CN110951658A - 一株假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株假单胞菌及其应用，一株假单胞菌，命名为假单胞菌GWAQ‑11，分类命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20191063，保藏日期为2019年12月18日，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山（武汉大学）。本发明菌株对亚硝态氮具有高效的亚硝酸盐降解能力，即使在无有机碳源（C/N=0）条件下进行亚硝酸盐降解，亚硝态氮降解速率达8.3mg‑NO2‑N/L·h，即能在24h将200mg/L的亚硝态氮完全去除；且水产养殖及污水处理过程中无需额外投加有机碳源，大大降低了废水处理成本。本发明菌株在有有机碳源（C/N＞0）条件下进行亚硝酸盐降解，亚硝态氮降解速率达20mg‑NO2‑N/L·h，能在20h将400mg/L的亚硝态氮完全去除，是一般微生物制剂的1.68倍，亚硝酸盐降解能力明显提高。

Description

一株假单胞菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-1及其应用。
背景技术
随着我国高密度水产养殖的快速发展，大量富含高蛋白的优质饲料被投入养殖水体，导致养殖水体中残留有机物、代谢废物大量富集，远远超过养殖水体自净能力，养殖水体恶化严重，病害频发。水体中大量含氮有机物的富集，导致水体铵氮、亚硝酸盐等有害物质大量产生，其中高浓度的亚硝酸盐可与养殖动物血液中载氧血红蛋白结合，降低血液输氧能力，严重影响养殖动物的摄食、生长，甚至造成养殖动物。因此，如何经济、高效地实现养殖水体中亚硝酸盐去除，已成为水产养殖水质调控的重点研究内容。
目前养殖水体中降解亚硝酸盐的方法主要有：物理性的换水、吸附，化学性的氧化还原制剂以及投加微生物制剂。换水、吸附方法存在用量大、成本高的确定。投加化学性的氧化还原剂，虽然降解亚硝酸盐迅速，但存在残留、药物用量大、维持时间短、易反弹、环保性能差及药害等不足。微生物制剂降解亚硝酸盐相比于物理、化学处理方法，具有环保、无残留、降解温和等优点。但是到目前为止，水产养殖微生物亚硝酸盐降解制剂主要以芽孢杆菌、乳酸菌、EM菌等为主，普遍存在起效慢、作用效果不稳定的不足，无法满足水产养殖行业需求。因此急需开发一种高效稳定降解亚硝酸盐的亚硝酸盐降解微生物菌剂产品。
中国专利CN 104911130 A公开了一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其应用。具体涉及一株盐单胞菌CYQ1-6-1，及该菌在高浓度亚硝酸盐废水、含氮废水生物脱氮、水产养殖亚硝酸盐去除中的应用。该菌接种至MA固体平板上，28℃培养24h后，刮取菌体制备成109/ml的菌液，按照0.2%的比例接种模拟废水进行亚硝态氮降解测试。在36h、48h、60h、72h可将500mg/L（C/N 3.99）、600mg/L（C/N 3.33）、700mg/L（C/N 2.85） 、1000mg/L（C/N 1.99）亚硝态氮完全降解，亚硝态氮降解速率13.89mg-NO2-N/L·h、12.5mg-NO2-N/L·h、10mg-NO2-N/L·h、13.89mg-NO2-N/L·h，该菌株在高浓度污水处理中具有较好的应用前景。该菌株的降解速率虽然较高，但是仍然需要外加碳源。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的首要目的在于提供一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11。
本发明的另一目的是提供上述假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11在制备微生物制剂中的应用。
本发明的再一目的是提供一种微生物制剂，其中包含上述假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11。
本发明的再一目的是提供包含上述假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11的微生物制剂在水产养殖及污水处理中的应用，该假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11能在无有机碳源条件下进行亚硝酸盐降解，水产养殖及污水处理过程中无需额外投加有机碳源，大大降低了废水处理成本。
本发明所述的假单胞菌，命名为假单胞菌GWAQ-11，分类命名为假单胞菌（Pseudomonas sp .），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20191063，保藏日期为2019年12月18日，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山（武汉大学）。
其中，所述假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-1分离筛选自加州鲈鱼养殖塘的底泥。
其中，所述假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11为革兰氏阴性菌，杆状，不形成芽孢；在LB琼脂固体培养基平板上培养48h后，菌落浅黄色、圆形，中央凸起，边缘整齐、半透明，表面光滑湿润。
