CN102329753A

CN102329753A - 海洋异养脱氮细菌的混养富集筛选方法

Info

Publication number: CN102329753A
Application number: CN201110288612A
Authority: CN
Inventors: 王光玉; 陈雷; 孙洋洋; 佟贺; 曹竞
Original assignee: Harbin Institute of Technology Weihai
Current assignee: Harbin Institute of Technology; Harbin Institute of Technology Weihai
Priority date: 2011-09-27
Filing date: 2011-09-27
Publication date: 2012-01-25

Abstract

本发明公开了一种混养富集海洋异养脱氮细菌的方法。本发明通过前期自养方式后期异养的方式富集海洋脱氮细菌，保证具有异养硝化能力、异养硝化好氧反硝化能力的细菌繁殖，首先通过选择性培养基分离，其次检测分离菌株的氨单加氧酶基因和亚硝酸盐氧还酶基因，最后在异养培养基中通过氮平衡试验确定具有目的基因的菌株是否表达。通过自养和异养的交替驯化富集，分离获得并最终确定筛选菌株为异养硝化菌株或异养硝化好氧反硝化菌株。混养富集异养硝化好氧反硝化细菌不单单是细菌富集理论的突破，其菌株经过生物强化方法的固定对海洋循环养殖废水的生物脱氮具有较大的实际应用意义，适用于工厂化高密度养殖的硝化单元的废水处理中。

Description

海洋异养脱氮细菌的混养富集筛选方法

技术领域：

本发明属于海洋养殖废水处理技术领域，尤其是涉及工厂化高密度养殖废水的生物脱氮的方法。

背景技术：

海洋水产养殖业是缓解人类对食物的需求压力，避免对海洋生物资源过度捕捞的重要手段。中国的水产养殖业已经进入持续高速发展阶段，养殖方式高度集约化使养殖业自身污染问题逐渐显露且日渐突出，造成养殖环境恶化，病害流行，而为了控制疾病盲目使用抗生素给整个水产养殖业造成了巨大的经济损失。循环水高密度工厂化养殖占用的资源少，全年都可以生产商品化的水产品，对环境友好，是水产养殖业发展的方向。高密度工厂化养殖主要对养殖水环境有较高的要求，必须快速的去除残饵、粪便等有机物，同时将快速产生的氨氮、亚硝态氮保持在较低的水平。

目前养殖废水脱氮的方法很多，其中生物脱氮技术具有投资和运转费用较低，且无二次污染等优点，是较为经济有效的方法。生物脱氮主要通过三种方式来完成，一是利用绿色植物的光合作用同化养殖废水中的含氮化合物，实现养殖水的循环和处理，其最大的缺点是效率低，占地面积大。二是利用自养的硝化菌和厌氧的反硝化菌将氨氮转化成亚硝态氮、硝态氮，最后转化为氮气完成生物脱氮的全过程，该方法是目前高密度工厂化养殖废水处理的主要方法，其不利之处在于完成硝化作用的自养细菌属于化能自养细菌，比生长速率较低、养殖水体酸化、在没有反硝化单元的处理系统中往往造成硝态氮的积累，对养殖的生物和环境产生不利的影响，同时反硝化要求厌氧的环境，养殖水体是富氧的环境，在实际运行中难度较大。生物脱氮的第三种方法是异养硝化，直接利用细菌的同化作用转化、吸收水体中的含氮物质，工艺简单、转化的效率高，但是异养硝化细菌的分离筛选困难，硝化过程产生的生物量大。CN03118598.3叙述了在土壤中分离异养硝化细菌的方法，中国专利申请200510030456.3和200610010263.6中也阐述了异养硝化细菌的筛选方法，三种方法的不利之处在于直接从自然环境中分离筛选，微生物种类多，工作量较大。利用异养硝化细菌进行养殖废水脱氮的最大好处是在处理系统中没有亚硝态氮和硝态氮的积累，同时去除有机物，是较有应用前景的生物脱氮方式。

影响海洋异养脱氮细菌生长和发挥作用的因素主要包括pH、碱度、温度、DO、氨氮、盐度、硝化细菌的数量和存在方式，在混养富集和分离的各个阶段要创造哈应异养脱氮细菌的良好条件。

