CN113293111A - 一种具有脱氮功能的居海杆状菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有脱氮功能的居海杆状菌及其应用。居海杆状菌(Marivirgasp.)S33H4，保藏编号为GDMCCNo:61709。本发明所述居海杆状菌S33H4能有效地脱除水体中的硝态氮、铵态氮和亚硝态氮，其中对硝态氮和铵态氮的脱除效果均在90％以上，此外，该菌株对亚硝态氮也具显著的脱除效果。由此说明，居海杆状菌S33H4在水体脱氮中具有很好的应用潜力。
Description
技术领域：
本发明属于微生物和环境工程技术领域，具体涉及一种具有脱氮功能的居海杆状菌及其应用。
背景技术：
随着国内水产养殖业的快速发展，高密度养殖模式越来越受到人们的青睐。然而，高密度养殖在满足人们对水产品需求的同时，也由于饲料的过量投入及抗菌药剂的频繁使用等因素，对养殖环境及周边生态环境造成严重的危害。一方面，本身养殖水体恶化，如过量的饵料、粪便及分泌物的积累，使水体中的铵态氮和亚硝态氮浓度升高，危害养殖动物的健康生长，影响水产养殖产量，提高养殖成本；另一方面，未经处理的养殖废水随意排放也对养殖周边的水体环境造成了严重污染。因此，如何高效、经济地脱除养殖废水中过量的无机氮素，具有重要的现实意义。
废水中含氮污染物的脱除主要有物理、化学和生物等三种方法，其中微生物脱氮技术克服了物理、化学脱氮工艺的一些缺陷，具有操作简单、适应范围广、处理效果好、基本上无二次污染等优点。因此，微生物脱氮技术已成为目前国内外应用最广泛的脱氮技术。目前，环境工程和污水、废水处理领域主要采用缺氧-好氧(Anoxic-Oxic,AO)脱氮、厌氧-缺氧-好氧(Anaerobic-Anoxic-Oxic,AAO)脱氮、间歇式(Sequencing Batch Reactor,SBR)脱氮、曝气生物滤池(Biological Aeration Filter,BAF)脱氮等工艺，这些脱氮工艺普遍将硝化过程和反硝化过程分阶段进行或在不同的反应器中实现。
近年来，随着对脱氮微生物的深入研究，研究人员发现某些菌株可以在好氧条件下进行反硝化作用，这类菌被称为好氧反硝化菌。大多数好氧反硝化菌会表现出异养硝化能力，这种同时兼具异养硝化和反硝化功能的菌被称为异养硝化-好氧反硝化菌(Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification Bacteria，HN-AD)。鉴于在水产养殖过程中养殖水体的溶氧量需要维持在一定范围，以保证养殖动物的健康生长，因此，好氧反硝化脱氮菌在养殖废水脱氮上具有很好的应用价值。
好氧反硝化菌在生理生化和系统发育上存在多样性，据文献报道，好氧反硝化细菌主要分布于假单胞菌属(Pseudomonaceae)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)、芽胞杆菌属(Bacillus)等属中，且相关国家发明专利也较多。然而，目前尚未有具有脱氮功能的居海杆状菌及应用的相关专利。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一株具有脱氮功能的居海杆状菌，为水体脱氮提供一种良好的微生物材料。
为实现上述目的，本发明提供了一株具有脱氮功能的菌株，其为居海杆状菌(Marivirga sp.)S33H4，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No:61709，保藏日期为2021年5月31日。
本发明所述菌株由发明人于2019年11月从西南印度洋深海沉积物样品中分离筛选得到，该菌株特征为：革兰氏阴性菌，菌落为橙黄色、表面光滑湿润、不透明、边缘规则的圆形。此外，所述菌株S33H4生长所需盐浓度范围为2-15％，最适盐浓度为5％。
本发明的第二个目的是提供居海杆状菌S33H4在脱除水体中硝态氮、铵态氮或亚硝态氮的应用。
本发明所述居海杆状菌S33H4，将其分别接种至以KNO3，(NH4)2SO4和NaNO2为唯一氮源的培养基中，28℃，180rpm振荡培养，在培养0、6、12、24、30、48、54、60h时，取出培养液测定培养液OD600，同时取2.0mL培养液，离心，测定上清液中三种无机氮浓度。结果显示居海杆状菌S33H4对水体中的NO3 --N，NH4 +-N和NO2 --N均具脱除效果。在以KNO3为唯一氮源培养基中，该菌株培养60h时对NO3 --N的脱除率为100％；在(NH4)2SO4为唯一氮源培养基中，该菌株培养36h时对NH4 +-N的脱除率为92.0％，且脱氮除过程中无其他无机氮的产生和积累；在以NaNO2为唯一氮源培养基中，该菌株培养60h时对NO2 --N的脱除率为78.9％，且脱氮过程中无其他无机氮的产生和积累。