其中，本发明还公开了包含上述假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11的微生物制剂在水产养殖及污水处理中的应用。
优选地，在C/N=0条件下，所述假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11的亚硝态氮降解速率达8.3mg-NO2-N/L·h。
优选地，在C/N＞0条件下，所述假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11的亚硝态氮降解速率达20mg-NO2-N/L·h。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1）本发明菌株对亚硝态氮具有高效的亚硝酸盐降解能力，即使在无有机碳源（C/N=0）条件下进行亚硝酸盐降解，亚硝态氮降解速率达8.3mg-NO2-N/L·h，即能在24h将200mg/L的亚硝态氮完全去除；且废水处理过程中无需额外投加有机碳源，大大降低了废水处理成本。
2）本发明菌株在有有机碳源（C/N＞0）条件下进行亚硝酸盐降解，亚硝态氮降解速率达20mg-NO2-N/L·h，能在20h将400mg/L的亚硝态氮完全去除，是一般微生物制剂的1.68倍，亚硝酸盐降解能力明显提高。
附图说明
图1为本发明的实施例1的假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11在C/N=0条件下亚硝酸盐降解曲线；
图2为本发明的实施例2的假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11在C/N=5条件下亚硝酸盐降解曲线；
图3为本发明的假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11的菌落形态图；
图4为本发明的假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11的显微镜照片图（放大倍数100×10）；
图5为现有技术的亚硝酸盐降解微生物菌剂在C/N=0条件下亚硝酸盐降解曲线；
图6为现有技术的亚硝酸盐降解微生物菌剂在C/N=5条件下亚硝酸盐降解曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
以下实施例和对比例中各性能指标的测试方法或标准：
亚硝态氮降解速率：亚硝态氮测定采用GB/T 7493-1987标准中规定方法；
假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11的分离及鉴定：
（1）富集培养：取佛山南海区加州鲈鱼塘底泥10g，加至90ml富集培养基中（佛山杰大饲料公司加州鲈膨化饲料超声（0.5h）提取上清液10ml/L，K2HPO4 1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，MnSO4 0.01g/L，CaCl2 0.5g/L，Na2CO3 1.0g/L，NaNO2 0.0625g/L，pH自然）28℃静止培养。当培养液中亚硝态氮被完全消耗后，按10%的接种量转接至另一新鲜的富集培养基中，新富集培养基除NaNO2 用量加倍之外其它成分保持不变，如此富集传代培养5次。
（2）分离纯化：用无菌生理盐水将第6代富集培养液进行梯度稀释至10-6、10-7，取0.1ml稀释液涂布于分离固体培养基（佛山杰大饲料公司加州鲈膨化饲料超声（0.5h）提取上清液1ml/L，K2HPO4 1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，MnSO4 0.01g/L，CaCO3 5g/L，琼脂20g/L，pH自然）28℃倒置培养，选择菌落大且周围有清晰透明圈的单菌落。挑取单菌落采用三区划线的方法，做进一步纯化。
（3）菌株分子鉴定：采用试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit-离心柱型，TIANGENBIOTECH(BEIJING) CO., LTD.）提取菌株基因组DNA，利用PCR扩增16S rRNA序列，将扩增序列送生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因测序。将测序结果与GenBank数据库中已有细菌的基因序列进行比对，找出菌株与数据库中同源性最高的模式菌株。
其中，假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11的16S rDNA测序结果如下：CTACGGAGCTACACATGCAAGTCGAGCGGATGAGAGGAGCTTGCTCCTTGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGTTCCTTGAGAACTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTACCACGAGGATCCA
实施例1（C/N=0）
