CN110655200A - 利用假单胞菌菌株yg8处理含氮废水的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，所述含氮废水中含有有机酸钠，所述含氮废水的C/N比值为8～30，所述方法包括以下步骤：将假单胞菌菌株YG8的种子液接种于含氮废水中，在温度为25℃～35℃，转速为150rpm～180rpm的条件下振荡反应，完成对含氮废水的处理；所述假单胞菌菌株YG8为异养硝化‑好氧反硝化菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60340。该假单胞菌菌株YG8同时对氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有很高去除率，因而本发明可处理复杂含氮废水，具有巨大的应用价值。

Description

利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法。

背景技术

随着社会经济的快速发展与城镇化工业化的加剧，水污染的防治工作越加受到人们的重视。如何解决日趋严重的水体富营养化现象，成为治理水体污染的重要方面。水体富营养化危害水生生物的生存，影响生态环境，而且会增加水处理的难度和成本。饮用水中硝酸盐浓度过高易引发高铁血红蛋白血症。

生物脱氮技术由于具有经济、高效、易操作、无二次污染等特点被广泛应用。传统理论认为硝化作用是硝化菌在好氧条件下将氨氮转化为硝态氮；而反硝化作用则是反硝化菌在缺氧条件下将硝态氮转化为氮气。由于硝化过程和反硝化过程的环境条件不同，因此需要费用高且脱氮效率低下。

自从发现异养硝化-好氧反硝化菌Paracoccus pantotrophus(ATCC 35512)，提出异养硝化-好氧反硝化过程(Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification，HN-AD)突破传统生物脱氮理念——异养硝化-好氧反硝化菌在好氧条件下，把氨氮转化为硝态氮，硝态氮又可作为缺氧条件下的底物，进一步转变为氮气。自此，硝化和反硝化开始可以在同一体系下进行，新型生物脱氮技术取得创新性发展。随着废水脱氮理论研究的不断深入，HN-AD菌显著的脱氮效果使人们开始重视其在氮循环中的作用及在废水处理的潜在价值。

目前发现的异养硝化-好氧反硝化菌主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)、产碱杆菌属 (Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)和假单胞菌属(Pseudomonas)等几大类，但亚硝氮对微生物有一定的毒性，会抑制菌株的生长与脱氮性能，因此，能同时对氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有很高去除率的异养硝化-好氧反硝化菌株较少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，同时对氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有很高去除率。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，所述含氮废水中含有有机酸钠，所述含氮废水的C/N比值为8～30，所述方法包括以下步骤：

将假单胞菌菌株YG8的种子液接种于含氮废水中，在温度为25℃～35℃，转速为150 rpm～180rpm的条件下振荡反应，完成对含氮废水的处理；

所述假单胞菌菌株YG8(Pseudomonas mendocinaYG8)为异养硝化-好氧反硝化菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60340。

在其中一个实施例中，所述含氮废水含NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述含氮废水为含NH₄ ⁺废水时，所述含NH₄ ⁺废水的C/N比值为 12～30，所述NH₄ ⁺的浓度为50mg·L^-1～500mg·L^-1。

在其中一个实施例中，所述含氮废水为含NO₃ ^-废水时，所述含NO₃ ^-废水的C/N比值为8～ 25，所述NO₃ ^-的浓度为50mg·L^-1～200mg·L^-1。

在其中一个实施例中，所述含氮废水为含NO₂ ^-废水时，所述含NO₃ ^-废水的C/N比值为8～ 16，所述NO₂ ^-的浓度为50mg·L^-1～100mg·L^-1。

在其中一个实施例中，所述有机酸钠为柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述假单胞菌菌株YG8的种子液通过以下方法制得：将假单胞菌菌株YG8接种到LB培养基中，在温度为25～35℃、转速为100～180rpm下振荡培养至对数期，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水，得到假单胞菌菌株YG8的种子液。

在其中一个实施例中，所述异养硝化-好氧反硝化的副球菌种子液的接种量为3％～15％。

在其中一个实施例中，所述LB培养基的成分为：胰蛋白胨10g·L^-1，酵母浸膏5g·L^-1， NaCl 10g·L^-1，pH 7.0。

在其中一个实施例中，加无菌水至菌液OD₆₀₀为0.65～0.8。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明利用假单胞菌YG8处理复杂含氮废水，假单胞菌YG8(Pseudomonasmendocina YG8)为异养硝化-好氧反硝化菌，其同时对氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有很高去除率，综合性能优异，可为复杂含氮废水生物处理提供种菌资源，具有巨大的应用价值。24小时内氨氮去除率达99.99％以上，并且没有硝酸盐氮和亚硝酸盐氮积累；硝酸盐氮去除率达到 96.77％，几乎没有亚硝酸盐氮积累；亚硝酸盐氮去除率达到91.74％，硝酸盐氮无积累。

具体地，异养硝化过程中，以乙酸钠为碳源，C/N为12，50-200mg·L^-1氨氮浓度范围，氨氮去除率随氨氮浓度升高而增大；在200mg·L^-1时，氨氮去除率达到最大98.05％；硝酸盐氮浓度为50mg·L^-1时，YG8对硝酸盐氮去除率最高达97.76％，亚硝酸盐氮浓度为50mg·L^-1时，亚硝酸盐氮的去除率最高为90.43％，可见，亚硝酸盐氮对假单胞菌YG8的毒害作用小，一定浓度范围下基本不会抑制菌株的生长与脱亚硝酸盐氮性能。

