CN113683203B - 全海假单胞菌在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用 - Google Patents

全海假单胞菌在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了全海假单胞菌在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用。本发明的全海假单胞菌WM33应用于咸淡水含氮水产养殖尾水处理领域，上述全海假单胞菌具有广盐性，可应用于去除咸淡水养殖尾水中的
Figure DDA0003163764050000011
三种无机氮元素。具有脱氮效率高、水生生物安全性高、环境安全性高等特点，在咸淡水养殖尾水的脱氮处理方面具有极大的应用价值。

Description

全海假单胞菌在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用
技术领域：
本发明属于养殖尾水处理领域，具体涉及具有全海假单胞菌在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用。
背景技术：
养殖尾水处理是制约水产绿色发展的重要因素。水体中
Figure GDA0003288936060000011
以及
Figure GDA0003288936060000012
浓度偏高会对水体中的养殖对象产生毒害效应，亦是养殖尾水水质超标的最重要组份。开展生物脱氮应用研究意义重大。
珠海市水产养殖经济总量占全市农业经济的70％。珠海市斗门区花鲈养殖面积18.89万亩，水产品总产量24.5万吨，渔业总产值达64.5亿元，是珠海市渔业经济的主产区。咸淡水养殖水体具有盐度交替变化的特点，特殊的水质条件使得水产动物肉质鲜嫩、品质较高。斗门区白蕉镇“白蕉海鲈”是中国国家地理标志产品之一，2018年，养殖面积3万亩，产量12.28万吨，年产量约占全国的47％。也正是因为养殖水体咸淡水交替，使得现有的尾水高效脱氮应用受到一定限制，开发出盐度适应范围广、脱氮效率高的菌株对于咸淡水养殖水体具有重要的作用。
发明内容：
本发明的目的是提供全海假单胞菌(Pseudomonas perfectomarina)WM33在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用。
优选，所述的咸淡水是咸淡水养殖尾水。
优选，所述的脱氮是去除咸淡水含氮污水中的
Figure GDA0003288936060000013
三种无机氮元素。
优选，是在咸淡水含氮污水中接种全海假单胞菌WM33，进行培养，对污水脱氮。
优选，所述的咸淡水含氮污水的pH值为6～7。
优选，所述的培养，温度为15℃～35℃。
优选，所述的咸淡水含氮污水的中C/N为10～40。
优选，所述的咸淡水含氮污水的盐度生长范围为0～12‰。
优选，所述的培养为碳源使用柠檬酸钠、C/N＝10、pH＝7、T＝35℃、SAL＝0～12‰。
本发明所说的咸淡水指的是盐度介于淡水与海水之间的水域，大多见于河海交汇处。涨潮、退潮带来的盐度波动。
本发明的全海假单胞菌WM33应用于咸淡水含氮水产养殖尾水处理领域，上述全海假单胞菌具有广盐性，可应用于去除咸淡水养殖尾水中的
Figure GDA0003288936060000021
三种无机氮元素。具有脱氮效率高、水生生物安全性高、环境安全性高等特点，在咸淡水养殖尾水的脱氮处理方面具有极大的应用价值。
Pseudomonas perfectomarina WM33保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070，保藏号：GDMCC No：61718。
附图说明：
图1为本发明的全海假单胞菌WM33在营养琼脂平板上的菌落形态图；
图2为本发明的全海假单胞菌WM33的扫描电镜图及菌体大小统计结果图；
图3为本发明的全海假单胞菌WM33的革兰氏染色结果图；
图4为本发明的全海假单胞菌WM33的鱼类毒性试验结果图；
图5为本发明的全海假单胞菌WM33的常用抗生素耐药性实验结果图；
图6为本发明的全海假单胞菌WM33在不同有机碳源和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图；
图7为本发明的全海假单胞菌WM33在不同pH和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图；
图8为本发明的全海假单胞菌WM33在不同C/N和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图；
图9为本发明的全海假单胞菌WM33在不同温度和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图；
图10为本发明的全海假单胞菌WM33在不同盐度梯度和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图；
图11为本发明在广东省珠海市斗门区昭信村健康养殖与尾水治理研究示范区(东经E:113°36′41″，北纬N:22°19′84″)取样现场图；
