CN115851540B

CN115851540B - 具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株及应用

Info

Publication number: CN115851540B
Application number: CN202211592856.3A
Authority: CN
Inventors: 舒琥; 马永浩; 黄文�
Original assignee: Guangzhou University
Current assignee: Guangzhou University
Priority date: 2022-12-13
Filing date: 2022-12-13
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2042-12-13
Also published as: CN115851540A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株及应用，所述的菌株为门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）A4，于2022年11月4日保藏在广东省微生物菌株藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo：62944。本发明提供的门多萨假单胞菌A4同时具有异养硝化和好氧反硝化功能，可应用于污水处理领域，在利用污水中多种有机碳源的同时对高浓度的有机碳有很强的耐受性，具有较好的水体有机碳去除能力，该菌株尤其适合于高C/N的含氮污水的处理。

Description

具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株及应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株及应用。

背景技术

随着水产养殖规模的不断扩大，各类水产品的产量也在随之增加，但由于养殖面积与水产品的产量增加不成正比，于是就发展出了高密度、高集约化的养殖模式。投喂的高蛋白饲料只有一小部分被鱼类利用，而大量的营养物(70-80%)就会释放到周围环境中，这种模式不仅会导致养殖水体的污染速度和程度加快加剧，而且还会导致周围水体发生富营养化。

养殖水体质量制约着水产养殖的发展，低浓度的氨对鱼类是有毒的，在氨氧化过程中产生的亚硝酸也是有毒的,为了避免养殖水体中鱼类的大量死亡造成经济损失以及周围水体的富营养化发生，控制养殖水体中的氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐以及磷酸盐是很有必要的。传统的生物脱氮技术包括自养硝化以及异养反硝化，传统的自养硝化和异养反硝化是相互独立的阶段，在实际应用中存在一定的不足。而且传统的除磷操作是通过聚磷菌在好氧-缺氧的环境下聚磷和释磷来实现去除，这要求不同的环境条件，在以往的脱氮除磷进程中，氮元素转化为N₂是在厌氧条件下，磷酸盐的去除是在好氧条件下，如果要同时实现反硝化和除磷就会存在一个矛盾的情况，所以在实际操作过程中会存在一定的难度。因此，有必要寻找能同时进行异养硝化好氧反硝化和除磷的菌株。最近新发现了许多菌株在好氧条件下能同时实现硝化以及反硝化，异养硝化好氧反硝化能够克服不同氧环境的需求。但以往的研究是在淡水的条件下进行的，忽略了环境的多样性与复杂性，如酸碱性、盐度、温度等，缺乏了一定的应用性，目前只有少量关于耐盐的异养硝化好氧反硝化的菌株报道，这些研究集中在氮元素的去除，但忽略了磷元素的去除。磷元素也是导致水体发生富营养化的重要因素之一，甚至有研究发现控制氮元素的输入无法控制湖泊发生富营养化。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株及应用，该菌株是在水产养殖池塘中采集、选育而得到，可在一定盐度条件下高效降解NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N以及PO₄ ^3--P，具有异养硝化功能和好氧反硝化功能的门多萨假单胞菌。该菌株环境适应性良好且安全性高。因此在水产养殖尾水或其他含氮磷高盐污水的生物脱氮除磷处理方面具有良好的应用前景。

本发明的目的采用以下技术方案来实现：

一种具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株，该菌株为门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）A4，于2022年11月4日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo：62944。

一种前述的具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株、门多萨假单胞菌A4，在含氮磷污水处理领域的应用。

优选地，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水的处理时，污水碳源为柠檬酸钠、琥珀酸钠、蔗糖和葡萄糖中的至少一种。

更优选地，污水碳源为琥珀酸钠。

优选地，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水的处理时，污水的C/N（碳/氮）为0~15。

更优选地，污水的C/N为10。

优选地，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水的处理时，污水的P/N（磷/氮）为0~1。

更优选地，污水的P/N为0.2。

优选地，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水的处理时，污水的pH值为5~9。

更优选地，污水的pH=7。

优选地，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮污水的处理时，污水的温度为25℃~40℃。

更优选地，污水的温度为25~40℃。

优选地，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水的处理时，污水的盐度为0~15%。

更优选地，污水的盐度为0~5%。

本发明的有益效果为：

（1）本发明选育的门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水处理领域，在完全好氧的条件下，该菌株可分别利用NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮；其降解效率达到最高分别可达99.58%、99.99%、99.83%。

