CN103013872B

CN103013872B - 一种异养硝化好氧反硝化细菌及其培养和应用

Info

Publication number: CN103013872B
Application number: CN201210525461.1A
Authority: CN
Inventors: 刘玉香; 李风雷; 刘文静; 吕永康; 李亚青; 叶俊岭; 宋宇杰
Original assignee: Taiyuan University of Technology
Current assignee: Taiyuan University of Technology
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: CN103013872A

Abstract

本发明涉及一种高效脱氮的异养硝化好氧反硝化细菌，及其培养和应用。该细菌属于不动杆菌属(Acinetobacter)，其命名为Acinetobacter sp.Y1；保藏登记号为CGMCCNO.6563，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2012年9月14日。该细菌从焦化废水的活性污泥中分离得到，不仅可快速将氨氮去除，而且可在亚硝酸盐和硝酸盐为唯一氮源条件下生长，并将亚硝酸盐氮和硝酸盐氮有效去除，可以应用于处理含氮废水。

Description

一种异养硝化好氧反硝化细菌及其培养和应用

技术领域

本发明涉及环境微生物领域，具体涉及一种高效脱氮的异养硝化好氧反硝化细菌，及其培养和应用。

技术背景

传统的生物脱氮是将硝化反应与反硝化反应进行了有机地结合。其中硝化反应是指好氧条件下NH₄ ⁺经NO₂ ^-氧化为NO₃ ^-的过程，该过程于1890年被Winogradsky首次发现。传统的硝化反应由2种微生物共同完成，即氨氧化细菌(AOB)(又称为亚硝化细菌)和亚硝酸氧化细菌(NOB)(又称为硝化细菌)。

氨氧化菌与亚硝酸氧化菌这两类细菌都是好氧菌，不需要有机碳源，属于化能自养菌，一般要求BOD浓度应在20mg/L以下。如果有机物浓度较高，异养型细菌会迅速增殖，使化能自养型的硝化细菌不能优势生长，硝化反应就无法进行。此外，自养的硝化细菌时代时间较长，约为31h左右。氨氧化细菌在氧化氨的过程中获得其生长所需的能量，是整个自养硝化作用的限速步骤。反硝化是把NO₃ ^-或NO₂ ^-转化为N₂O或N₂的还原过程，主要是由兼性厌氧的反硝化菌在缺氧环境条件下来完成的。这类微生物大都是厌氧菌，而且需要有机物作为能源。由于硝化和反硝化这两类微生物的营养需求和生存条件差异比较大，因此传统的硝化和反硝化只能在两个独立的、反应条件截然不同的反应器中进行，或者在同一个反应器中造成交替的好氧和缺氧环境。

传统的生物脱氮工艺对有机物和氮的去除效果均比较好，但是却存在许多难以克服的技术难点：

首先氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌均为化能自养菌，由于时代时间较长，致使反应器启动缓慢，从而增加了污水处理成本；

第二，由于硝化菌和反硝化菌的营养需求和生存条件不同，整个脱氮过程必须在好氧和缺氧两个独立的反应池中进行，这就增加了反应器的体积。或者同一个反应器中在时间上造成交替的好氧和缺氧环境，但是系统的控制也很繁琐；

第三，反硝化菌为异养菌，所以反硝化过程需要较高的有机物浓度，污水中BOD:TN大于2.86时反硝化正常，而低于这个值，反硝化就不能正常进行。而有机物在硝化过程发生之前就已经被好氧降解，所以运行中反硝化段往往又需要补加碳源。反硝化完成后，这部分有机物还有余量，为保证出水有机物达标，需再一次好氧降解，这就延长了脱氮工艺的处理流程。有些工艺利用硝化液回流来解决反硝化过程中的碳源不足问题，但硝化液回流量大、能耗高；

第四，硝化过程中硝化细菌会产酸，酸性条件对硝化反应有抑制作用，所以在硝化过程中需不断加碱，从而提高了处理成本；

第五，抗冲击能力弱，高浓度氨氮和亚硝酸盐等会抑制硝化作用。

近年来，人们对生物脱氮过程中出现的一些现象进行了大量理论和试验研究，提出了一些突破传统理论的新观点和新技术。这些理论从根本上打破了传统理论认为的硝化反应只能在好氧条件下由自养菌完成、反硝化只能在缺氧或厌氧条件下由异养菌完成的观点，其中就包括异养硝化和好氧反硝化。