发明内容：

本发明的目的获得异养硝化细菌和异养硝化好氧反硝化细菌，其最终目的是转化工厂化养殖废水中的无机氮化合物，从而实现养殖废水的循环，既减少环境对养殖生物的危害，又减少养殖废水排放对环境的危害。本发明采用自养阶段逐步提高氨氮浓度的方法富集、驯化海洋异养脱氮细菌，异养阶段增加海洋异养脱氮细菌的数量，并通过分子生物学的方法筛选具有脱氮基因的菌株，最后用氮平衡试验最终验证菌株的氮代谢特性。该方法可以建立异养脱氮细菌为主体得微生物菌群，从而有利于异养脱氮生物反应器的建立。该方法不但对海洋养殖废水进行生物脱氮，并且对COD也有一定的去除效果。本发明的方法是通过以下步骤实现的：

1、海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，其特征在于其按如下步骤进行：

(一)、海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化阶段：海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化在一定体积的容器内进行，向容器内加入一定体积海洋养殖废水，控制水体的溶解氧在3mg/L以上，用Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-8.5之间，调节盐度在2.5％-3.5％，控制水体温度在28±1℃，每天流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度在0.2-20mg/L。经过30-50天的富集驯化，氨氮的添加浓度达到8-20mg/L左右，自养富集驯化阶段结束。

(二)、海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化阶段：海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化在一定的体积的容器内自养富集驯化结束后进行，控制水体的溶解氧在3mg/L以上，用Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-8.5之间，调节盐度在2.5％-3.5％，控制水体温度在28±1℃，每天继续流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度保持在8-20mg/L，每天添加一定量鱼饵的浸出液，使异养阶段的COD_Mn在10-400mg/L。异养养富集驯化持续5-20天结束。

(三)、海洋异养细菌的分离：海洋异养细菌的分离采用海水配制的固体有机培养基，将混养富集驯化液经系列稀释涂布于固体有机培养基上，23-30℃培养2-5天，对培养基上生长的菌落特征不同的菌落进行划线纯化后获得纯菌株转斜面保存。

(四)海洋异养脱氮细菌的基因检测：利用特异性引物对氨单加氧酶(AMO)基因(amoA)和周质硝酸盐还原酶(NAR)亚基基因(napA)进行DNA扩增，电泳分离扩增产物，快速筛选具有潜在氨氧化能力和能进行硝酸盐还原的菌株。

(五)海洋异养脱氮菌株的氮平衡分析：在自养型培养基中接种具有amoA或napA基因的菌株，在28±1℃，150-200rmp转速下培养细菌24-48小时，检测培养前后的氨氮、亚硝态氮、硝态氮和有机氮，经过氮素的定量计算，和不加菌的对照相比，确定异养脱氮菌株的氮代谢特性，获得异养硝化细菌或异养硝化好氧反硝化菌株。

下面结合实施例对本发明做进一步描述：

实施例1：

(一)、海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化：海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化在一定体积的容器内进行，向容器内加入一定体积海洋养殖废水，控制水体的溶解氧在3mg/L以上，用Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-9.0之间，调节盐度在2.5％-3.0％，控制水体温度在25±2℃，每天流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度在0.2-15mg/L。经过30天的富集驯化，氨氮的添加浓度达到10mg/L左右，自养富集驯化阶段结束。

(二)、海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化阶段：海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化在一定的体积的容器内自养富集驯化结束后进行，控制水体的溶解氧在3mg/L以上，用Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-9.0之间，调节盐度在2.5％-3.0％，控制水体温度在25±2℃，每天继续流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度保持在18mg/L，每天添加一定量鱼饵的浸出液，使异养阶段的COD_Mn在400mg/左右。异养养富集驯化持续5天结束。

(三)、海洋异养细菌的分离：海洋异养细菌的分离采用海水配制的固体有机培养基，将混养富集驯化液经系列稀释涂布于固体有机培养基上，8℃培养2天，对培养基上生长的菌落特征不同的菌落进行划线纯化后获得纯菌株转斜面保存。

最后共分离获得13株异养细菌，其中3株细菌异养细菌不含有amoA或napA基因，5株细菌同时具有amoA和napA基因，并表现出异养硝化化能力和异养硝化好氧分硝化能力，4株细菌只具有amoA基因，并表现出异养硝化能力，1株细菌只具有napA基因，表现出好氧反硝化能力。