（2）本发明选育的门多萨假单胞菌A4同时具有异养硝化和好氧反硝化功能；可利用多种有机碳源的同时对高浓度的有机碳有很强的耐受性，具有较好的水体有机碳去除能力。该菌株尤其适合于高C/N的含氮污水的处理。

（3）本发明选育的门多萨假单胞菌A4能更好的利用有机底物，生长速度快，容易达到较高的生物量浓度，保持高脱氮率的同时实现有机碳的去除。

（4）本发明选育出的菌株不仅在高盐度下能进行较好的HNAD进程，还能有效的脱除磷酸盐。以往的耐盐研究中，盐度范围在0%~10%，而本实验的盐度范围为0%~15%，本发明分离出的菌株耐盐性能有了显著提升，在此盐度范围内的脱氮除磷效果不受影响。该菌不仅能应用于常规养殖水体盐度，而且有望用于高盐水体的脱氮除磷，一定程度上突破了盐度对微生物处理含盐废水处理的限制。

（5）本发明选育的门多萨假单胞菌A4能克服不同需氧量引起的硝化反硝化不相容问题，使硝化和反硝化作用在同一好氧反应器内同步进行成为可能。将该菌株运用于水产养殖水体的微生物脱氮工艺，有利于减少设备占地面积和建设成本，提高处理效率，还能大幅减少水产养殖过程中的周期性换水，具有良好的经济及环保效益，应用前景广阔。

附图说明

利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例的门多萨假单胞菌A4在营养琼脂平板上的菌落形态图；

图2为本发明实施例的门多萨假单胞菌A4的革兰氏染色图；

图3为本发明实施例的门多萨假单胞菌A4在不同有机碳源和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比图；

图4为本发明实施例的门多萨假单胞菌A4在不同C/N和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比图；

图5为本发明实施例的门多萨假单胞菌A4在不同P/N和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比图；

图6为本发明实施例的门多萨假单胞菌A4在不同pH和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比图；

图7为本发明实施例的门多萨假单胞菌A4在不同温度和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比图；

图8为本发明实施例的门多萨假单胞菌A4在不同盐度和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比图。

具体实施方式

为了更清楚的说明本发明，下面结合附图1-8及实施例，对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

本发明实验中NH₄ ⁺、NO₃ ^-、NO₂ ^-三种氮元素的测定与分析方法均参考于国标，其中：

NH₄ ⁺的测定与分析根据《水质-氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》（GB HJ535-2009）；

NO₃ ^-的测定与分析根据《水质-硝酸盐氮的测定-紫外分光光度法》（GB HJ/T346-2007）；

NO₂ ^-的测定与分析根据《水质-亚硝酸盐氮的测定-分光光度法》（GB 7493-87）；

PO₄ ^3--P采用钼酸铵分光光度法。

实施例

本实施例提供的具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株，所述的菌株为门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）A4，于2022年11月4日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo：62944。

该菌株具体是发明人团队在广东省内水产养殖池塘中采集、选育而得到的门多萨假单胞菌株，并使其具备在一定盐度条件下高效降解NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N以及PO₄ ^3—P的生物学特性，其为革兰氏染色阴性、菌落在营养琼脂上为白色不透明，表面隆起，呈圆形、光滑湿润而有闪光，边缘完整，菌体呈直杆状，无鞭毛；具有异养硝化功能和好氧反硝化功能。

该门多萨假单胞菌A4菌株的环境适应性良好且安全性高，因此在水产养殖尾水或其他含氮磷高盐污水的生物脱氮除磷处理方面具有良好的应用前景。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