另外，较其他异养硝化-好氧反硝化菌来说，YG8生长速度更快，且YG8对硝酸盐氮的去除速率更高，因此菌株YG8能够以更高的效率去除水体中的氮污染源。并且该菌株耐受的氨氮浓度达到500mg·L^-1。

附图说明

图1为本发明所采用的假单胞菌YG8的菌落形态图。

图2为本发明所采用的假单胞菌YG8的透射电镜图。

图3为本发明所采用的假单胞菌YG8的16S rDNA扩增电泳图。

图4为本发明所采用的假单胞菌YG8的系统进化树。

图5为本发明所采用的假单胞菌YG8 napA基因PCR扩增电泳图。

图6为本发明所采用的假单胞菌YG8以硝酸钾为唯一氮源的好氧反硝化脱氮性能图。

图7为本发明所采用的假单胞菌YG8以亚硝酸钠为唯一氮源的好氧反硝化性能图。

图8为本发明所采用的假单胞菌YG8以硫酸铵为唯一氮源的异养硝化脱氮性能图。

图9为碳源对本发明所采用的假单胞菌YG8异养硝化脱氮性能的影响图。

图10为C/N对本发明所采用的假单胞菌YG8异养硝化脱氮性能的影响图。

图11为pH对本发明所采用的假单胞菌YG8异养硝化脱氮脱氮性能的影响图。

图12为温度对本发明所采用的假单胞菌YG8异养硝化脱氮性能的影响图。

图13为接种量对本发明所采用的假单胞菌YG8异养硝化脱氮性能的影响图。

图14为转速对本发明的假单胞菌YG8异养硝化脱氮性能的影响图。

图15为不同氨氮浓度对本发明所采用的假单胞菌YG8异养硝化脱氮性能的影响图。

图16为C/N对本发明所采用的假单胞菌YG8好氧反硝化脱氮性能的影响图。

图17为C/N对本发明所采用的假单胞菌YG8好氧亚硝化脱氮性能的影响图。

图18为不同硝酸盐氮浓度对本发明所采用的假单胞菌YG8好氧反硝化脱氮性能的影响图。

图19为不同亚硝酸盐氮浓度对本发明所采用的假单胞菌YG8好氧反硝化脱氮性能的影响图。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例所采用的假单胞菌菌株YG8，为异养硝化-好氧反硝化菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60340，被命名为假单胞菌菌株YG8(Pseudomonas mendocinaYG8)。

1)菌种分离筛选

上述本实施例的假单胞菌YG8主要通过以下方法筛选得到：

1.1)初筛

将采自福建省龙岩市龙津污水处理厂的活性污泥，加至装有玻璃珠的富集培养基的锥形瓶中进行富集培养。富集结束后，将菌液稀释涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板。待长出单菌落，再进一步划线纯化。挑取纯化后的菌株接入灭菌的异养硝化培养基中，每隔2d取菌液滴加格林斯试剂以确认菌株是否具有硝化活性。初步筛选出的异养硝化菌株再接种到BTB初筛培养基上进行涂布培养，每个菌株至少2个平行样，于30℃恒温培养箱中培养。反硝化过程会使 BTB培养基pH升高，从而菌落周围会产生蓝色晕圈，挑选出现蓝色晕圈的单菌落，在DM 固体培养基划线分离，重复分离操作3次，待生长后挑取单菌落保存。筛选出的菌株兼具异养硝化和好氧反硝化活性。

1.2)复筛

挑取初筛得到的菌株分别接入灭菌的异养硝化和好氧反硝化培养基中，在30℃，转速 150rpm的摇床震荡培养，48h后检测培养基中的氨氮和硝酸盐氮含量，筛选出氨氮和硝酸盐氮降解率高的菌株，选取该菌株进行后续脱氮性能的研究。

2)菌种鉴定

上述本实施例的假单胞菌YG8菌种鉴定过程及结果如下：

2.1)形态学鉴定

培养挑取待鉴定的菌种分别划线于牛肉膏蛋白胨平板培养基，培养48h后观察菌落形态。

YG8平板菌落形态结果如图1所示：菌落表面显黄色，不透明，边缘清晰圆整，呈粘性质地。

2.2)革兰氏染色观察

挑取对数生长期(18-24h)的菌落涂片，自然风干后在火焰上固定，然后进行革兰氏染色。用光学显微镜观察菌体颜色和大小。

革兰氏染色结果表明：YG8为革兰氏阴性菌，呈杆状。

2.3)透射电镜形态观察

委托广东省微生物研究所进行检测。

透射电镜形态结果如图2所示：单个细菌呈现短杆状，菌体大小为362×253nm。

2.4)生理生化鉴定

按照《伯杰鉴定细菌学手册》进行操作，部分参照其他文献操作。

细菌的生理生化反应是对细菌分类鉴定的重要依据之一。参照《伯杰鉴定细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对YG8菌株进行鉴定。鉴定结果如表1所示：YG8能够在4℃和41℃生长，在接触酶、淀粉水解、尿素水解、果胶水解、乙酸氧化等实验中均能发生反应，实验结果为阳性。经生理生化实验鉴定：YG8与Pseudomonas mendocina(假单胞门多萨菌属) 相似。