挑取假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11的单菌落划线至LB固体平板上，28℃培养24h后取出，用无菌生理盐水洗涤平板菌苔，洗涤液10000r/min离心，弃上清液收集菌体沉淀并用相同体积的无菌生理盐水洗涤菌体沉淀，重复一次上述离心、洗涤操作，再次离心获得的菌体沉淀，用无菌生理盐水将菌液浓度调整至1010CFU/ml；上述菌液按照0.01%的接种量，将菌液接种至含有200mg/L亚硝态氮的通用硝化细菌培养基中，于28℃，100r/min摇床中培养，每隔4h取样检测废水中亚硝态氮含量。硝化细菌培养基组成：K2HPO4 0.75g/L，NaH2PO4 0.25g/L，MgSO4 0.03g/L，MnSO4 0.01g/L，NaCO3 1g/L，蒸馏水1000ml，pH 7.5，121℃灭菌20min。降解结果如图1所示。实验结果表明，假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11在无有机碳源条件下，24h能将硝化培养基中的亚硝态氮完全去除，亚硝态氮降解速率为8.3mg-NO2-N/L·h。
实施例2（C/N=5）
挑取假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11的单菌落划线至LB固体平板上，28℃培养24h后取出，用无菌生理盐水洗涤平板菌苔，洗涤液10000r/min离心，弃上清液收集菌体沉淀并用相同体积的无菌生理盐水洗涤菌体沉淀，重复一次上述离心、洗涤操作，再次离心获得的菌体沉淀，用无菌生理盐水将菌液浓度调整至1010CFU/ml；上述菌液按照0.01%的接种量，将菌液接种至含有400mg/L亚硝态氮的改良硝化细菌培养基中，于28℃，100r/min摇床中培养，每隔4h取样检测废水中亚硝态氮含量；改良硝化细菌培养基组成：K2HPO4 0.75g/L，NaH2PO4 0.25g/L，MgSO4 0.03g/L，MnSO4 0.01g/L，NaCO3 1g/L，蒸馏水1000ml，pH 7.5，121℃灭菌20min。降解结果如图2所示：实验结果表明，假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11在此条件下，20h能将改良硝化细菌培养基中的亚硝态氮完全去除，亚硝态氮降解速率为20mg-NO2-N/L·h。
实施例3（养殖废水）
废水接种用假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11菌液制备方法同实施例1；养殖废水取自佛山市杰大饲料公司室内养鱼池，经测定其亚硝态氮含量为0.28mg/L，试验容器为1.2吨塑料桶，实验组按照1mg/L的用量添加假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11菌液；容器曝气量、试验温度等条件均与对照组一致；试验结果如表1所示：假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11对养殖废水中的亚硝态氮具有较强的去除效果，2d时间即可将养殖水体中亚硝态氮降解至安全水平之下，且降解效果可维持7d，因此该菌株可用于解决水产养殖中亚硝酸盐超标的问题。
表1养殖废水亚硝态氮降解试验（亚硝态氮含量ppm）
0h 24h 48h 72h 96h 120h 168h
对照组 0.283 0.283 0.281 0.31 0.296 0.30 0.30
实验组 0.283 0.187 0.05 0 0 0 0.03
对比例1（C/N=0）
采用市售碧沃丰®硝化微生物制剂产品，其他同实施例1，测试结果如图5所示，菌剂24h亚硝态氮降解速率为2.49 mg-NO2-N/L·h。
对比例2（C/N=5）
采用市售碧沃丰®硝化微生物制剂产品，其他同实施例2，测试结果如图6所示，菌剂24h亚硝态氮降解速率为11.89 mg-NO2-N/L·h。

Claims (6)

1.一株假单胞菌，命名为假单胞菌GWAQ-11，分类命名为假单胞菌（Pseudomonas sp .），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20191063，保藏日期为2019年12月18日，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山（武汉大学）。
2.根据权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11在制备微生物制剂中的应用。
3.一种微生物制剂，其中包含权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）GWAQ-11。
4.根据权利要求3所述的微生物制剂在水产养殖及污水处理中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在C/N=0条件下，所述假单胞菌（Pseudomonas sp .）GWAQ-11的亚硝态氮降解速率达8.3mg-NO2-N/L·h。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在C/N＞0条件下，所述假单胞菌（Pseudomonas sp .）GWAQ-11的亚硝态氮降解速率达20mg-NO2-N/L·h。
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