结合以下多个具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

本实施例提供的一株同时具有异养硝化和好氧反硝化功能的门多萨假单胞菌A4菌株（GDMCC No：62944），其选育过程包括如下步骤：

1、样品采集

本发明的门多萨单胞菌A4原始菌株是从广东省珠海市斗门区南水产养殖池塘的水样以及泥样筛选分离得到；样品采集根据《土壤环境监测技术规范》（HJ/T 166-2004）中的“混合样品采集方法”，采用梅花点采样法定点取样，从养殖池塘中采集表层、中层以及深层水体和底泥于无菌采样袋中，4℃冷藏运输储藏备用。

2、培养基及溶液的配置

（1）盐溶液（g/L）：NaCl 2.5g, MgSO₄·7H₂O 2.5g, FeSO₄·7H₂O 0.05g,MnSO₄·4H₂O 0.05g；

（2）微量元素溶液（g/L）：MgSO₄·7H₂O 50.0g, CaCl₂5.5g, CuSO₄·5H₂O 1.57g,ZnSO₄·7H₂O 2.2g, FeSO₄, 5.0g, MnCl₂·4H₂O 5.06g, CoCl₂·6H₂O 1.60g, Na₂EDTA,50.0g；

（3）富集培养基（g/L）：5.62g 琥珀酸钠、0.087g KH₂PO₄、0.24g NaNO₃、0.165gNaNO₂、0.472g (NH₄)₂SO₄、50mL盐溶液；

（4）BTB培养基（g/L）：二水柠檬酸钠6.45g，1% BTB乙醇溶液1 mL， KH₂PO₄1.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.01g，Na₂HPO₄7.9g，NaNO₃0.8415g，NH₄Cl 0.192g，NaNO₂0.362g，微量元素溶液 2 mL，琼脂20g，pH 7.0～7.5；

（5）单一氮源发酵培养基（DMⅠ）（g/L）：5.62g 琥珀酸钠，0.087g KH₂PO₄、0.472g（NH₄）₂SO₄，微量元素溶液 2 mL，pH 7.0；

（6）单一氮源发酵培养基（DMⅡ）（g/L）：5.62g琥珀酸钠、0.087g KH₂PO₄、0.607gNaNO₃，微量元素溶液 2 mL，pH 7.0；

（7）单一氮源发酵培养基（DMⅢ）（g/L）：5.62g琥珀酸钠、0.087g KH₂PO₄、0.4928gNaNO₂，微量元素溶液 2 mL，pH 7.0。

实验所用到的基础培养基经121℃，20min高压蒸汽灭菌后使用。

实施例2

一株前述的门多萨单胞菌A4、使其同时具有异养硝化和好氧反硝化功能的选育方法，包括对门多萨单胞菌A4原始菌株的富集、分离与筛选等，具体包括如下步骤：

（1）样品预处理：取池塘底泥10g，在超净工作台内接入装有 90ml , 0.9%无菌生理盐水的 300mL 大口三角烧瓶中，并放入少许经过121℃高压蒸汽灭菌15min的玻璃珠，160r/min振荡1h以打散底泥样品，使泥样中的微生物充分悬浮于生理盐水中；水样同理；

（2）富集培养：取22.2mL上述混合液体（10^-1底泥）加入到装有200mL富集培养基的500mL锥形瓶中，摇床内30℃，160r/min 培养2~3天。水样则取10ml接种于含90 ml富集培养基的300mL大口三角烧瓶中，摇床内30℃，160r/min振荡1h；

（3）样品平板涂布：分别取（1）中经过预处理的水样和泥样原液1mL，于超净工作台内接入装有9mL无菌生理盐水的试管中，移液枪轻轻吹打或震荡混匀。从该试管取出1mL液体接入到新的装有9mL 无菌生理盐水的试管中，重复该操作，依次把10^-1底泥和水样原液梯度稀释为10^-2~10^-4浓度。分别取10^-1~10^-4浓度梯度的底泥和水样浓度的原液100µL~200µL，直接涂布于BTB平板培养基中，每个梯度设置3个平行组，1个空白对照组，在恒温生化培养箱中30℃倒置培养2~3天；