异养硝化是指在好氧条件下异养微生物将还原态N(包括有机态N)氧化为NO₂ ^-和NO₃ ^-的过程。也有学者把异养硝化定义为在好氧条件下异养微生物将氨/铵态氮或负三价态的有机态氮氧化为羟胺、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的过程。

异养硝化菌不仅种类繁多，而且他们可以利用的基质范围广泛，既可以是无机态氮也可以是有机态氮，如铵、胺、酰胺、肟、N-烷基羟胺、氧肟酸及芳香硝基化合物等。异养硝化菌甚至可以将有机氮直接氧化为硝酸盐氮，而跨过氨化作用和氨氧化作用两步。相对于自养硝化菌而言，虽然异养菌分解效率较低，但是他们生长速率快、细胞产量高，对溶解氧要求低，环境的适应能力也强，在环境中的数量往往远大于自养菌，因此在某些环境中异养硝化作用与自养硝化作用相当，甚至超过自养硝化。此外，目前发现的异养硝化菌大多同时具有好氧反硝化能力。

异养硝化微生物的发现解决了传统生物脱氮处理启动时间长、硝化环节条件要求苛刻、硝化和反硝化不能同步进行等缺点，具有较好的发展前景。

发明内容

本发明的目的是提供一株能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌。该细菌不仅可快速将氨氮去除，而且可在亚硝酸盐或硝酸盐为唯一氮源条件下生长，并将亚硝酸盐氮或硝酸盐中的氮有效去除；

本发明的另一目的是提供一种从焦化废水活性污泥中筛选上述能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌的方法；

本发明的另一目的是提供一种适用于上述能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌的培养条件，使得该菌能表现出更好的异养脱除氨氮的能力，更好的去除亚硝酸盐氮的能力以及更好的去除硝酸盐氮的能力；

本发明的另一目的是提供上述能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌在水中脱氮的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一株能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌，属于不动杆菌属(Acinetobacter)，其命名为Acinetobacter sp.Y1；保藏登记号为CGMCC NO.6563，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2012年9月14日。

上述细菌是从焦化废水的活性污泥中分离得到的，其分离方法如下：

步骤一、采集样品及富集培养

从煤气化公司焦化废水处理厂的第一曝气池中采集活性污泥；取20mL活性污泥接种于装有180mL牛肉膏蛋白胨培养基的500mL三角瓶中，在120rpm、30℃下摇床富集培养1周；

步骤二、分离纯化

用生理盐水将经富集后的培养液按照体积比依次稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9和10^-10的菌悬液，取0.1mL稀释好的菌悬液涂布于异养氨化培养基的平板上，在30℃下恒温培养；随后挑选长出100个单菌落的平板，将各单菌落接种于异养氨化液体培养基中，在120rpm、30℃条件下培养；培养期间每天用纳氏试剂、格里斯试剂及二苯胺检测NH₄ ⁺-N剩余量、NO₂ ^--N及NO₃ ^--N的积累量进行硝化活性确认，同时作空白对照；对有效降解NH₄ ⁺-N的培养液再次进行梯度稀释、平板分离，最后纯化得到本发明的菌株Acinetobacter sp.Y1；采用异养硝化培养基对该菌株进行菌种保藏；

所述的牛肉膏蛋白胨培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH 7.0，蒸馏水1000mL；

所述的异养氨化培养基为：NH₄Cl 0.382g，结晶乙酸钠2g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄0.22g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO₄0.01g，H₂O 1000mL，pH 7.0；

所述的异养硝化培养基为：(NH₄)₂SO₄0.47g，柠檬酸钠4.9g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO40.01g，H₂O 1000mL，pH 7.0。