表1 YG8的生理生化实验结果

检测指标	结果	检测指标	结果
				接触酶	+	尿素水解	+
氧化酶	-	果胶水解	+
				V.P	-	乙酸氧化	+
甲基红	-	产硫化氢	-
				葡萄糖发酵	--	柠檬酸盐	+
乳糖发酵	--	石蕊牛奶	酸性
				绿脓菌素	+	硝酸盐还原	+
明胶液化	+	吲哚实验	+
				淀粉水解	+	氧化发酵	++
油脂水解	-	生长温度	4℃和41℃都生长

注：+表示阳性结果，出现反应；表示阴性结果，无该反应。葡萄糖发酵中，第一个+/-表示产酸/不产酸，第二个+/-表示产气/不产气。氧化发酵中，第一个+/-表示有氧条件下反应/不反应，第二个+/-表示无氧条件下反应/不反应。

2.5)菌种分子生物学鉴定

提取菌株DNA作为PCR模板进行扩增。引物选用通用引物:27F： 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系(50ul)：无菌水41.5ul，Buffer 5ul，1492R 1ul，27F 1ul，taq酶0.5ul，dNTP 1ul。 PCR反应条件为:①95℃预变性3min；②95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s；③第2步循环30次；④72℃最终延伸10min，4℃保存。得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后，送至上海华大基因公司完成菌株16S rDNA序列测定，根据结果进行菌株同源性分析，确定菌株的系统发育地位。

NapA功能基因的扩增。硝酸还原酶分为膜结合硝酸还原酶(Nar)和周质硝酸盐还原酶 (Nap)两类，在好氧条件下，周质硝酸盐还原酶基因优先表达，并且在无氧和有氧条件下均能发挥作用。利用引物nap1：5`-TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA-3`，nap2：5 `-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3`，在PCR仪上进行扩增。反应体系(25ul)：10×Buffer 2.5ul，dNTP 0.5ul，NAP1 0.5ul，NAP2 0.5ul，模板DNA 1ul，Taq酶0.25ul，无菌水19.75ul。PCR 条件设定：①94℃预变性10min；②94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min；③第 2步循环30次；④72℃最终延伸10min，4℃保存。得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶成像系统成像拍照后，送至上海华大基因公司完成序列测定。

YG8菌株16S rDNA扩增如图3所示：PCR产物条带较亮且通道无其他杂带，位于1000-2000bp之间，说明得到YG8的16S rDNA目标条带。菌株YG8的16S rDNA PCR产物经纯化后进行测序，测得序列长度为1294bp。根据测序结果进行菌种系统发育分析，结果如图4所示：YG8与Pseudomonas mendocina相似度100％，可判断YG8属于假单胞门多萨菌属(Pseudomonas mendocina)，命名为Pseudomonas mendocina YG8(以下简称YG8)。

周质硝酸盐还原酶亚基基因的扩增：

利用引物nap1/nap2对YG8菌株的DNA样品进行扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，扩增结果如图5所示：750-1000bp左右有清晰的特异条带，杨基先等分离的周质硝酸盐还原酶亚基基因napA为870bp，可初步判断，该菌含有napA基因，表明菌株YG8具有好氧反硝化功能。

取YG8菌株在LB培养基中活化培养至对数期的菌液，于30℃的恒温摇床中培养48小时，再将LB培养基中的菌液倒入离心管中，4000rpm离心10min，收集菌体，再用无菌水洗涤菌体，离心，重复以上操作2-3次。然后将菌体用无菌水重悬，调节菌体浓度，使其OD600值0.65-0.80范围内，得到种子液。

实施例中用到的培养基配方如下：

LB培养基(g·L^-1)：蛋白胨10，NaCl 5，酵母浸膏5，pH 7.0～7.5。

富集培养基(g·L^-1)：(NH₄)₂SO₄0.5，丁二酸钠2.17，维氏盐溶液50ml/L。

维氏盐溶液：KHPO₄·3H₂O 6.05，MgSO₄·7H₂O 2.50，NaCl 2.50，FeSO₄·7H₂O0.05，MnSO₄·H₂O 0.04。

异养硝化培养基(g·L^-1)：(NH₄)₂SO₄0.24，其他成分和含量同富集培养基。

好氧反硝化培养基(DM)：KNO₃0.36，丁二酸钠2.81，Na₂HPO₄·7H₂O 7.9，微量元素溶液2ml·L^-1，pH7.0-7.5；微量元素溶液(g·L^-1)：EDTA 50，CuSO₄·5H₂O 1.57，ZnSO₄2.20，CaCl₂5.50，FeSO₄·7H₂O 5.00，MnCl₂·4H₂O 5.06，CoCl·6H₂O 1.61，pH7.0。

溴百里酚蓝培养基(BTB)(g·L^-1)：KNO₃1.00，L-天冬酰胺1.00，0.1％溴百里酚蓝5ml (用酒精稀释)，柠檬酸钠8.50，KH₂PO₄1.00，MgSO₄·7H₂O 1.00，CaCl₂0.2，FeCl₃·6H₂O0.05，pH调至7.0-7.3。

牛肉膏蛋白胨培养基(g·L^-1)：牛肉膏3.00，蛋白胨10.00，NaCl 5.00，pH调至7.0-7.2。

若配制固体培养基则添加琼脂15.00-20.00g·L^-1。上述培养基均在121℃高温灭菌20min。

试剂：格林斯试剂：A液：对氨基苯磺酸0.50g，稀醋酸(10％)150ml，避光保存一个月内可用；B液：1-萘胺0.10g，蒸馏水20ml，稀醋酸(10％)150ml。临用前AB两溶液等量混匀。