图12为本发明的全海假单胞菌WM33在广东省珠海市斗门区昭信村健康养殖与尾水治理研究示范区的实际咸淡水尾水中脱氮处理应用结果图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实验中
Figure GDA0003288936060000031
三种氮元素的测定与分析方法均参考于国标，其中
Figure GDA0003288936060000032
的测定与分析根据《水质-氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》(GB HJ535-2009)；
Figure GDA0003288936060000033
的测定与分析根据《水质-硝酸盐氮的测定-紫外分光光度法》(GB HJ/T346-2007)；
Figure GDA0003288936060000034
的测定与分析根据《水质-亚硝酸盐氮的测定-分光光度法》(GB 7493-87)。
实验所用到的基础培养基使用121℃，20min高压蒸汽灭菌，其配方如下：
微量元素溶液(g/L)：EDTA 50g，ZnSO4·7H2O 5.02g，CuSO4·5H2O 1.57g，FeSO4·7H2O 5.0g，CoCl2·6H2O 1.61g，(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1g，CaCl2·2H2O 5.5g，MnCl2·4H2O5.06g，pH 6.0；
富集培养基(g/L)：KH2PO4 1.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，Na2HPO4 7.9g，二水柠檬酸钠6.45g，NaNO3 0.8415g，NH4Cl 0.192g，NaNO2 0.362g，微量元素溶液2mL，pH 7.2；
BTB固体培养基(g/L)：二水柠檬酸钠6.45g，1％BTB(溴麝香草酚蓝)乙醇溶液1mL，KH2PO4 1.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，Na2HPO4 7.9g，NaNO3 0.8415g，NH4Cl 0.192g，NaNO20.362g，微量元素溶液2mL，琼脂20g，pH 7.0～7.5；
单一氮源发酵培养基(DMⅠ)(g/L)：二水柠檬酸钠6.45g，KH2PO4 1.5g，MgSO4·7H2O0.01g，Na2HPO4 7.9g，NH4Cl 0.6036g，微量元素溶液2mL，pH 7.0；
单一氮源发酵培养基(DMⅡ)(g/L)：二水柠檬酸钠6.45g，MgSO4·7H2O 0.01g，KH2PO4 1.5g，Na2HPO4 7.9g，NaNO3 0.9590g，微量元素溶液2mL，pH 7.0；
单一氮源发酵培养基(DMⅢ)(g/L)：二水柠檬酸钠6.45g，KH2PO4 1.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，Na2HPO4 7.9g，NaNO2 0.375g，微量元素溶液2mL，pH 7.0。
实施例1
一、样品采集
样品采集根据《土壤环境监测技术规范》(HJ/T 166-2004)中的“混合样品采集方法”，采用梅花点采样法定点取样，从淡水养殖池塘中采集表层、中层以及深层水体和底泥于无菌采样袋中，4℃冷藏运输储藏备用。
二、菌株富集、分离与筛选
底泥样品接入无菌生理盐水，经玻璃珠振荡1h打散，使微生物充分悬浮于生理盐水中。将上述混合液体加入到富集培养基中培养2～3天。每天向富集培养基中加入1mL浓度为质量百分比5％的NH4Cl溶液以保持培养基内
Figure GDA0003288936060000051
离子浓度。取经富集后的样品1mL，于超净工作台内接入装有9mL无菌生理盐水的试管中，移液枪轻轻吹打或震荡混匀。从该试管取出1mL液体接入到新的装有9mL无菌生理盐水的试管中，重复该操作，依次把富集液梯度稀释为10-2～10-8浓度。分别取10-2～10-8浓度梯度的液体100μL～200μL，涂布于BTB平板培养基中，每个梯度设置3个平行组，1个空白对照组，标明稀释梯度与日期，在恒温生化培养箱中30℃倒置培养2～3天。用接种环挑取上述不同形态的菌落。采用平板划线分离法在BTB固体平板培养基上划线进行分离纯化，划线后平板于超净工作台内敞小口正置于室温下5分钟后倒置于恒温生化培养箱内30℃培养2～3天。重复此步骤，挑取单菌落反复划线纯化3～4次。观察没有形态异常菌落后挑取单菌落经过结晶紫单染色后于显微镜下镜检验纯(100倍油镜)；点接初筛：使用接种针挑取纯化后菌株点接于BTB固体平板培养基中培养2～3天。根据菌落生长情况和菌落周围BTB培养基中蓝色晕圈大小挑选出反硝化能力高的菌株，通常来说蓝色晕圈越大，反硝化能力越高。接种于斜面30℃恒温培养2～3天后试管置于4℃保藏。硝化与反硝化性能复筛：用接种环取上述得到的菌株3环活化斜面接种于营养肉汤中，摇床30℃，180r/min培养1天，测定其OD600。再以1％(v/v)的接种量分别接种至以NH4Cl、NaNO3以及NaNO2作为唯一无机氮源的DMⅠ、DMⅡ以及DMⅢ发酵培养基中，30℃，180r/min震荡培养，0h、24h、48h取培养液测其OD600。5000r/min，5min低速离心后取上清液，分别测定