优选，所述的水体是养殖废水。
优选，所述的养殖废水为淡水养殖废水。
优选，所述的养殖废水为海水养殖废水。
本发明的第三个目的是提供一种具有脱氮功能的活菌制剂，该菌剂含有居海杆状菌S33H4作为主要活性成分。
本发明所述居海杆状菌S33H4能有效地脱除水体中的硝态氮、铵态氮和亚硝态氮，其中对硝态氮和铵态氮的脱除效果均在90％以上，此外，该菌株对亚硝态氮也具显著的脱除效果。由此说明，居海杆状菌S33H4在水体脱氮中具有很好的应用潜力。
Marivirga sp.S33H4，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No:61709，保藏日期为2021年5月31日。
附图说明
图1为居海杆状菌S33H4在不同盐浓度下培养72h时的生长情况
图2为居海杆状菌S33H4在以硝态氮为唯一氮源条件下的脱氮特性
图3为居海杆状菌S33H4在以铵态氮为唯一氮源条件下的脱氮特性
图4为居海杆状菌S33H4在以亚硝态氮为唯一氮源条件下的脱氮特性
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1.居海杆状菌S33H4的分离纯化和保藏
西南印度洋深海沉积物样品(S38°42′54″；E46°58′6″)，取2个沉积物样品，接于装有100mL富集培养基的三角摇瓶中，180rpm，28℃，进行富集培养。培养5d后将培养液按体积比1:100比例转接至新的装有富集培养基的三角瓶中，28℃，180rpm，培养5d，进行2次富集，重复上述步骤进行第3次富集。将第3次富集的培养液依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取10-3、10-4、10-5的稀释培养液100μL分别涂布于分离培养基上，28℃恒温培养箱培养3-5d。肉眼观察菌落形态、颜色等，挑取平板上的单菌落划线纯化，将纯化后的菌株进行编号并用25％甘油保藏于-80℃冰箱，由此得到菌株S33H4。
富集培养基：将KNO31.1 g，NaNO20.69 g，(NH4)2SO40.66 g，NaCl 30g，琥珀酸钠2.5g，柠檬酸钠2.5g，MgSO4·H2O 0.2g，KH2PO41.0 g，Na2HPO41.0 g加入到水中，然后用水定容至1000mL，高温高压灭菌，待培养基冷却后，添加经0.22μm滤膜过滤除菌的0.2％微量元素混合液(体积比)和1％复合碳源(体积比)。分离所用的分离培养基固体平板为在富集培养基中添加质量分数1.5％琼脂粉。
微量元素混合液：EDTA·Na 58.0g，ZnSO4·7H2O 3.9g，CaCl210.0 g，MnCl2·4H2O1.0g，FeSO4·7H2O 10.0g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1g，CuSO4·5H2O 1.6g，CoCl2·6H2O 1.6g，用水定容至1000mL，pH 6.0。
复合碳源：D-葡萄糖13.8g，D-果糖13.8g，D-乳糖13.8g，90％乳酸12.8mL，甘露醇14.0g，酒精14.0mL，甘油12.6mL，苯甲酸钠9.6g，水杨酸9.2g，醋酸钠19.0g，用水定容至1000mL，pH 7.4。
菌株S33H4为革兰氏阴性菌，该菌株在2216E平板上培养5天时，其菌落形态特征为：橙黄色，表面光滑湿润，不透明，边缘整齐。
2.菌株S33H4的16S rRNA基因序列分析
采用HiPure细菌DNA提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司)提取菌株S33H4的基因组DNA，用细菌16S rRNA基因扩增通用引物27F/1492R扩增得到PCR产物，并送至苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，测序结果与EzBioCloud网站数据库中的16S rRNA序列进行同源性比对分析，结果表明，菌株S33H4与Marivirgasp.NBRC 15126T的16S rRNA基因序列相似性最高，为97.9％，基于此结果分析，将本发明菌株S33H4鉴定为一株居海杆状菌，即Marivirga sp.S33H4，将其命名为居海杆状菌(Marivirga sp.)S33H4，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No:61709，保藏日期为2021年5月31日。