实施例中用到的实验仪器如表2所示：

表2实验仪器

实施例中的水质检测分析项目及方法如表3所示：

表3水质检测分析的项目及方法

指标	测定方法
		氨态氮(NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N)	纳氏试剂分光光度法
硝氮(NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N)	麝香草酚分光光度法
		亚硝氮(NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N)	N-(1-萘基)-乙二胺光度法
总氮(TN)	碱性过硫酸钾消解分光光度计
		化学需氧量(COD)	COD仪器消解法
pH	UB-7精密pH计
		菌体生物量光密度OD<sub>600</sub>	采用超微量分光光度计在波长600nm处测定

实施例1：

一种利用上述异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株YG8种子液处理硝酸盐氮废水的方法，包括以下步骤：

以3％接种量将菌悬液接入初始硝酸盐氮浓度为50mg·L^-1，C/N为8，pH为7.5的200mL 好氧反硝化培养基的500mL锥形瓶中，于30℃，150rpm摇床中培养，每隔6h进行取样，测定氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、COD和TN(总氮)含量以及pH和OD₆₀₀。

以硝酸钾为唯一氮源的好氧反硝化脱氮性能如图6所示：0～6h期间，OD₆₀₀曲线增加较为平缓，OD₆₀₀仅从0.07增长到0.11，是菌株对培养环境的适应过程，为菌株生长适应期； 6-18h OD₆₀₀直线斜率增大，菌株成倍增长，并在18h时达到最大值0.31，此时菌株处于对数生长期；此后OD₆₀₀直线斜率为负值，菌株进入衰退期。菌株对数生长期间硝酸盐氮去除率从16.51％上升至96.77％，TN去除率由12.95％达到67.13％，COD去除率则由17.35％达到96.61％，说明硝酸盐还原过程主要发生在对数期；亚硝酸盐氮在对数生长期迅速积累，24 h时达到最大值4.35mg·L^-1。而TN去除率由67.13％降低至53.90％。整个培养过程中培养基的pH值一直在增长，说明反硝化过程伴随着产碱。

整个反硝化过程，检测到有少量亚硝酸盐积累，随后被少量还原，这表明菌体YG8应是先将硝酸盐氮还原为亚硝酸盐，诱导亚硝酸盐还原酶的产生，进而将亚硝酸盐还原为气体溢出系统。与同种属的菌株相比，在初始氮浓度为40mg·L^-1的反硝化体系中，Pseudomonas mendocina HAD-2在24h硝酸盐氮去除率小于86.40％，而YG8在初始氮浓度为50mg·L^-1， 24h硝酸盐氮去除率就达到96.77％，相较而言YG8对硝酸盐氮去除率更高并且反应速率快；好氧条件下，Zooglose sp.ZN2，ZN1、ZN3(铁还原细菌)以硝酸钠为唯一氮源，测定反硝化能力结果表明3株菌同YG8一样均在6h时进入对数生长期，但3株菌培养50h后OD₆₀₀仅达最大值0.06，培养47h时硝酸盐氮去除速率为0.06mg·(L·h)^-1左右，而24h时YG8对硝酸盐氮的去除速率达到2.02mg·(L·h)^-1。相比ZN1、ZN2、ZN3的菌体生长速度，YG8 生长速度更快，且YG8对硝酸盐氮的去除速率更高，因此菌株YG8能够以更高的效率去除水体硝酸盐氮。

实施例2：

一种利用上述异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株YG8种子液处理亚硝酸盐氮废水的方法，包括以下步骤：

以3％接种量将菌悬液接入初始亚硝酸盐氮浓度为50mg·L^-1，C/N为8，pH为7.5的200 mL好氧亚硝化培养基的500mL锥形瓶中，于30℃，150rpm摇床中培养，每隔6h进行取样，测定氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、COD和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

以亚硝酸钠为唯一氮源的好氧亚硝化脱氮性能如图7所示：在0～6h之间OD₆₀₀增长缓慢，说明在这段时间菌株处于延滞期；6-12h期间OD₆₀₀呈倍数增长，并在12h时达到最大值0.41，此阶段为菌株的对数生长期；12h后菌体生长开始进入衰退期，12-24h时OD₆₀₀下降，营养物质减少和代谢产物的积累抑制菌的生长。18h时亚硝酸盐氮、TN、COD去除率分别增长至91.11％、53.85％、92.51％，且18h后亚硝酸盐氮、TN、COD去除率趋于稳定，分别达到91.74％、 56.23％和93.29％。整个培养过程中，培养基的pH一直在增长，说明好氧亚硝化过程伴随着产碱。硝酸盐氮很少，在6h时积累量达到1.58mg·L^-1，并趋于稳定。

YG8与多数异养硝化-好氧反硝化菌一样，都能够以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮作为氮源，例如Acinetobacter calcoaceticus N7菌株，在初始硝酸盐氮和亚硝酸盐氮浓度均为50mg·L^-1，24 h时硝酸盐氮的去除率和亚硝酸盐氮积累量分别为65.4％和0.7mg·L^-1，亚硝酸盐氮去除率和硝酸盐氮积累量分别为80.8％和4.3mg·L^-1，YG8的亚硝酸盐氮去除率和硝酸盐氮积累量分别是91.74％和1.58mg·L^-1，因此YG8比N7菌株好氧反硝化性能更好。据报道，Alcaligenes faecalis No.4不能利用亚硝酸盐氮作为氮源生长也不能对其进行脱氮，这与菌株YG8对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的利用情况不相同。

