF22接种于含氮水溶液中，进行异养硝化脱氮和/或好氧反硝化脱氮。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含氮水溶液为含有NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-的一种或其组合的水溶液。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH₄ ⁺-N与好氧反硝化脱NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的碳源含有柠檬酸钠、乙酸钠或丁二酸钠的其中一种或其组合。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH₄ ⁺-N与好氧反硝化脱NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的pH为4～10.5。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH₄ ⁺-N与好氧反硝化脱NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的温度为10℃～40℃。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH₄ ⁺-N与好氧反硝化脱NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的溶氧为1.3～7.3mg·L^-1。