Figure GDA0003288936060000052
三种氮元素含量。纯化获得菌株WM33。
三、菌株的种属鉴定
菌株WM33的DNA提取后采用通用引物(上游引物(27F)：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物(1492R)：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3')扩增其16S rDNA。PCR反应体系(25μL)：2×UniqueTM Taq Master Mix(With Dye)12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR程序如下：①94℃，5min；②94℃预变性，1min；③55℃退火，1min；④72℃延伸1.5min；⑤72℃，10min；②～④循环30次。1％琼脂糖凝胶电泳分析结果。PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成。
菌株WM33的16s rDNA序列长度为1441bp，核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1所示)：
GGCATGGCGGCAGCTACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTCCGAAAGGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTACCACGGTGGATCAGATGC。
该菌株革兰氏反应阴性，菌体长为1.43±0.28μm，宽为0.54±0.04μm，直杆状，无鞭毛(如图2所示)；菌落(如图1所示)在营养琼脂上为白色不透明，表面隆起，呈圆形、光滑湿润而有闪光，边缘完整。革兰氏反应阴性(如图3所示)。其生理生化特征如表1所示。
表1 菌株生理生化特征
Figure GDA0003288936060000071
Figure GDA0003288936060000081
注：“+”为阳性；“-”为阴性
综合菌株WM33的16s rDNA、细菌形态、菌落形态以及生理生化等各项鉴定项目，判断菌株为全海假单胞菌(Pseudomonas perfectomarina)。菌株保藏于：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏名：Pseudomonas perfectomarina WM33，保藏号：GDMCC No：61718。尚无以全海假单胞菌(Pseudomonas perfectomarina)净化咸淡水养殖尾水或其他含氮污水中无机氮的相关报道。
四、全海假单胞菌WM33环境安全评价
鱼类毒性试验：选取体长在3±1cm范围内，健康的斑马鱼(Danio rerio)(购置于广东省广州市荔湾区芳村花地湾的广州花地湾花鸟鱼虫批发市场)，于持续曝气的大水体中暂养30～45天，期间正常喂食与定期换水。状态稳定后随机分配到15L玻璃缸中，设置加入菌液的实验组和加入等体积无菌水的对照组，每个实验组30条斑马鱼，每组设置3个重复。取过夜培养的菌液，3000r/min，5min离心后弃上清，用无菌PBS缓冲液重悬，重复1～2次后用灭菌水悬浮，根据测定的标准曲线得到OD600与菌浓度之间的关系，调节实验水体中菌量约1×106CFU/mL，空白对照组则加入等量的灭菌水。实验期间，实验对象正常喂养且每三天对实验水体进行完全更换，换水后重复上述方法分别加入菌液和灭菌水，记录下每个组斑马鱼存活率，实验持续10d。
常用抗生素耐药性实验：抗生素耐药性实验(抗生素纸片药敏试验)评判标准根据《抗菌药物敏感性试验的技术要求》(WS/T 639-2018)(见表2)，实验方法依据上述标准中的“纸片扩散法”要求进行。具体步骤如下：
配制MHA(广东环凯微生物科技有限公司)平板，校正pH 7.2～7.4；
使用打孔器和定性滤纸打出直径约6mm的纸片，灭菌后干燥备用；
根据抗菌药物种类制作对应药物含量的纸片；
取菌株分别接种于营养肉汤培养基中，30℃，180r/min培养至对数期；
取100～150μL菌液在MHA平板上均匀涂布，室温干燥5min；
用无菌镊子将含有抗生素的纸片贴于MHA平板中央，每个实验重复3次，另设置3个含有无菌水的纸片贴于MHA平板中央作为空白对照；
15min内倒置平板，于30℃恒温培养18h；
使用IP54金属壳数显游标卡尺(永康市晶思达贸易有限公司)测量抑菌圈直径；
表2 抗生素耐受性评判标准
Figure GDA0003288936060000091
Figure GDA0003288936060000101
鱼类毒性试验中，在正常条件下养殖10天，对照组斑马鱼存活率为100％，实验组含菌量约为106CFU/mL，高于常见病原菌的致病剂量(104CFU/mL)。实验组斑马鱼存活率高于99％，与对照组无显著差异(p>0.05)。初步判断全海假单胞菌WM33具有较高的水生生物生物安全性(见图4)。菌株WM33抗生素耐药性实验结果显示(见表3和图5)，全海假单胞菌WM33对所使用的多种常见临床抗生素皆表现为敏感(图5)，表明其生态安全性较高。实验同时为做好菌株使用环节中的防范和应急措施提供指导。