实施例3：

一种利用上述异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株YG8种子液处理氨氮废水的方法，包括以下步骤：

以3％接种量将菌悬液接入初始氨氮浓度为50mg·L^-1，C/N为8，pH为7.5的200mL异养硝化培养基的500mL锥形瓶中，于30℃，150rpm摇床中培养，每隔6h取样，测定氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、COD和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

YG8以硫酸铵为氮源的异养硝化脱氮性能结果如图8所示：0～12h，OD₆₀₀呈几何倍数增长，为对数生长期；12h后OD₆₀₀增长速度缓慢，在24h时OD₆₀₀达到最大值0.35。0-12h 氨氮去除率迅速增长，12h时氨氮去除率达到100％。硝化细菌在异养脱氮过程中产酸，使 pH降低，好氧反硝化脱氮过程则产碱。菌株YG8异养硝化脱氮过程中pH从7.34升高到8.61，表明YG8在异养硝化过程伴有好氧反硝化作用。硝化反应过程中，18h对硝酸盐氮的积累量达2.83mg·L^-1，随后被全部降解，也说明在YG8异养硝化过程伴随好氧反硝化作用。

许多菌株的异养硝化过程中氨氮、COD去除同YG8菌株一样发生在对数生长期，如Klebsiella sp.y6菌株在对数生长期间的氨氮、COD去除率分别达到99.67％和82.17％，整个过程中几乎没有硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的积累。相比Klebsiella sp.HLNR02经24h培养，氨氮去除率达87.7％，YG8在12h时氨氮去除率就已达到100％，说明YG8菌株氨氮去除效率更高。

实施例4：

(1)异养硝化脱氮性能影响因素

(1.1)碳源对异养硝化脱氮性能的影响

以3％接种量将菌悬液分别接入以丁二酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖、乙酸钠、碳酸氢钠、草酸钠和蔗糖为碳源和不含碳源的不同异养硝化培养基中(装量为100mL的250mL锥形瓶)，初始氨氮浓度为50mg·L^-1，C/N＝8，pH为7.5，于30℃，150rpm摇床中培养，24h取样，测定氨氮和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

碳源对菌株YG8脱氮性能的影响如图9所示：以柠檬酸钠、乙酸钠和琥珀酸钠作为碳源时，YG8菌体生物量达0.2以上，对氨氮去除率高达到89％以上，TN去除率在65％以上，说明以这三种有机酸为碳源时，菌株YG8的生长情况和脱氮效果较好。以葡萄糖和蔗糖作为碳源时，YG8的氨氮降解率分别为32.75％和28.58％，相比分子量小的乙酸钠，以葡萄糖和蔗糖为碳源时的氨氮去除率较差,说明碳源结构简单且分子量小，更容易被菌体所利用。草酸钠作为碳源时，菌株基本不生长，说明有机碳源草酸钠不适合YG8的生长。碳酸氢钠作为碳源时，YG8基本不生长，氨氮降解率为65％，TN去除率却为0，说明菌株YG8可以利用无机碳源，具有自养硝化的能力，但无机碳不适合菌株的生长和总氮降解。此外，无碳源的培养基相比其他有碳源的培养基，其氨氮去除率最小，TN无降解，说明YG8的生长脱氮需要碳源。综上，以乙酸钠为碳源时，YG8生物量较高，氨氮和TN去除率较高，因此，选择乙酸钠作为异养硝化脱氮的碳源。

(1.2)C/N对异养硝化脱氮性能的影响

以3％接种量将菌悬液分别接入C/N为6、8、10、12、16、20，碳源为乙酸钠、氮源为硫酸铵，初始氨氮浓度为50mg·L^-1，pH为7.5的100mL异养硝化培养基，于30℃，150rpm 摇床中培养，24h后取样，测定氨氮和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

C/N对菌株YG8异养硝化脱氮性能的影响如图10所示：当C/N＝6时，YG8的氨氮降解率可达到71.74％，C/N在6-12范围，随着C/N的增大，菌株YG8的生物量和氨氮去除率增加，当C/N为12时，YG8氨氮去除率达到最大值95.49％，总氮去除率为89.73％；C/N增加到30时，氨氮去除率基本不变，但OD₆₀₀和总氮去除率下降明显，总氮去除率降低至41.74％。这说明足够的碳源量有助于促进菌株YG8的异养硝化脱氮性能，但碳源量大于YG8菌株所需量时，氨氮去除率基本不再受C/N影响，而碳源过高却容易导致菌体生长受抑制，合适的 C/N能够使菌株快速生长同时发挥更好的脱氮能力。因此，选择C/N＝12作为后续实验的C/N。

相比目前报道的异养硝化-好氧反硝化菌的C/N，如Acinetobactercalcoaceticus N7在初始氨氮浓度50mg·L^-1，C/N为35，24h的氨氮和总氮去除率达到最大值分别为88.6％和90.0％。相比之下，菌株YG8生长和异养硝化脱氮的最佳C/N较小，特别适合应用于低C/N污水处理。