在上述培养基制作平板或斜面等固体培养基时，在其液体培养基中添加1.5-2％的琼脂。

菌株鉴定：

(1)本发明菌株Acinetobacter sp.Y1的形态特征：

选用上述异养硝化培养基制作平板，用梯度稀释法对细菌的培养液进行稀释，涂布平板后恒温培养，观察其菌落特征：在异养硝化培养基平板上Acinetobacter sp.Y1形成乳白色的菌落，直径较大，约3-4mm，圆形，扁平，表面光滑。对Acinetobacter sp.Y1的菌体进行革兰氏染色，结果为阴性，菌体接近球形。

(2)16S rDNA的PCR扩增和测序

从新鲜异养硝化培养基平板中挑取菌体于50μL TaKaRa Lysis Buffer forMicroorganism to Direct PCR(Code No.D304)中变性后离心取上清液作为模板，反应条件为：80℃，15min。

使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)进行PCR扩增目的片段。PCR反应体系(50μL)为：上述1的变性反应液1μL，PCR Premix25μL，Forward primer(20pmol/μL0.5μL，Reverse primer2(20pmol/μL)0.5μL，16S-free H₂O 23μL。

反应条件如表1所示。

取5μL进行3％琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(Code No.DV805A)和MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(CodeNo.D823A)切胶回收目的片段，DNA测序委托宝生物工程(大连)有限公司完成。

表1 PCR扩增条件

Table1 Conditions of PCR amplification

将测序后得到的16S rDNA序列提交到Genbank数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，基因登录号为JX867369。经NCBI Blast检索，本发明中的菌株与Acinetobacter sp.YC-X2(HM629335.1)的相似性可达99％，所以初步确定Y1属于不动杆菌属(Acinetobacter)，并将其命名为Acinetobacter sp.Y1。

本发明菌株Acinetobacter sp.Y1脱氮活性

Acinetobacter sp.Y1不仅可以异养条件下有效脱除氨氮，而且可以通过好氧反硝化去除亚硝酸盐氮和硝酸盐氮。

进一步地，本发明涉及菌株Acinetobacter sp.Y1的培养方法，其特征在于：将异养硝化培养基斜面上保存的Acinetobacter sp.Y1接种于异养硝化培养液中，80～150rpm、30～37℃条件下恒温振荡培养；

所述异养硝化培养液为：碳源柠檬酸钠2.5～20.0g，氮源(NH₄)₂SO₄0.47～3.8g，其余成分为MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO40.01g，H₂O 1000mL，pH 6.0～9.0；

优选地，所述异养硝化培养液为：(NH₄)₂SO₄0.47g，柠檬酸钠4.9g，MgSO₄·7H₂O0.05g，K₂HPO₄0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO40.01g，H₂O 1000mL，pH 7.0；

以柠檬酸钠为碳源，以硫酸铵为氮源，Acinetobacter sp.Y1在不同的C/N比条件下都可以有效地去除氨氮。在脱氮过程中没有检测到明显的亚硝酸盐氮和硝酸盐氮积累。

所述异养硝化培养液还可以以乙酸钠为碳源，以硫酸铵为氮源，Acinetobactersp.Y1在不同的C/N比条件下都可以有效地去除氨氮。在脱氮过程中没有检测到明显的亚硝酸盐氮和硝酸盐氮积累。培养基成分中包含有碳源乙酸钠3.4～13.6g，氮源(NH₄)₂SO₄0.47～3.8g，其余成分为MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO40.01g，H₂O 1000mL，pH 6.0～9.0

本发明菌株还可以在有机碳源条件下进行以NaNO₂、NaNO₃为底物的好氧反硝化。

以柠檬酸钠为碳源，以亚硝酸钠为氮源时，菌株Acinetobacter sp.Y1可以进行好氧反硝化。培养基成分中包含有碳源柠檬酸钠2.5～9.8g，氮源NaNO₂0.25～1.0g，其余成分为MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO40.01g，H₂O 1000mL，pH 7.0～8.0。