表3 抗生素耐药性实验
Figure GDA0003288936060000102
五、全海假单胞菌WM33最优生长及脱氮条件
(1)不同有机碳源对全海假单胞菌WM33生长及脱氮性能影响
选择草酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠以及柠檬酸钠四种碳源，固定C/N＝10，30℃、180r/min、pH＝7.0。以DM发酵培养基为基础，草酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠四种有机碳源每升培养基加入量分别为0.67g、0.81g、0.41g、1.29g；作为单一无机氮源的NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入不同有机碳源的上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h取培养液测定其OD600，5000r/min，5～10min低速离心后取上清分别测定
Figure GDA0003288936060000111
Figure GDA0003288936060000112
三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析选择草酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠以及柠檬酸钠四种不同的有机碳源对全海假单胞菌WM33生长情况及好氧反硝化作用的影响。
(2)不同C/N对全海假单胞菌WM33生长及脱氮性能影响
选择柠檬酸钠作为反硝化培养基碳源，固定30℃、180r/min、pH＝7.0等条件，设置C/N梯度为10、20、30、40。每种梯度的培养基柠檬酸钠加入量为1.29g/L、2.58g/L、3.87g/L、5.16g/L；作为单一无机氮源的NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h取培养液测定其OD600，5000r/min，5～10min低速离心后取上清分别测定
Figure GDA0003288936060000113
三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析10、20、30、40四种不同的C/N对全海假单胞菌WM33生长情况及好氧反硝化作用的影响。
(3)不同pH对全海假单胞菌WM33生长及脱氮性能影响
固定C/N＝10，30℃、180r/min、柠檬酸钠为单一有机碳源等条件，设置pH梯度为5、6、7、8、9。作为单一无机氮源的NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h取培养液测定其OD600，5000r/min，5～10min低速离心后取上清分别测定
Figure GDA0003288936060000121
三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析5、6、7、8、9四种不同的pH对全海假单胞菌WM33生长情况及好氧反硝化作用的影响。
(4)不同温度对全海假单胞菌WM33生长及脱氮性能影响
固定C/N＝10、pH＝7.0、180r/min、柠檬酸钠为单一有机碳源等条件，设置温度梯度为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃。作为单一无机氮源的NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h取培养液测定其OD600，5000r/min，5～10min低速离心后取上清分别测定
Figure GDA0003288936060000122
三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析15℃、20℃、25℃、30℃、35℃五种不同的温度对全海假单胞菌WM33生长情况及好氧反硝化作用的影响。
(5)不同盐度对全海假单胞菌WM33生长及脱氮性能影响
固定C/N＝10、pH＝7.0、180r/min、T＝30℃柠檬酸钠为单一有机碳源等条件，通过改变与调整培养基中NaCl的浓度，设置培养基盐度梯度为0‰、4‰、8‰、12‰。作为单一无机氮源的NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h取培养液测定其OD600，5000r/min，5～10min低速离心后取上清分别测定
Figure GDA0003288936060000131
Figure GDA0003288936060000132
三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析0‰、4‰、8‰、12‰四种不同的盐度对全海假单胞菌WM33生长情况及脱氮作用的影响。