(1.3)pH对异养硝化脱氮性能的影响

以3％接种量将菌悬液分别接入pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，碳源为乙酸钠，初始氨氮浓度为50mg·L^-1，C/N为12的100mL异养硝化培养基，于30℃，150rpm摇床中培养，24h后取样，测定氨氮和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

微生物可在一个较宽的pH范围内进行生长，但都有一个最适的pH。环境中的pH与细菌的生长代谢有着密切相关：微生物酶活性会受到pH的影响，pH偏高或过低都会影响酶的稳定性，从而抑制酶活性；其次，pH会改变微生物细胞膜的电位，从而影响微生物对营养物质的吸收；此外，过低的pH会导致核酸和微生物表面蛋白的水解变质，抑制微生物的生长代谢。因此，pH是异养硝化脱氮性能较为重要的影响因素。

pH对YG8异养硝化脱氮性能的影响如图11所示：YG8菌株在pH 6.5～9的范围内都能够很好生长且对氨氮去除率均在90％以上，但总氮去除率随着pH升高而呈下降趋势。当pH 等于6.5时，菌株的氨氮降解率与总氮去除率均为最大，分别达98.23％和83.02％，说明YG8 更适应弱酸性环境。当前实际污水处理生化池的pH一般为6-7，说明了YG8在实际污水处理中具有潜在应用价值。因此，选取pH6.5作为后续实验的培养基初始pH。

(1.4)温度对异养硝化脱氮性能的影响

以3％接种量将菌悬液接入以乙酸钠为碳源、硫酸铵为氮源，初始氨氮浓度为50mg·L^-1， C/N为12，pH6.5的100mL异养硝化培养基，分别在温度为25、30、35和40℃，转速为150 rpm的摇床培养，24h后取样，测定氨氮和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

温度对微生物生存和代谢有着显著影响，温度过低，细菌停止生长；温度偏高，细胞内蛋白质、核酸等被破坏，细胞失活；适宜的温度能够使细菌的生长更快。温度对菌株YG8硝化脱氮性能影响如图12所示：当25℃升高至30℃处氨氮去除率分别为74.34％和75.10％；温度为35℃时，氨氮去除率下降至65.74％；40℃状态下氨氮去除率仅35.54％。温度从25℃升高至40℃过程中，菌株YG8的氨氮去除率降低近40％，这说明YG8不耐受高温，脱氮效率随温度升高而降低，可能是由于起脱氮作用的相关酶活性减弱。因此，选取30℃作为后续实验的培养温度。

(1.5)接种量对异养硝化脱氮性能的影响

分别以3％、5％、7％、10％、15％的接种量将菌悬液接入碳源为乙酸钠，初始氨氮浓度为50mg·L^-1，C/N为12，pH为6.5的100mL异养硝化培养基，于30℃，150rpm摇床中培养，24h后取样，测定氨氮和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

接种量对YG8异养硝化脱氮性能的影响如图13所示：当接种量为3％-10％，培养24h 后菌株YG8的生物量在0.38以上，氨氮和TN去除率均在92％以上和85％以上；接种量为10％下，YG8对氨氮和TN的去除率最大，分别达93.36％和85.53％。而接种量为15％时，OD₆₀₀大幅度增加，氨氮与总氮去除率反而有所下降，此时OD₆₀₀大幅度增大的原因是接种量较大，细菌生物量基数大，而脱氮率下降则是因为一定的营养条件下，接种量过高无法满足微生物生长数量所需的营养物质，导致细菌生长的衰退甚至死亡，而死亡的菌株会发生自溶现象，进而释放胞内有机氮，降低脱氮率。因此，选取10％的接种量作为后续异养硝化脱氮性能影响因素的接种量。与Raoultella sp.sari01以10％的接种量30h氨氮去除率为达99.8％，菌株YG824h氨氮降解率可达93.36％，相较而言，YG8脱除氨氮的反应速率更快。

(1.6)转速对异养硝化脱氮性能的影响

以10％的接种量将菌悬液接入碳源为乙酸钠，初始氨氮浓度为50mg·L^-1，C/N为12，pH 为6.5的100mL异养硝化培养基，分别在转速为0、75、150和180rpm的30℃摇床中培养， 24h后取样测定氨氮和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

溶解氧含量对硝化作用的影响明显，而溶解氧与转速成正相关，因此可以通过改变摇床的转速来调节培养基中的溶解氧。转速对YG8菌株异养硝化脱氮性能的影响如图14：转速从0rpm增加至75rpm，YG8菌体生物量从0.116增加至0.26，氨氮去除率和TN去除率分别从0％和0％增加到55.77％和47.06％，说明静置培养溶氧不足，不利细菌YG8生长；随着转速增加至150rpm时，氨氮去除率增长至99.84％，总氮去除率达到85.42％，说明随着摇床转速的提高至150rpm，培养基中的液体形成涡流，延长空气停留的时间，加大空气接触面积，使培养基的溶解氧提高，满足菌株YG8的生长需求，因此菌株脱氮率高；当转速继续增加至180rpm时，摇床转速偏高，菌株YG8的脱氮率有所降低，原因可能是培养基溶氧过多，同时高速运转下，菌液与三角瓶碰撞剧烈，造成菌体细胞损伤，抑制脱氮过程相关酶的合成能力。综上所述，选择转速150rpm作为后续实验条件。