以柠檬酸钠为碳源，以硝酸钠为氮源时，本发明菌株可以进行好氧反硝化。培养基成分中包含有碳源柠檬酸钠2.5～9.8g，氮源NaNO₃0.3～1.3g，其余成分为MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO40.01g，H₂O 1000mL，pH 7.0～8.0。本发明中的菌株Acinetobacter sp.Y1在含氮素污染的水体中(氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮)，具有脱除各种氮素的活性，并且在较高的C/N比及较高的氨氮浓度条件下，都具有较高的脱氮活性。而且，本发明菌株的脱氮性能对pH值的变化和溶解氧的变化不敏感。因此，本发明菌株不仅可用于多种含氮废水的处理，而且对环境变化的适应性非常强。

在上述培养基制作平板或斜面等固体培养基时，在其培养液中添加1.5-2％的琼脂即可。

进一步地，本发明涉及菌株Acinetobacter sp.Y1处理含氮废水的用途。

7.Acinetobacter sp.Y1的使用方法

(1)菌株活化：从保存有Acinetobacter sp.Y1的异养硝化培养基斜面上刮取菌苔，接种于装有100mL异养硝化液体培养基的250mL锥形瓶中，80～150rpm、30～37℃条件下恒温振荡培养14～18h即可完成菌株活化。

(2)将活化后的菌液以1～5％的比例接种于待处理的模拟含氮废水或实际废水中，80～150rpm、30～37℃条件下恒温振荡培养。

(3)进一步地，本申请涉及菌株Acinetobacter sp.Y1处理焦化废水的用途。

本发明的优点：

(1)本发明菌株可以在异养条件下脱氮，在脱氮过程中没有亚硝酸盐和硝酸盐积累。而且脱氮效率较高。

(2)本发明菌株可以在好氧条件下反硝化。可以在以亚硝酸盐和硝酸盐为唯一氮源的条件下生长并脱氮。

(3)本发明菌株适用于高浓度有机含氮废水的处理。

(4)本发明菌株对溶解氧、pH值和温度的适应范围较宽。

(5)本发明菌株可适用于焦化废水的处理。

附图说明：

图1：本发明菌株Acinetobacter sp.Y1的革兰氏染色结果；

图2：本发明菌株Acinetobacter sp.Y1的电镜照片

图3：本发明菌株Acinetobacter sp.Y1的异养脱氮性能图；

图4：本发明菌株Acinetobacter sp.Y1在亚硝酸盐培养基中的脱氮情况；

图5：本发明菌株Acinetobacter sp.Y1在硝酸盐培养基中的脱氮情况。

具体实施方式

实施例1：本发明菌株的培养

(1)配制异养硝化培养基，分装至250mL锥形瓶，每瓶分装量为100mL，121℃灭菌20min；所述异养硝化培养基为(NH₄)₂SO₄0.47g，柠檬酸钠4.9g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO40.01g，H₂O 1000mL，pH 7.0；

(2)将保藏于异养硝化培养基斜面上的Acinetobacter sp.Y1接种到新鲜的异养硝化培养基中，30℃、120rpm条件下震荡培养，活化培养18h备用。

(3)将活化后的菌种按1％的接种量接种于异养硝化培养基中，30℃，120rpm条件下恒温震荡培养。

实施例2：本发明菌株的异养脱氮性能

异养硝化培养基：(NH₄)₂SO₄0.47g，柠檬酸钠4.9g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO40.01g，H₂O 1000mL，pH 7.0。

使用异养硝化培养基，1％的比例接种活化后的菌悬液(方法见实施例1)，30℃、120rpm条件下震荡培养，定时取样检测氨氮、羟胺氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和总氮。结果见图2。从图中可以看出氨氮和总氮很快被消耗，在初始氨氮浓度为108.78mg/L的异养硝化培养基中，本发明菌株经20h的培养，就可将氨氮去除98.6％，总氮去除率达91％。而且在整个脱氮过程中几乎没有各种硝化产物的积累，说明该菌株在异养硝化的同时具有很强的好氧反硝化能力，硝化与反硝化处于平衡状态，所以几乎没有硝化产物的积累。

实施例3：本发明菌株的好氧反硝化性能

亚硝酸盐培养基：NaNO₂0.49g，柠檬酸钠6.86g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO₄0.01g，H₂O 1000mL，pH 7.0，。