3.居海杆状菌S33H4的耐盐特性研究
将居海杆状菌S33H4分别接种至NaCl浓度为质量分数为0、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10.0％、12.0％、15.0％、18.0％和20.0％的2216e无盐培养基中，28℃，180rpm培养72h后，测定菌液OD600，确定居海杆状菌S33H4在不同盐浓度条件下的生长情况。
试验结果显示，所述居海杆状菌S33H4生长所需盐浓度范围为2-15％，1％以下及18％以上不能正常生长，且其最适盐浓度为5％(附图1)。
4.居海杆状菌S33H4脱氮性能研究
将居海杆状菌S33H4分别接种至以硝态氮(NO3 --N)、铵态氮(NH4 +-N)或亚硝态氮(NO2 --N)为唯一氮源的培养基中，28℃，120rpm培养。分别在培养0、6、12、24、30、36、48、54和60h时取样，一部份培养液用于检测OD600值，另一部份培养液离心取上清，分别用于后续NO3 --N、NH4 +-N和NO2—N的测定。NO3 --N浓度采用紫外分光光度法测定，NO2 --N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定，NH4 +-N浓度采用纳氏试剂分光光度法测定。
NO3 --N培养基：琥珀酸钠2.5g，二水合柠檬酸三钠2.5g，NaCl 50.0g，KNO31.01 g，Na2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2g，用水定容至1000mL，121℃，20min，pH 7.4，高温高压灭菌。添加经0.22μm滤膜过滤除菌的0.2％微量元素混合液(体积比)和1％复合碳源(体积比)。
NH4 +-N培养基：琥珀酸钠2.5g，二水合柠檬酸三钠2.5g，NaCl 50.0g，(NH4)2SO40.66g，Na2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2g，用水定容至1000mL，121℃，20min，pH 7.4，高温高压灭菌。添加经0.22μm滤膜过滤除菌的0.2％微量元素混合液(体积比)和1％复合碳源(体积比)。
NO2 --N培养基：琥珀酸钠2.5g，二水合柠檬酸三钠2.5g，NaCl 50g，NaNO20.69 g，Na2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2g，用水定容至1000mL，115℃，20min，pH 7.4，高温高压灭菌。添加经0.22μm滤膜过滤除菌的0.2％微量元素混合液(体积比)和1％复合碳源(体积比)。
如附图2所示，在以158.0mg/LNO3 --N为唯一氮源条件下，居海杆状菌S33H4具有很好的脱氮效果，即在培养60h时，该菌株的OD600为1.2，且其对NO3 --N的脱除效果达100％。如附图3所示，在以144.7mg/LNH4 +-N为唯一氮源条件下，该菌株亦具有很好的脱氮效果，即在培养36h时，其OD600为1.9，且对NO3 --N的脱除效果达92.0％。如附图4所示，在以139.0mg/LNO2 --N为唯一氮源条件下，该菌株的脱氮效果相比对NO3 --N和NH4 +-N的脱除效果稍弱，即在培养60h时，其OD600为1.4，以及对NO2 --N的脱除效果为78.9％。
以上结果表明，居海杆状菌(Marivirga sp.)S33H4为一株异养硝化-好氧反硝化功能菌株，能够高效脱除水体中的无机氮源，尤其是对水体中的硝态氮和铵态氮的脱除效果很强，在淡水、海水养殖废水及其他各种氮素污染的水体脱氮上具有很大的应用潜力。
序列表
<110> 姚雨欣
<120> 一种具有脱氮功能的居海杆状菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1383
<212> DNA
<213> 居海杆状菌S33H4(Marivirga sp.)