不同菌株对氨氮脱除率与转速变化的规律不尽相同。如TAD1菌株在转速0-180rpm范围氨氮去除率随转速增大而增大，在转速从180rpm升高210rpm脱氮率反而下降，这与YG8随转速变化，氨氮去除变化规律大致相同。而曾庆梅等选育的异养硝化菌Alcaligenessp.HN-S 在0-250rpm范围，转速越高越有利于其异养硝化脱氮。

(1.7)氨氮浓度对异养硝化脱氮性能的影响

以10％的接种量将菌悬液接入初始氨氮浓度为50、100、150、200、300、400、500和800mg·L^-1，碳源为乙酸钠，调整乙酸钠含量使C/N＝12，pH为6.5的100ml异养硝化培养基，于30℃，150rpm摇床中培养，每隔24h取样，测定氨氮、TN、COD、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮含量以及pH和OD₆₀₀。

氨氮浓度对YG8异养硝化脱氮性能影响如图15所示：培养至第七天时，50～500mg·L^-1氨氮浓度范围，OD₆₀₀随氨氮浓度增加而增大，呈正相关。当氨氮浓度为500mg·L^-1时，OD₆₀₀出现最大值1.17，说明菌株YG8能够在较高氨氮环境下生长；氨氮浓度为800mg·L^-1时，OD₆₀₀降低至0.100，说明800mg·L^-1的氨氮浓度超过了菌株的耐受程度。50-200mg·L^-1氨氮浓度范围，氨氮去除率随氨氮浓度升高而增大；在200mg·L^-1时，氨氮去除率达到最大98.05％；氨氮浓度为300～500mg·L^-1，YG8对氨氮与TN脱除率下降；氨氮浓度500mg·L^-1氨氮去除率为56.02％，TN去除率为18.77％。实验结果表明：氨氮浓度较低的情况下，营养物质提高有利于细菌的生长繁殖；而氨氮质量浓度过高时会对菌株产生抑制，降低了菌株的生长代谢以及有效反应。菌株YG8可以耐受氨氮浓度500-800mg·L^-1左右，说明其在高氨氮废水脱氮上具有潜在应用价值。

菌株Pseudomonasputida LY1在初始氨氮浓度为50mg·L^-1，氨氮去除效率最高为64％，随着氨氮浓度的升高，氨氮降解率逐渐下降；菌株Acinetobacter.sp YN3随着初始氨氮浓度的提高，对氨氮的脱除效果逐渐降低，初始氨氮浓度为150mg·L^-1，24h氨氮去除率仅为18.7％，当初始氨氮浓度提高到200mg·L^-1时，几乎不发生脱氮反应。LY1和YN3与菌株YG8随氨氮浓度升高而氨氮去除率下降的规律相同，但与其相比，YG8对氨氮浓度耐受性与去除效果更好。某些种属好氧反硝化菌株的氨氮耐受范围更大，浓度更高，但氨氮去除率不高，如R aoultella sp.sari01随着氨氮浓度从200升高至2000mg·L^-1，氨氮浓度从99.7％下降至12.3％； Alcaligenes faecalis No.4随氨氮浓度从100升高至1200mg·L^-1，但氨氮去除率从100％下降至 8.33％。

实施例5：

(2)好氧反硝化脱氮性能影响因素

(2.1)C/N对好氧反硝化与亚硝化脱氮性能的影响

以10％的接种量将菌悬液接入以乙酸钠为碳源，初始硝酸盐氮和亚硝酸盐氮浓度均为50 mg·L^-1，pH6.5，C/N分别为4、8、12、16、20、25和30的硝酸盐氮培养基和C/N为4、8、12、16、20的亚硝酸盐氮培养基，于30℃，150rpm摇床中培养，每隔24h取样，测定硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

C/N是影响反硝化效果的重要因素之一。以硝酸钾为唯一氮源，不同C/N对YG8好氧反硝化脱氮性能影响如图16所示：当C/N＝4时，菌株24h内硝酸盐氮去除率达到41.51％，TN去除率为15.13％。这是因为低C/N下碳源不足，缺乏足够的能量，导致菌体生长受限，反硝化酶系合成不完全，而硝酸盐氮的还原是个需要能量的过程；当C/N增大到12时，YG8对硝酸盐氮脱除率达到100％，TN去除率为75％以上；随着C/N的增大，生物量基本呈降低趋势，硝酸盐氮去除率基本不变，TN去除率减小，当C/N＝30时，硝酸盐氮和TN去除率最低，分别为52.53％和49.54％，说明此时碳源量过多，而过多的碳源量对菌体硝酸盐氮的去除有抑制作用。综上所述，C/N＝12为YG8好氧反硝化过程合适的实验条件。

以亚硝酸钠为唯一氮源，不同C/N对YG8好氧亚硝化脱氮性能影响如图17所示：C/N＝4 时，亚硝酸盐氮去除率达22.82％，总氮去除率为0，这说明低C/N碳源不足，缺乏足够的能量，导致菌体生长受限，亚硝化酶系合成不完全，而亚硝酸盐氮的还原是需要能量的过程； C/N＝12时，亚硝酸盐氮脱除率达到84.13％，总氮去除率47.25％；当继续提高C/N，亚硝酸盐氮与TN去除率均下降。说明此时碳源量过多，过多的碳源量对菌体的脱氮效果起抑制作用。综上所述，C/N＝12为好氧亚硝化过程合适的实验条件。说明在低碳氮比条件下，有利于硝酸盐氮去除。