硝酸盐培养基：NaNO₃0.61g，柠檬酸钠6.86g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，FeSO₄0.01g，H₂O 1000mL，pH 7.0，。

使用亚硝酸盐培养基和硝酸盐培养基，在初始氮浓度100mg/L，C/N比20的条件下，1％的比例接种活化后的菌悬液(方法见实施例1)，30℃、120rpm条件下震荡培养，定时取样检测吸光值、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮。结果见图3和图4。

由图中数据可知菌株Y1在两种培养基中培养都可以有效脱氮，在亚硝酸盐培养基中培养24h亚硝氮被完全去除；硝酸盐氮的去除速率较慢，需经过36h才能将硝氮全部去除。

实施例4：本发明菌株在焦化废水脱氮中的应用

取焦化废水厂隔油池出水，布氏漏斗初过滤后，用砂芯过滤装置过滤得无菌焦化废水。将无菌焦化废水和异养硝化培养基按1∶9，2∶8，3∶7……10∶0的比例在无菌操作台混合均匀，分别取100mL置于250mL锥形瓶中。1％比例接种菌株Acinetobactersp.Y1并置于30℃、120rpm条件下振荡培养。24h后焦化废水量低于60％(含60％)时，氨氮的去除率大于92％；70％和80％的焦化废水存在条件下，48h后氨氮去除率大于92％；90％和100％的焦化废水存在条件下，72h后氨氮去除率大于90％。

本发明的一种异养硝化好氧反硝化细菌及其培养和应用已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种能够脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌，属于不动杆菌属（Acinetobacter），其命名为Acinetobacter sp.Y1；保藏登记号为CGMCC NO.6563，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2012年9月14日。

2.一种权利要求1所述细菌的培养方法，其特征在于，将异养硝化培养基斜面上保存的Acinetobacter sp.Y1接种于异养硝化培养液中，80～150rpm、30～37℃条件下恒温振荡培养；所述的异养硝化培养液为：碳源柠檬酸钠2.5～20.0g,氮源(NH₄)₂SO₄0.47～3.8g，其余成分为MgSO₄·7H₂O0.05g,K₂HPO₄0.2g,NaCl0.12g,MnSO₄·4H₂O0.01g,FeSO₄0.01g,H₂O1000mL,pH6.0～9.0。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的异养硝化培养液为：(NH₄)₂SO₄0.47g，柠檬酸钠4.9g,MgSO₄·7H₂O0.05g,K₂HPO₄0.2g,NaCl0.12g,MnSO₄·4H₂O0.01g,FeSO₄0.01g,H₂O1000mL,pH7.0。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，以乙酸钠代替柠檬酸钠作为异养硝化培养液的碳源，所述异养硝化培养液为碳源乙酸钠3.4～13.6g,氮源(NH₄)₂SO₄0.47～3.8g，其余成分为MgSO₄·7H₂O0.05g,K₂HPO₄0.2g,NaCl0.12g,MnSO₄·4H₂O0.01g,FeSO₄0.01g,H₂O1000mL,pH6.0～9.0。

5.一种权利要求1所述细菌的培养方法，其特征在于，将Acinetobacter sp.Y1以柠檬酸钠为碳源，以亚硝酸钠为氮源进行好氧反硝化培养，所用异养硝化培养液为：柠檬酸钠2.5～9.8g,NaNO₂0.25～1.0g，其余成分为MgSO₄·7H₂O0.05g,K₂HPO₄0.2g,NaCl0.12g,MnSO₄·4H₂O0.01g,FeSO₄0.01g,H₂O1000mL,pH7.0～8.0。

6.一种权利要求1所述细菌的培养方法，其特征在于，将Acinetobacter sp.Y1以柠檬酸钠为碳源，以硝酸钠为氮源进行好氧反硝化培养，所用异养硝化培养液为：柠檬酸钠2.5～9.8g,NaNO₃0.3～1.3g，其余成分为MgSO₄·7H₂O0.05g,K₂HPO₄0.2g,NaCl0.12g,MnSO₄·4H₂O0.01g,FeSO₄0.01g,H₂O1000mL,pH7.0～8.0。

7.权利要求1的细菌处理含氮废水的用途。