通过(图6)和(表1)可以看出，全海假单胞菌WM33能够用柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠等多种有机碳源生长。利用琥珀酸钠和乙酸钠生长时，平台期的最大生物量不如柠檬酸钠高。最适宜的生长和脱氮的pH为6-7(图7)；在C/N为10-40范围内皆能生长且降解三种无机氮，随着C/N条件在10-40的范围内递增，全海假单胞菌WM33对于
Figure GDA0003288936060000133
的降解能力逐步受到抑制(图8)；温度梯度实验表明，全海假单胞菌WM33在T＝25-35℃时的生长速度和无机氮降解效率明显要大于T＝15-20℃(图9)；盐度梯度实验中，菌株WM33在0～12‰的盐度范围内，生长速度和无机氮降解效率皆不受影响(图10)，说明菌株WM33对盐度的适应范围广。全海假单胞菌WM33在C/N为10～40、pH为6～7、温度为15℃～35℃下都能生长，C/N、温度和盐度适应范围较大、盐度生长范围为0～12‰。15℃下生长速度减缓。在10～40范围内，C/N越高，对其硝酸盐利用的抑制作用逐步提高。pH＝5、15℃～20℃时生长缓慢。C/N大于20时不影响其生长却能抑制其对硝酸盐的降解。综上所述，全海假单胞菌WM33最佳脱氮条件为碳源使用柠檬酸钠、C/N＝10、pH＝7、T＝35℃、SAL＝0～12‰。
Figure GDA0003288936060000134
Figure GDA0003288936060000135
降解率最高可分别达到76.0％、92.1％、88.0％。
(6)全海假单胞菌WM33处理咸淡水养殖尾水的应用
采集珠海市斗门区昭信村咸淡水养殖区养殖池塘与生态沟渠的水样(图11)，现场使用光学盐度计测量取样点水质的盐度值。4℃冷藏运输回实验室备用，并于当天完成水样的无机氮元素指标测定。分别取60-100mL养殖池塘与生态沟渠的水样，过滤去除固体颗粒与悬浮物后，使用0.22μm/25mm针头式过滤器过滤灭菌，转移至经过高压蒸汽灭菌的锥形瓶内备用。取菌株WM33接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min活化18h，再以1％(v/v)的接种量将处于对数期的菌液分别接入两种水样中，30℃，180r/min震荡培养。于0h、12h、24h、48h、72h取水样测定其OD600，5000r/min、5～10min低速离心后取上清分别测定
Figure GDA0003288936060000142
Figure GDA0003288936060000143
三种氮元素含量。
经分析，咸淡水养殖区养殖池塘与生态沟渠的基本水质数据均值如表4所示。
表4 咸淡水养殖区水质数据
Figure GDA0003288936060000141
由于养殖区的生态沟渠与昭信村河涌相连接，水体受涨落潮影响，盐度交替变化(图11)。通过图12可以知道，全海假单胞菌WM32能同时适应盐度为2‰的养殖池塘水体和盐度值为8‰的生态沟渠养殖尾水，能在其中生长并降解净化水体的无机氮。
利用全海假单胞菌WM32处理72h后，养殖池塘水样中的
Figure GDA0003288936060000144
降解率最高可分别达到62.0％、96.6％、85.5％，期间无
Figure GDA0003288936060000145
积累；生态沟渠养殖尾水水样中的
Figure GDA0003288936060000147
降解率最高可分别达到47.9％、94.7％、84.1％，期间无
Figure GDA0003288936060000146
积累(图12)。
本发明的全海假单胞菌WM33应用于含氮水产养殖尾水处理领域，上述全海假单胞菌具有广盐性，可应用于去除咸淡水养殖尾水中的
Figure GDA0003288936060000148
三种无机氮元素。具有脱氮效率高、水生生物安全性高、环境安全性高等特点，在咸淡水养殖尾水的脱氮处理方面具有极大的应用价值。
上述实施例并不是对本发明的实施例进行限定，而是为了说明本发明所作的举例。对于熟知该领域的研究人员而言，在上述实施例的基础上仍可做出其他变动和润饰。凡是属于本发明的实施例或技术方案范围内所作出的引申或改动仍处于本发明的专利涵盖范围之列。。
序列表
<110> 广东省农业科学院动物科学研究所
<120> 全海假单胞菌在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1442
<212> DNA
<213> 全海假单胞菌WM33(Pseudomonas perfectomarina)
<400> 1
ggcatggcgg cagctacaca tgcaagtcga gcggatgacg ggagcttgct ccttgattca 60
gcggcggacg ggtgagtaat gcctaggaat ctgcctggta gtgggggaca acgttccgaa 120
aggggcgcta ataccgcata cgtcctacgg gagaaagtgg gggatcttcg gacctcacgc 180
tatcagatga gcctaggtcg gattagctag ttggtgaggt aaaggctcac caaggcgacg 240