(2.2)硝酸盐氮浓度对好氧反硝化脱氮性能的影响

以10％的接种量将菌悬液接入以乙酸钠为碳源，初始硝酸盐氮浓度分别为50、100、150 和200mg·L^-1，C/N为12，pH6.5的硝酸盐氮培养基，于30℃，150rpm摇床中培养，每隔 24h取样测定硝酸盐氮和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

以硝酸钾为唯一氮源，硝酸盐氮浓度对YG8好氧反硝化脱氮性能影响如图18所示：硝酸盐氮浓度为50mg·L^-1时，YG8对硝酸盐氮去除率最高达97.76％，TN去除率为57.91％；随着硝酸盐氮浓度增加，YG8对硝酸盐氮脱除效果逐渐降低。当硝酸盐氮浓度升高至200mg·L^-1时，硝酸盐氮去除率下降至56.91％，TN去除率为27.63％。菌株YG8在硝酸盐氮浓度为200mg·L^-1时，24h硝酸盐氮脱除速率可达4.74mg·(L·h)^-1，说明YG8对硝酸盐氮浓度去除速率较高。

(2.3)亚硝酸盐氮浓度对好氧反硝化脱氮性能的影响

以10％的接种量将菌悬液接入以乙酸钠为碳源，初始亚硝酸盐氮浓度分别为50、100、 150和200mg·L^-1，C/N为12，pH6.5的亚硝酸盐氮培养基，于30℃，150rpm摇床中培养，每隔24h取样，测定亚硝酸盐氮和TN含量以及pH和OD₆₀₀。

以亚硝酸钠为唯一氮源，亚硝酸盐氮浓度对YG8好氧反硝化脱氮性能影响如图19所示：亚硝酸盐氮浓度为50mg·L^-1时，亚硝酸盐氮的去除率最高为90.43％，TN去除率是53.14％；随着亚硝酸盐氮浓度增加，YG8对亚硝酸盐氮脱除效果逐渐降低，当亚硝酸盐氮浓度升高至 200mg·L^-1时，亚硝酸盐氮去除率只有12.85％，TN去除率为0。

不同种类的菌对亚硝酸盐氮的耐受程度不尽相同，例如：菌株Bacillushwajinpoensis.SLWX₂当亚硝酸盐氮浓度100mg·L^-1时，48h亚硝酸盐去除速率有1.06mg·(h·L) ^-1。Bacillus coagulans YX-6在初始亚硝酸盐氮浓度为20mg·L^-1时，亚硝酸盐氮去除率接近 100％；当初始浓度提高到100mg·L^-1，亚硝酸盐氮的去除速率仅为20％。相比SLWX₂和YX-6，亚硝酸盐氮100mg·L^-1时，24h菌株YG8亚硝酸盐氮去除率可达69.87％，去除速率为2.91 mg·(h·L)^-1，说明YG8对亚硝酸盐氮的去除效率更高。

综上，YG8菌株对氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有很高去除率，综合性能优异，因而本发明可处理复杂含氮废水，具有巨大的应用价值。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，其特征在于，所述含氮废水中含有有机酸钠，所述含氮废水的C/N比值为8～30，所述方法包括以下步骤：

将假单胞菌菌株YG8的种子液接种于含氮废水中，在温度为25℃～35℃，转速为150rpm～180rpm的条件下振荡反应，完成对含氮废水的处理；

所述假单胞菌菌株YG8(Pseudomonas mendocinaYG8)为异养硝化-好氧反硝化菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60340。

2.根据权利要求1所述的利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，其特征在于，所述含氮废水含NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，其特征在于，所述含氮废水为含NH₄ ⁺废水时，所述含NH₄ ⁺废水的C/N比值为12～30，所述NH₄ ⁺的浓度为50mg·L^-1～500mg·L^-1。

4.根据权利要求2所述的利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，其特征在于，所述含氮废水为含NO₃ ^-废水时，所述含NO₃ ^-废水的C/N比值为8～25，所述NO₃ ^-的浓度为50mg·L^-1～200mg·L^-1。

5.根据权利要求2所述的利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，其特征在于，所述含氮废水为含NO₂ ^-废水时，所述含NO₃ ^-废水的C/N比值为8～16，所述NO₂ ^-的浓度为50mg·L^-1～100mg·L^-1。

6.根据权利要求1～5任一项所述的利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，其特征在于，所述有机酸钠为柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，其特征在于，所述假单胞菌菌株YG8的种子液通过以下方法制得：将假单胞菌菌株YG8接种到LB培养基中，在温度为25～35℃、转速为100～180rpm下振荡培养至对数期，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水，得到假单胞菌菌株YG8的种子液。

8.根据权利要求7所述的利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，其特征在于，所述异养硝化-好氧反硝化的副球菌种子液的接种量为3％～15％。

9.根据权利要求8所述的利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，其特征在于，所述LB培养基的成分为：胰蛋白胨10g·L^-1，酵母浸膏5g·L^-1，NaCl 10g·L^-1，pH 7.0。

10.根据权利要求9所述的利用假单胞菌菌株YG8处理含氮废水的方法，其特征在于，加无菌水至菌液OD₆₀₀为0.65～0.8。

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