实施例2：

(一)、海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化：海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化在一定体积的容器内进行，向容器内加入一定体积海洋养殖废水，控制水体的溶解氧在4mg/L以上，用Na₂CO₃溶液调节pH在7.0-8.5之间，调节盐度在2.0％-3.5％，控制水体温度在28±2℃，每天流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度在0.5-20mg/L。经过50天的富集驯化，氨氮的添加浓度达到20mg/L左右，自养富集驯化阶段结束。

(二)、海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化阶段：海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化在一定的体积的容器内自养富集驯化结束后进行，控制水体的溶解氧在4mg/L以上，用Na₂CO₃溶液调节pH在7.0-8.5之间，调节盐度在2.0％-3.5％，控制水体温度在28±2℃，每天继续流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度保持在18-20mg/L，每天添加一定量鱼饵的浸出液，使异养阶段的COD_Mn在200mg/L。异养养富集驯化持续20天结束。

(三)、海洋异养细菌的分离：海洋异养细菌的分离采用海水配制的固体有机培养基，将混养富集驯化液经系列稀释涂布于固体有机培养基上，25-30℃培养5天，对培养基上生长的菌落特征不同的菌落进行划线纯化后获得纯菌株转斜面保存。

最后共分离获得17株异养细菌，其中5株细菌异养细菌不含有amoA或napA基因，4株细菌同时具有amoA和napA基因，并表现出异养硝化化能力和异养硝化好氧分硝化能力，7株细菌只具有amoA基因，并表现出异养硝化能力，1株细菌只具有napA基因，表现出好氧反硝化能力。

Claims

1.海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，其特征在于其按如下步骤进行：

2.根据权利要求1所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，自养富集驯化其特征在于所说的海洋异养脱氮细菌的富集驯化方法为：在一定体积的容器内加入养殖废水，循环水曝气保证溶解氧在3mg/L以上，用1M的Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-8.5之间，用淡水调节盐度在1.020左右，控制水体温度在28±1℃，每天氨氮，使富集驯化液氨氮浓度在0.2-20mg/L的氯化铵溶液来进行自养富集驯化，将氨氮浓度调整到较低的浓度，但不低于0.2mg/L，在自养富集驯化结束时，每天添加的氨氮使富集驯化液不超过20mg/L。经过30-50d以上的驯化，自养富集驯化阶段结束。

3.根据权利要求1所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，异养富集驯化的特征在于自养富集结束后进行异养富集驯化，循环水曝气保证溶解氧在3mg/L以上，用1M的Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-8.5之间，用淡水调节盐度在1.020左右，控制水体温度在28±1℃，保持自养富集驯化结束时的氨氮浓度8-20mg/L，同时添加高蛋白的有机液体，使富集驯化液的COD_Mn在10-400mg/L，并保持5天以上，但不超过20天。

4.根据权利要求1或2所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，自养富集驯化的特征在于(1)首次添加氨氮的浓度在0.2-2mg/L之间；(2)提高氨氮浓度的时机在于氨氮浓度开始降低；(3)自养富集驯化持续的时间在30-50天。

5.根据权利要求1或3所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，异养富集驯化的特征在于(1)保持自养富集驯化结束时的流加氨氮浓度在8-10mg/L；(2)添加高蛋白的有机液体，使富集驯化液COD_Mn在10-400g/L；(3)异养富集驯化持续的时间在5-20天。

6.根据权利要求1所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，异养细菌的培养基为(NH₄)₂SO₄0.1g；MgSO₄·7H₂O 0.03g；NaH₂PO₄0.25g；K₂HPO₄0.75g；Na₂CO₃0.5g；MnSO₄·4H₂O 0.01g；葡萄糖0.1克，蛋白胨0.1克，陈海水1000mL；pH 7.5-8.5，琼脂粉16克，121℃灭菌20min。

7.根据权利要求1所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，其特征在于利用氨单加氧酶(AMO)基因(amoA)和周质硝酸盐还原酶(NAR)亚基基因(napA)进行DNA扩增目的基因片段，淘汰不具有两种基因的异养细菌。

8.根据权利要求1所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，其特征在于利用异养型培养基进行氮平衡试验分析菌株的氮代谢特性，选择具有amoA或napA基因且能够表达的菌株。通过氮素的定量计算，筛选到异养脱氮菌株(异养硝化菌株和异养硝化好氧分硝化菌株)。