（4）样品富集液平板涂布：将（2）中的富集培养后的菌悬液梯度稀释，过程如下：从（2）中的锥形瓶中取1mL菌悬液接入装有9mL无菌生理盐水的试管中，充分混匀，即稀释浓度为10^-1。再从此试管中吸取1mL液体接入到新的装有9mL 无菌生理盐水的试管中混匀，重复此步骤，依次稀释达到10^-2~10^-8浓度梯度。然后从每个浓度梯度的混合液中各取100µL~200µL，分别涂布于提前制作好的BTB固体平板培养基上，标明稀释梯度与日期，在生化培养箱中30℃倒置培养2~3天；

（5）分离纯化：用接种环挑取上述不同形态的菌落。采用平板划线分离法在BTB固体平板培养基上划线进行分离纯化，划线后平板于超净工作台内敞小口正置于室温下5分钟后倒置于恒温生化培养箱内30℃培养2~3天。重复此步骤，挑取单菌落反复划线纯化3~4次。观察没有形态异常菌落后挑取单菌落经过结晶紫单染色后于显微镜下镜检验纯（100倍油镜）；

（6）点接初筛：使用接种针挑取纯化后菌株点接于BTB反硝化鉴定培养基中培养2~3天。根据菌落生长情况和菌落周围BTB培养基中蓝色晕圈大小挑选出反硝化能力高的菌株，通常来说蓝色晕圈越大，反硝化能力越高。接种于斜面30℃恒温培养2~3天后试管置于4℃保藏；

（7）硝化与反硝化性能复筛：用接种环取上述得到的菌株3环活化斜面接种于营养肉汤中，摇床30℃，160r/min培养1天，测定其OD₆₀₀。再以1%的接种量分别接种至富集培养基中，30℃，160r/min震荡培养，0h、12h、24h、36h、48h取培养液测其OD₆₀₀。12000rpm，4℃低速离心5min后取上清液，分别测定NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N以及PO₄ ^3--P的含量，选取生物学特性最优的作为门多萨单胞菌A4。

实施例3

对门多萨单胞菌复筛菌株中筛选出的，能够同时具有异养硝化和好氧反硝化功能的门多萨单胞菌A4菌株（以下简称菌株A4），进行生物学等相关特性鉴定的步骤包括：

（1）形态学鉴定：经过上述筛选分离后得到一株异养硝化-好氧反硝化菌株A4，该菌株革兰氏反应阴性，直杆状，无鞭毛；菌落在营养琼脂上为白色不透明，表面隆起，呈圆形、光滑湿润而有闪光，边缘完整。

（2）分子生物学鉴定：菌株WM32的DNA提取采用Takara Lysis Buffer forMicroorganism to Direct PCR裂解酶。以此模板扩增其16S rDNA，扩增采用一对通用引物：上游引物（27F）：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物（1492R）：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'。通用引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系（25μL）：2×Unique^TMTaq Master Mix（With Dye） 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O 9.5μL。PCR程序如下：①94℃，5 min；②94℃预变性，1min；③55℃退火，1min；④72℃延伸1.5min；⑤72℃，10min；②~④循环30次。1%琼脂糖凝胶电泳分析结果。PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成。

经过上述筛选、培育、分离后得到，一株生物学特性最优而且性状稳定的异养硝化-好氧反硝化菌株，即为门多萨单胞菌A4，该菌株的生理生化特征等见下表1。

表1

注：“+”为阳性；“-”为阴性。

经过上述筛选步骤后得到一株异养硝化-好氧反硝化菌株A4。综合其16S rDNA、细菌形态、菌落形态以及生理生化等各项鉴定项目，判断菌株A4为门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）。

实施例4

前述的同时具有异养硝化和好氧反硝化功能的门多萨假单胞菌A4（以下简称菌株A4），将其应用于污水处理领域，对其最优生长及脱氮条件的测试和验证，包括如下步骤：

（1）不同有机碳源对菌株A4生长及脱氮性能影响

选择蔗糖、琥珀酸钠、葡萄糖以及柠檬酸钠四种碳源，固定C/N=10，30℃、160r/min、pH=7.0。以DM发酵培养基为基础，蔗糖、琥珀酸钠、葡萄糖以及柠檬酸钠四种有机碳源每升培养基加入量分别为5.00g、5.62g、2.50g、4.08g；作为单一无机氮源的(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NaNO₂每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养1天，再以1%的接种量，分别接入不同有机碳源的上述反硝化培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD₆₀₀，5000r/min，4℃，低速离心5~10min后取上清分别测定NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N三种氮元素以及PO₄ ^3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析选择蔗糖、琥珀酸钠、葡萄糖以及柠檬酸钠四种不同的有机碳源对菌株A4生长情况及脱氮除磷效果的影响。