<400> 1
tgcagttgac gggattttct ccttcgggag aaatgagagt agcgcacggg tgcgtaacgc 60
gtatgcaacc taccttttac agggggatag cccggggaaa ctcggattaa taccccatgg 120
catcataata ccgcatggta tattgattaa agatttatcg gtaaaagatg ggcatgcgtc 180
tgattagtta gatggtgagg taacggctca ccatgacgat gatcagtagg ggttctgaga 240
ggatgatccc ccacactggt actgagacac ggaccagact cctacgggag gcagcagtag 300
ggaatattgg tcaatgggcg agagcctgaa ccagccatgc cgcgtgcagg atgacggcct 360
tctgggttgt aaactgcttt tctacaggaa gtaaaagact atgcgtagtc aattgacggt 420
actgtaggaa taagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca 480
agcgttgtcc ggatttattg ggtttaaagg gtgcgtaggc ggccaattaa gtcagtggtg 540
aaatccttcc gcttaacggg agaactccca ttgaaactgt ttggcttgag tacggttgaa 600
gtaggcggaa tttatggtgt agcggtgaaa tgcatagata ccataaagaa caccgatagc 660
gtaggcagct tactaagccg taactgacgc tgaggcacga aagcatgggg agcgaacagg 720
attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgataac tcgctgttag cgatatactg 780
ttagcggcca agcgaaagcg ttaagttatc cacctgggga gtacgtccgc aaggatgaaa 840
ctcaaaggaa ttgacggggg tccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgata 900
cgcgaggaac cttacctggg ctagaatgcc cttgacagcc ctagagatag ggtgttcctt 960
cgggacaagg tgcaaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgttgggtt 1020
aagtcccgca acgagcgcaa cccctattct tagttgccag catgtaatga tggggactct 1080
aaggagactg cctgcgcaag cagagaggaa ggaggggacg acgtcaagtc atcatggccc 1140
ttacgcccag ggctacacac gtgctacaat ggtgcataca gagggtagca agctggtaac 1200
agtaagccaa tctcaaaaag tgcatctcag ttcggattgg ggtctgcaac tcgaccctat 1260
gaagttggaa tcgctagtaa tcgcgtatca gcaatgacgc ggtgaatacg ttcccggacc 1320
ttgtacacac cgcccgtcaa gccatgggaa ttgggaggac ctgaagacgg tgccgcaagg 1380
cgc 1383
Claims (7)
1.居海杆状菌(Marivirga sp.)S33H4，保藏编号为GDMCC No:61709。
2.权利要求1所述的居海杆状菌S33H4在脱除水体中硝态氮、铵态氮或亚硝态氮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的水体是养殖废水。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的养殖废水为淡水养殖废水。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的养殖废水为海水养殖废水。
6.一种具有脱氮功能的活菌制剂，其特征在于，该活菌制剂含有权利要求1所述的居海杆状菌S33H4作为主要活性成分。
7.根据权利要求6所述的具有脱氮功能的活菌制剂，其特征在于，所述的脱氮是脱除水体中硝态氮、铵态氮或亚硝态氮。
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