atccgtaact ggtctgagag gatgatcagt cacactggaa ctgagacacg gtccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc 360
gcgtgtgtga agaaggtctt cggattgtaa agcactttaa gttgggagga agggcagtaa 420
gttaatacct tgctgttttg acgttaccga cagaataagc accggctaac tctgtgccag 480
cagccgcggt aatacagagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcgcg 540
taggtggttc gttaagttgg atgtgaaagc cccgggctca acctgggaac tgcatccaaa 600
actggcgagc tagagtatgg tagagggtgg tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt 660
agatatagga aggaacacca gtggcgaagg cgaccacctg gactgatact gacactgagg 720
tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780
tcaactagcc gttggaatcc ttgagatttt agtggcgcag ctaacgcatt aagttgaccg 840
cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900
gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggcct tgacatgcag 960
agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactctg acacaggtgc tgcatggctg 1020
tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct 1080
tagttaccag cacgttatgg tgggcactct aaggagactg ccggtgacaa accggaggaa 1140
ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc ttacggcctg ggctacacac gtgctacaat 1200
ggtcggtaca gagggttgcc aagccgcgag gtggagctaa tctcacaaaa ccgatcgtag 1260
tccggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgaatca 1320
gaatgtcgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt 1380
gggttgcacc agaagtagct agtctaacct tcgggaggac ggtaccacgg tggatcagat 1440
gc 1442

Claims (9)

1.全海假单胞菌(Pseudomonas perfectomarina)WM33在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用，所述的全海假单胞菌WM33保藏号：GDMCC No：61718。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的咸淡水是咸淡水养殖尾水。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的脱氮是去除咸淡水含氮污水中的
Figure FDA0003163764020000011
三种无机氮元素。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在咸淡水含氮污水中接种全海假单胞菌WM33，进行培养，对污水脱氮。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的咸淡水含氮污水的pH值为6～7。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的培养，温度为15℃～35℃。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的咸淡水含氮污水的中C/N为10～40。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的咸淡水含氮污水的盐度范围为0～12‰。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的培养为碳源使用柠檬酸钠、C/N＝10、pH＝7、T＝35℃、SAL＝0～12‰。
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