图3 为门多萨假单胞菌A4在不同碳源条件下氮磷元素的去除情况；其中：（a）氨态氮及磷酸盐去除率；（b）硝酸盐及磷酸盐去除率；（c）亚硝酸盐及磷酸盐去除率。

（2）不同C/N对菌株A4生长及脱氮性能影响

选择琥珀酸钠作为反硝化培养基碳源，固定30℃、160r/min、P/N=0.2、pH=7.0等条件，设置C/N梯度为0、2、5、10、15。每种梯度的培养基琥珀酸钠加入量为0g/L、1.125g/L、2.812g/L、5.62g/L、8.44g/L；作为单一无机氮源的(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NaNO₂每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养1天，再以1%的接种量，分别接入上述培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD₆₀₀，5000r/min，4℃低速离心5~10min后取上清分别测定NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N三种氮元素以及PO₄ ^3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析0、2、5、10、15五种不同的C/N对菌株A4生长情况及脱氮除磷效果的影响。

图4为门多萨假单胞菌A4在不同C/N比的条件下氮磷元素的去除情况，其中：（a）、氨态氮及磷酸盐去除率；（b）、硝酸盐及磷酸盐去除率；（c）、亚硝酸盐及磷酸盐去除率。

图5为门多萨假单胞菌A4在不同P/N比的条件下氮磷元素的去除情况，其中，（a）氨态氮及磷酸盐去除率；（b）硝酸盐及磷酸盐去除率；（c）亚硝酸盐及磷酸盐去除率。

（3）不同C/N对菌株A4生长及脱氮性能影响

选择琥珀酸钠作为反硝化培养基碳源，固定30℃、160r/min、C/N=10、pH=7.0等条件，设置P/N梯度为0、0.1、0.2、0.5、1。每种梯度的培养基KH₂PO₄加入量为0.0000g/L、0.0430g/L、0.0870g/L、0.2193g/L、0.4387g/L；作为单一无机氮源的(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NaNO₂每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养1天，再以1%的接种量，分别接入上述培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD₆₀₀，5000r/min，4℃低速离心5~10min后取上清分别测定NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N三种氮元素以及PO₄ ^3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析0、0.1、0.2、0.5、1五种不同的P/N对菌株A4生长情况及脱氮除磷效果的影响。

（4）不同pH对菌株A4生长及脱氮性能影响

固定C/N=10，P/N=0.2、30℃、160r/min、琥珀酸钠为单一有机碳源等条件，设置pH梯度为5、6、7、8、9。作为单一无机氮源的(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NaNO₂每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养1天，再以1%的接种量，分别接入上述培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD₆₀₀，5000r/min，4℃低速离心5~10min后取上清分别测定NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N三种氮元素以及PO₄ ^3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析5、6、7、8、9五种不同的pH对菌株A4生长情况及脱氮除磷效果的影响。

图6为门多萨假单胞菌A4在不同pH的条件下氮磷元素的去除情况，其中：氨态氮及磷酸盐去除率（a）；硝酸盐及磷酸盐去除率（b）；亚硝酸盐及磷酸盐去除率（c）。

（5）不同温度对菌株A4生长及脱氮性能影响

固定C/N=10、pH=7.0、160r/min、柠檬酸钠为单一有机碳源等条件，设置温度梯度为25℃、30℃、35℃、40℃。作为单一无机氮源的(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NaNO₂每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养1天，再以1%的接种量，分别接入上述培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD₆₀₀，5000r/min，4℃低速离心5~10min后取上清分别测定NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N三种氮元素以及PO₄ ^3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析25℃、30℃、35℃、40℃四种不同的温度对菌株A4生长情况及脱氮除磷效果的影响。

图7为门多萨假单胞菌A4在不同温度的条件下氮磷元素的去除率情况，其中：（a）氨态氮及磷酸盐去除率；（b）硝酸盐及磷酸盐去除率；（c）亚硝酸盐及磷酸盐去除率。

（6）不同盐度对菌株A4生长及脱氮性能影响

固定C/N=10、P/N=0.2、pH=7.0、160r/min、琥珀酸钠为单一有机碳源等条件，设置盐度梯度为0%、3%、5%、10%、15%。盐度通过额外添加NaCl来控制，其每升对应的添加量为0g、3g、5g、10g、15g。作为单一无机氮源的(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NaNO₂每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养1天，再以1%的接种量，分别接入上述培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD₆₀₀，5000r/min，4℃低速离心5~10min后取上清分别测定NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N三种氮元素以及PO₄ ^3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析0%、3%、5%、10%、15%五种不同的盐度对菌株A4生长情况及脱氮除磷效果的影响。

图8为门多萨假单胞菌A4在不同盐度的条件下氮磷元素的去除率情况：氨态氮及磷酸盐去除率（a）；硝酸盐及磷酸盐去除率（b）；亚硝酸盐及磷酸盐去除率（c）。

通过实施例4（图3-图8）和实施例3（表1）可以看出，门多萨假单胞菌A4能够用柠檬酸钠、琥珀酸钠等多种有机碳源生长。利用琥珀酸钠生长时，生长情况和氮磷的去除效果最好。在C/N为0~15、P/N为0~1、pH为6~9、温度为25℃~40℃下都能生长，在C/N为0时，菌株A4仍能进行生长，说明其能通过聚磷和释磷来进行能量代谢，当P/N为0时，氮的去除效果明显不如P/N比为0.1时，说明P为菌株A4生长代谢必备元素。最佳脱氮条件为碳源使用琥珀酸钠、C/N=10、P/N=0.2、pH=7、T=30℃。菌株A4脱氮效率分别为99.58%、99.99%、99.83%，其对应磷的去除率分别为95.96%、88.28%、94.69%。最佳脱氮除磷条件下，盐度从0%升高至5%，其对应的氮磷元素去除率在统计学上没有显著性差异，说明其对盐度具有很好的耐受性。

将本发明选育的门多萨假单胞菌A4应用于含盐的氮磷水产养殖尾水处理领域，对水产养殖对象无不良影响，具有较高的水生生物生物安全性，适宜在大多数的养殖水体应用；该菌株同时具有异养硝化好氧反硝化以及脱磷功能；可利用多种有机碳源的同时对高浓度的有机碳以及盐度有很强的耐受性，具有较好的水体有机碳去除能力。该菌株尤其适合于高C/N的含氮污水的处理；在完全好氧的条件下，该菌株可分别利用NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮；该菌株能克服不同需氧量引起的硝化反硝化不相容问题，使硝化和反硝化作用在同一好氧反应器内同步进行成为可能，具有良好的经济及环保效益，应用前景广阔。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株，其特征在于，该菌株为门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）A4，于2022年11月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo：62944。

2.一种具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株的应用，其特征在于，将权利要求1所述的门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）A4应用于污水处理领域。

3.根据权利要求2所述的具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株的应用，其特征在于，所述污水的碳源为柠檬酸钠、琥珀酸钠、蔗糖和葡萄糖中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株的应用，其特征在于，污水的碳源为琥珀酸钠。

5.根据权利要求2所述的具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水的处理时，污水的C/N为0~15。

6.根据权利要求2所述的具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水的处理时，污水的C/N为10。

7.根据权利要求2所述的具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水的处理时，污水的P/N（磷/氮）为0~1。

8.根据权利要求2所述的具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水的处理时，污水的pH值为5~9。

9.根据权利要求2所述的具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌A4应用于含氮磷污水的处理时，污水的温度为25℃~40℃。

10.根据权利要求2所述的具有耐盐特性的异养硝化好氧反硝化脱氮除磷菌株的应用，其特征在于，污水的盐度为0~15%。